转化生长因子βII型受体在胃癌中表达的研究
张朋彬，中国人民解放军第三军医大学新桥医院消化内科 重庆市 400037
徐采朴，中国人民解放军第三军医大学西南医院消化内科 重庆市 400038
项目负责人 张朋彬，400037，中国人民解放军第三军医大学新桥医院消化内科. zpb666@sina.com.cn
电话：023-68755760
收稿日期 2001-12-19 接受日期 2002-01-04
摘要
目的:观察转化生长因子(TGFβ)II型受体基因Poly(A)10片段在胃癌组织中的突变情况.
, http://www.100md.com
方法:利用PCR/SSCP方法，对10例正常胃组织，21例肠化生组织，10例不典型增生，及62例胃癌组织中TGFβII型受体基因Poly(A)10片段的突变情况进行了研究.
结果:在62例胃癌组织中，有4例TGFβII型受体基因Poly(A)10片段发生了突变，在正常胃黏膜组织、肠化生组织及不典型增生组织中，未见该片段异常.
结论:胃癌组织中TGFβII型受体基因的突变对胃癌发生发展起了重要作用.
张朋彬,徐采朴. 转化生长因子βII型受体在胃癌中表达的研究.世界华人消化杂志 2002;10(4):474-475
0 引言
, 百拇医药
转化生长因子β(transforming growth factorβ,TGFβ)是一多功能的细胞生长因子，对细胞的生长分化有着重要的调节作用[1,2].他能抑制大多数细胞的生长，并可抑制肿瘤细胞的生长，引起一些肿瘤细胞发生凋亡.我们通过PCR/SSCP方法对TGFβII型受体基因Poly(A)10片段在胃癌组织中的表达情况进行了研究.
1 材料和方法
1.1 材料 共收集我院胃部手术标本胃镜活检103例(包括新鲜冷冻标本及石蜡包埋标本)，其中正常胃黏膜组织10例，肠化生组织21例，不典型增生组织10例，胃癌组织62例(高分化腺癌22例，低分化腺癌30例，印戒细胞癌7例，黏液腺癌3例).患者平均年龄51.1岁(27～74岁)，男59例，女34例. 冷冻标本及石蜡包埋标本DNA提取参照相关文献[3]进行.
, 百拇医药
1.2 方法 PCR扩增参照相关文献[4]进行.采用引物为：P1:5，-AGATGCTGCTTCTCCAAAGTGC-3，P2:5，-TTGCACTCATCAGAGCTAC AGG-3. PCR反应总体积100μl.反应条件如下：首轮循环，94℃ 5min，55～60℃ 1min，72℃ 1min；后续循环，94℃ 1min，55～60℃ 1min，72℃ 1min；末轮循环：94℃ 1min，55～60℃ 1min，72℃ 10min.
1.3 PCR/SSCP分析 参照相关文献[5，6]进行，采用银染法.取扩增产物5μl，混入上样缓冲液10μl，混匀后95℃变性，取出后置于冰水中，然后在8～15%的中性聚丙烯酰胺中电泳，电泳结束后取出凝胶置于染色盒中显影，显影完全后，置10%冰醋酸终止反应并固定，蒸馏水漂洗后进行观察，出现异常单链者为阳性.
, 百拇医药
2 结果
我们应用PCR/SSCP方法分析了62例胃癌组织中TGFβII型受体基因Poly(A)10片段的变化情况，发现共有4例发生突变，其中2例为高分化腺癌，两例为低分化腺癌，总突变率为6.5%(图1).
图1 TGFβII型受体基因Poly(A)10片段在胃癌组织中的表达. Ca:胃癌组织，可见有一异常条带(箭头所指)；D：不典型增生组织；I：肠化生组织；N：正常胃黏膜组织.
在10例正常胃黏膜组织及21例肠化生和10例不典型增生中，未见TGFβII型受体基因Poly(A)10片段的突变.
, 百拇医药 3 讨论
TGFβ是一具有多功能的细胞生长因子，对细胞的生长、分化有着重要的调节作用.他对大多数细胞的生长具有抑制作用，如上皮细胞和血液细胞等.他能抑制正常胃黏膜细胞和胃癌细胞的生长，并可诱导胃癌细胞发生凋亡[7-10].尽管TGF β对肿瘤的生长具有抑制作用，但一些癌细胞通过某些机制逃脱了其抑制.目前研究发现，这是由于癌细胞膜上TGFβ受体和细胞内信使的表达出现了异常[11-14]，使这些细胞失去了对TGFβ的反应. 对于胃癌细胞，TGFβ1只能诱导同时表达I型和II型受体的胃癌细胞发生凋亡，而二者缺一或均缺乏的胃癌细胞不被TGFβ1诱发凋亡[15].目前研究发现，TGFβ II型受体的异常表达多是由于其基因709～718区的多聚腺苷酸Poly(A)10中的腺苷酸的插入或缺失所造成.该区域腺苷酸的插入或缺失，造成II型受体基因发生框架移动，产生异常的II型受体或使其转录中断[16].产生这种现象的原因与微卫星不稳定性(microsatellite instability,MI)有关.微卫星是指基因组中散在的较短的重复序列，他在DNA复制时容易产生错配现象，即易发生碱基的插入或缺失，这种错配可由体内的错配修复系统(mismatch repair,MMR)来纠正[17].目前人类已定位了四个MMR基因，分别是hMSH2,hMLH1,hPMS1和 hPMS2，他们能特异性地结合到错配的核苷酸处，启动修复工作.当该系统有缺陷，不能纠正DNA的复制错误时，便出现MI，使相关基因自发突变率升高[18].
, 百拇医药
MI在胃癌发生率约15-39%[19,20].Myeroff研究发现TGFβ II型受体Poly(A)10片段在胃癌的突变率为20.7%[21].Kim et al[22]研究发现，在胃癌与胃腺瘤组织中，MI的发生率在前者明显高于后者，而且随着胃癌的发展，包括TGFβ II型受体在内的MI相关指标的突变率也渐升高.
我们对62例胃癌组织的TGFβ II型受体Poly(A)10片段进行分析，发现仅有4例发生突变，突变发生率为6.5%.在这4例中，两例发生于高中分化腺癌(2/22)，两例为低分化腺癌(2/30).明显低于文献报道在其他肿瘤中的突变率.
MI不但存在于胃癌组织，在胃癌前病变中也存在[23].从理论上讲，TGFβ II型受体Poly(A)10片段在胃癌前病变中也可能存在突变.因此我们对肠化生和不典型增生组织也进行了Poly(A)10片段的检测，在21例肠化生组织及10例不典型增生组织中，未发现该片段的异常，提示Poly(A)10片段的改变在胃癌的发生发展过程中可能是一个晚期事件.当然也不能排除他在胃癌中的低突变率.
, 百拇医药
TGFβ II型受体的突变，使肿瘤细胞逃脱TGFβ的生长抑制作用，对胃癌的发生发展起了一定的促进作用.
4 参考文献
1 Massague J. The transforming growth factor-β family. Annu Rev Cell Biol 1990;6:597-641
2 陈修煦,来茂德.转化生长子TGF-β研究进展.世界华人消化杂志 2000;8:1405-1140
3 Shibata D. Extraction of DNA from paraffin-embedded tissue for analysis by polymerasee chain reaction:new tricks from an old
, 百拇医药
friednd. Human Pathol 1994;25:561-563
4 Akiyama Y,Iwanaga R,Saitoh K,Shiba R,Ushino K,Ikeda E, Iwama T, Nomizu T,Yuasa Y. Transforming growth factorβtype II
receptor gene mutations in adenomas from hereditary nonpolyposis colorectal cancer. Gastroenterology 1997;112:33-39
5 崔建涛,吕有勇. 改良PCR/SSCP和PCR直接测序在基因突变检测中的应用. 新消化病学杂志 1997；5：593-594
6 Oto M, Miyake S, Yuasa Y. Optimezation of nonradioisotopic single strand conformation polymorphism analysis with a
, http://www.100md.com
conventional minislab gelelectrophoresis apparatus. Analytical Biochem 1993;213:19-22
7 张朋彬,徐采朴.转化生长因子β与胃癌. 华人消化杂志 1998;6:630-631
8 Ohta S, Yanagihara K, Nagata K. Mechanism of apoptotic cell death of human gastric carcinoma cells mediated by transforming
growth factor beta. Biochem J 1997;324:777-782
9 Kang SH, Bang YJ, Jong HS, Seo JY, Kim NK， Kim SJ. Rapid induction of p21WAF1 but delayed down-regulation of Cdc25A in
, http://www.100md.com
the TGF-beta-induced cell cycle arrest of gastric carcinoma cells. Br J Cancer 1999;80:1144-1149
10 Yoo YD, Choi JY, Lee SJ, Kim JS, Min BR, Lee YI, Kang YK. TGF-beta-induced cell-cycle arrest through the p21(WAF1/CIP1)-
G1 cyclin/Cdks-p130 pathway in gastric-carcinoma cells. Int J Cancer 1999;83:512-517
11 Kim IY,Ahn HJ,Zelner DJ,Shaw JW,Sensibar JA, Kim JH, Kato M, Lee C. Genetic change in transforming growth factor
, 百拇医药
beta (TGF-beta) receptor type I gene correlates with insensitivity to TGF-beta 1 in human prostate cancer cells.
Cancer Res 1996;56:44-48
12 Wang J,Han W,Zborowska E,Liang J,Wang X, Willson JK, Sun L, Brattain MG. Reduced expression of transforming growth factor
beta type I receptor contributes to the malignancy of human colon carcinoma cells. J Biol Chem 1996;271:17366-17371
, 百拇医药
13 Sun L, Wu G, Willson JK, Zborowska E, Yang J, Rajkarunanayake I, Wang J, Gentry LE, Wang XF, Brattain MG. Expression
of transforming growth factor beta type II receptor leads to reduced malignancy in human breast cancer MCF-7
cells. J Biol Chem 1994; 269:26449-26455
14 Garrigue-Antar L,Munoz-Antonia T,Antonia SJ,Gesmonde J,Vellucci VF, Reiss M.Missense mutations of the transforming
, 百拇医药
growth factor-β type II receptor in human head and neck squamous carcinoma cells. Cancer Res 1995;55:3982-3987
15 Yamamoto M,Maehara Y,Sakaguchi Y,Kusumoto T,Ichiyoshi Y, Sugimachi K.Transforming growth factor-β1 induces apoptosis in
gastric cancer cells though a p53-independent pathway. Cancer 1996;77:1628-1633
16 Markowitz S,Wang J,Myeroff L,Parson R,Sun L, Lutterbaugh J, Fan RS,Zborowska E, Kinzler KW, Vogelstein B.Inactivation of the
, http://www.100md.com
type II TGF-βreceptor in colon cancer cells with microsatellite instability. Science 1995;268:1336-1338
17 Marx J. DNA repair defect tied to mutated TGF-β receptor gene. Science 1995;268:1276-1277
18 Chung DC,Rusgi AK.DNA mismatch repair and cancer. Gastroenterrology 1995；109:1685-1699
19 Nakashima H,Inoue H,Mori M,Ueo H,Ikeda M, Akiyoshi T.Microsatellite instability in japanese gastric cancer. Cancer
, 百拇医药
1995;75:1503-1507
20 Han HJ,Yanagisawa A,Kato Y,Park JG,Nakamura Y. Genetic instability in pancreatic cancer and poorly differentiated type of
gastric cancer. Cancer Res 1993;53:5087-5089
21 Myeroff LL,Parsons R,Kim SJ,Hedrick L,Cho KR, Orth K, Mathis M, Kinzler KW,Lutterbaugh J, Park K. A transforming
growth factorβreceptor type II receptor gene mutation common in colon and gastric but rare in endometial cancers
, 百拇医药
with microsatellite instability. Cancer Res 1995；55:5545-5547
22 Kim JJ, Baek MJ, Kim L, Kim NG, Lee YC, Song SY,Noh SH,Kim H. Accumulated frameshift mutations at coding nucleotide
repeats during the progression of gastric carcinoma with microsatellite instability. Lab Invest 1999;79:1113-1120
23 Semba S,Yokozaki H,Yamamoto S,Yasui W,Tahara E.Microsatellite instability in precancerous lesions and adenocarcinomas of
the stomach. Cancer 1996;77:1620-1627, 百拇医药(张朋彬，徐采朴)
徐采朴，中国人民解放军第三军医大学西南医院消化内科 重庆市 400038
项目负责人 张朋彬，400037，中国人民解放军第三军医大学新桥医院消化内科. zpb666@sina.com.cn
电话：023-68755760
收稿日期 2001-12-19 接受日期 2002-01-04
摘要
目的:观察转化生长因子(TGFβ)II型受体基因Poly(A)10片段在胃癌组织中的突变情况.
, http://www.100md.com
方法:利用PCR/SSCP方法，对10例正常胃组织，21例肠化生组织，10例不典型增生，及62例胃癌组织中TGFβII型受体基因Poly(A)10片段的突变情况进行了研究.
结果:在62例胃癌组织中，有4例TGFβII型受体基因Poly(A)10片段发生了突变，在正常胃黏膜组织、肠化生组织及不典型增生组织中，未见该片段异常.
结论:胃癌组织中TGFβII型受体基因的突变对胃癌发生发展起了重要作用.
张朋彬,徐采朴. 转化生长因子βII型受体在胃癌中表达的研究.世界华人消化杂志 2002;10(4):474-475
0 引言
, 百拇医药
转化生长因子β(transforming growth factorβ,TGFβ)是一多功能的细胞生长因子，对细胞的生长分化有着重要的调节作用[1,2].他能抑制大多数细胞的生长，并可抑制肿瘤细胞的生长，引起一些肿瘤细胞发生凋亡.我们通过PCR/SSCP方法对TGFβII型受体基因Poly(A)10片段在胃癌组织中的表达情况进行了研究.
1 材料和方法
1.1 材料 共收集我院胃部手术标本胃镜活检103例(包括新鲜冷冻标本及石蜡包埋标本)，其中正常胃黏膜组织10例，肠化生组织21例，不典型增生组织10例，胃癌组织62例(高分化腺癌22例，低分化腺癌30例，印戒细胞癌7例，黏液腺癌3例).患者平均年龄51.1岁(27～74岁)，男59例，女34例. 冷冻标本及石蜡包埋标本DNA提取参照相关文献[3]进行.
, 百拇医药
1.2 方法 PCR扩增参照相关文献[4]进行.采用引物为：P1:5，-AGATGCTGCTTCTCCAAAGTGC-3，P2:5，-TTGCACTCATCAGAGCTAC AGG-3. PCR反应总体积100μl.反应条件如下：首轮循环，94℃ 5min，55～60℃ 1min，72℃ 1min；后续循环，94℃ 1min，55～60℃ 1min，72℃ 1min；末轮循环：94℃ 1min，55～60℃ 1min，72℃ 10min.
1.3 PCR/SSCP分析 参照相关文献[5，6]进行，采用银染法.取扩增产物5μl，混入上样缓冲液10μl，混匀后95℃变性，取出后置于冰水中，然后在8～15%的中性聚丙烯酰胺中电泳，电泳结束后取出凝胶置于染色盒中显影，显影完全后，置10%冰醋酸终止反应并固定，蒸馏水漂洗后进行观察，出现异常单链者为阳性.
, 百拇医药
2 结果
我们应用PCR/SSCP方法分析了62例胃癌组织中TGFβII型受体基因Poly(A)10片段的变化情况，发现共有4例发生突变，其中2例为高分化腺癌，两例为低分化腺癌，总突变率为6.5%(图1).
图1 TGFβII型受体基因Poly(A)10片段在胃癌组织中的表达. Ca:胃癌组织，可见有一异常条带(箭头所指)；D：不典型增生组织；I：肠化生组织；N：正常胃黏膜组织.
在10例正常胃黏膜组织及21例肠化生和10例不典型增生中，未见TGFβII型受体基因Poly(A)10片段的突变.
, 百拇医药 3 讨论
TGFβ是一具有多功能的细胞生长因子，对细胞的生长、分化有着重要的调节作用.他对大多数细胞的生长具有抑制作用，如上皮细胞和血液细胞等.他能抑制正常胃黏膜细胞和胃癌细胞的生长，并可诱导胃癌细胞发生凋亡[7-10].尽管TGF β对肿瘤的生长具有抑制作用，但一些癌细胞通过某些机制逃脱了其抑制.目前研究发现，这是由于癌细胞膜上TGFβ受体和细胞内信使的表达出现了异常[11-14]，使这些细胞失去了对TGFβ的反应. 对于胃癌细胞，TGFβ1只能诱导同时表达I型和II型受体的胃癌细胞发生凋亡，而二者缺一或均缺乏的胃癌细胞不被TGFβ1诱发凋亡[15].目前研究发现，TGFβ II型受体的异常表达多是由于其基因709～718区的多聚腺苷酸Poly(A)10中的腺苷酸的插入或缺失所造成.该区域腺苷酸的插入或缺失，造成II型受体基因发生框架移动，产生异常的II型受体或使其转录中断[16].产生这种现象的原因与微卫星不稳定性(microsatellite instability,MI)有关.微卫星是指基因组中散在的较短的重复序列，他在DNA复制时容易产生错配现象，即易发生碱基的插入或缺失，这种错配可由体内的错配修复系统(mismatch repair,MMR)来纠正[17].目前人类已定位了四个MMR基因，分别是hMSH2,hMLH1,hPMS1和 hPMS2，他们能特异性地结合到错配的核苷酸处，启动修复工作.当该系统有缺陷，不能纠正DNA的复制错误时，便出现MI，使相关基因自发突变率升高[18].
, 百拇医药
MI在胃癌发生率约15-39%[19,20].Myeroff研究发现TGFβ II型受体Poly(A)10片段在胃癌的突变率为20.7%[21].Kim et al[22]研究发现，在胃癌与胃腺瘤组织中，MI的发生率在前者明显高于后者，而且随着胃癌的发展，包括TGFβ II型受体在内的MI相关指标的突变率也渐升高.
我们对62例胃癌组织的TGFβ II型受体Poly(A)10片段进行分析，发现仅有4例发生突变，突变发生率为6.5%.在这4例中，两例发生于高中分化腺癌(2/22)，两例为低分化腺癌(2/30).明显低于文献报道在其他肿瘤中的突变率.
MI不但存在于胃癌组织，在胃癌前病变中也存在[23].从理论上讲，TGFβ II型受体Poly(A)10片段在胃癌前病变中也可能存在突变.因此我们对肠化生和不典型增生组织也进行了Poly(A)10片段的检测，在21例肠化生组织及10例不典型增生组织中，未发现该片段的异常，提示Poly(A)10片段的改变在胃癌的发生发展过程中可能是一个晚期事件.当然也不能排除他在胃癌中的低突变率.
, 百拇医药
TGFβ II型受体的突变，使肿瘤细胞逃脱TGFβ的生长抑制作用，对胃癌的发生发展起了一定的促进作用.
4 参考文献
1 Massague J. The transforming growth factor-β family. Annu Rev Cell Biol 1990;6:597-641
2 陈修煦,来茂德.转化生长子TGF-β研究进展.世界华人消化杂志 2000;8:1405-1140
3 Shibata D. Extraction of DNA from paraffin-embedded tissue for analysis by polymerasee chain reaction:new tricks from an old
, 百拇医药
friednd. Human Pathol 1994;25:561-563
4 Akiyama Y,Iwanaga R,Saitoh K,Shiba R,Ushino K,Ikeda E, Iwama T, Nomizu T,Yuasa Y. Transforming growth factorβtype II
receptor gene mutations in adenomas from hereditary nonpolyposis colorectal cancer. Gastroenterology 1997;112:33-39
5 崔建涛,吕有勇. 改良PCR/SSCP和PCR直接测序在基因突变检测中的应用. 新消化病学杂志 1997；5：593-594
6 Oto M, Miyake S, Yuasa Y. Optimezation of nonradioisotopic single strand conformation polymorphism analysis with a
, http://www.100md.com
conventional minislab gelelectrophoresis apparatus. Analytical Biochem 1993;213:19-22
7 张朋彬,徐采朴.转化生长因子β与胃癌. 华人消化杂志 1998;6:630-631
8 Ohta S, Yanagihara K, Nagata K. Mechanism of apoptotic cell death of human gastric carcinoma cells mediated by transforming
growth factor beta. Biochem J 1997;324:777-782
9 Kang SH, Bang YJ, Jong HS, Seo JY, Kim NK， Kim SJ. Rapid induction of p21WAF1 but delayed down-regulation of Cdc25A in
, http://www.100md.com
the TGF-beta-induced cell cycle arrest of gastric carcinoma cells. Br J Cancer 1999;80:1144-1149
10 Yoo YD, Choi JY, Lee SJ, Kim JS, Min BR, Lee YI, Kang YK. TGF-beta-induced cell-cycle arrest through the p21(WAF1/CIP1)-
G1 cyclin/Cdks-p130 pathway in gastric-carcinoma cells. Int J Cancer 1999;83:512-517
11 Kim IY,Ahn HJ,Zelner DJ,Shaw JW,Sensibar JA, Kim JH, Kato M, Lee C. Genetic change in transforming growth factor
, 百拇医药
beta (TGF-beta) receptor type I gene correlates with insensitivity to TGF-beta 1 in human prostate cancer cells.
Cancer Res 1996;56:44-48
12 Wang J,Han W,Zborowska E,Liang J,Wang X, Willson JK, Sun L, Brattain MG. Reduced expression of transforming growth factor
beta type I receptor contributes to the malignancy of human colon carcinoma cells. J Biol Chem 1996;271:17366-17371
, 百拇医药
13 Sun L, Wu G, Willson JK, Zborowska E, Yang J, Rajkarunanayake I, Wang J, Gentry LE, Wang XF, Brattain MG. Expression
of transforming growth factor beta type II receptor leads to reduced malignancy in human breast cancer MCF-7
cells. J Biol Chem 1994; 269:26449-26455
14 Garrigue-Antar L,Munoz-Antonia T,Antonia SJ,Gesmonde J,Vellucci VF, Reiss M.Missense mutations of the transforming
, 百拇医药
growth factor-β type II receptor in human head and neck squamous carcinoma cells. Cancer Res 1995;55:3982-3987
15 Yamamoto M,Maehara Y,Sakaguchi Y,Kusumoto T,Ichiyoshi Y, Sugimachi K.Transforming growth factor-β1 induces apoptosis in
gastric cancer cells though a p53-independent pathway. Cancer 1996;77:1628-1633
16 Markowitz S,Wang J,Myeroff L,Parson R,Sun L, Lutterbaugh J, Fan RS,Zborowska E, Kinzler KW, Vogelstein B.Inactivation of the
, http://www.100md.com
type II TGF-βreceptor in colon cancer cells with microsatellite instability. Science 1995;268:1336-1338
17 Marx J. DNA repair defect tied to mutated TGF-β receptor gene. Science 1995;268:1276-1277
18 Chung DC,Rusgi AK.DNA mismatch repair and cancer. Gastroenterrology 1995；109:1685-1699
19 Nakashima H,Inoue H,Mori M,Ueo H,Ikeda M, Akiyoshi T.Microsatellite instability in japanese gastric cancer. Cancer
, 百拇医药
1995;75:1503-1507
20 Han HJ,Yanagisawa A,Kato Y,Park JG,Nakamura Y. Genetic instability in pancreatic cancer and poorly differentiated type of
gastric cancer. Cancer Res 1993;53:5087-5089
21 Myeroff LL,Parsons R,Kim SJ,Hedrick L,Cho KR, Orth K, Mathis M, Kinzler KW,Lutterbaugh J, Park K. A transforming
growth factorβreceptor type II receptor gene mutation common in colon and gastric but rare in endometial cancers
, 百拇医药
with microsatellite instability. Cancer Res 1995；55:5545-5547
22 Kim JJ, Baek MJ, Kim L, Kim NG, Lee YC, Song SY,Noh SH,Kim H. Accumulated frameshift mutations at coding nucleotide
repeats during the progression of gastric carcinoma with microsatellite instability. Lab Invest 1999;79:1113-1120
23 Semba S,Yokozaki H,Yamamoto S,Yasui W,Tahara E.Microsatellite instability in precancerous lesions and adenocarcinomas of
the stomach. Cancer 1996;77:1620-1627, 百拇医药(张朋彬，徐采朴)