Kai1/CD82在不同转移潜能大肠癌细胞系的表达
杨光之，丁彦青，魏荣干， 中国人民解放军第一军医大学基础部病理学教研室 广东省广州市 510515
项目负责人 杨光之，510515，广东省广州市,中国人民解放军第一军医大学基础部病理学教研室. guangzhiy@163.net
电话：020-85140114-89099
收稿日期 2001-12-04 接受日期 2002-01-04
摘要
目的:探讨Kai1/CD82的表达与大肠癌转移潜能的相关性.
方法:采用免疫组织化学方法,检测Kai1/CD82在大肠癌细胞系LoVo、HR8348、HCT116、HT29与SW480细胞的表达.
, http://www.100md.com
结果:Kai1/CD82在LoVo、HR8348与HCT116细胞系呈低水平表达,在HT29与SW480细胞系则呈高水平表达.
结论:Kai1/CD82的表达与结直肠癌细胞转移潜能密切相关.
杨光之，丁彦青，魏荣干. Kai1/CD82在不同转移潜能大肠癌细胞系的表达.世界华人消化杂志 2002;10(4):475-477
0 引言
Kai1基因是Dong et al人[1]于1995年从人的第11号染色体分离出的基因,其编码产物为细胞膜糖蛋白, 由267个氨基酸组成,属于TM4SF(transmembrane 4 superfamily)或称TST(tetra spans transmembrane)家族成员. 近些年的研究认为其与多种肿瘤的转移有关，如前列腺癌、肺癌、胰腺癌等. 为了进一步确定Kai1/CD82与大肠癌转移的关系，我们选用人结直肠腺癌的五种细胞系LoVo、HR8348、HCT116、HT29和SW480，分别观察Kai1/CD82的表达情况,分析其与转移潜能的相关性.
, 百拇医药
1 材料和方法
1.1 材料
1.1.1 细胞系 LoVo、HR8348、HCT116、HT29和SW480细胞系均为本教研室自存.
1.1.2 主要试剂及仪器 RPMI1640与DMEM培养粉, 美国Gibco BRL公司产品;CD82鼠抗人单克隆抗体, 美国Pharmingen公司产品;SABC免疫组化检测试剂盒, 武汉博士德公司产品.
1.2 方法
1.2.1 细胞培养及细胞片制作 LoVo、HR8348、HCT116与HT29细胞采用RPMI1640完全培养基, SW480细胞采用DMEM完全培养基，置37℃含5%CO2孵育箱内培养,取生长状态好的细胞,制成浓度为1×107/ml的细胞悬液,将此细胞悬液一滴接种于已消毒的培养皿中的盖玻片上, 加完全培养基培养48h,然后将细胞生长状态良好的盖玻片取出, 0.01M的PBS(pH7.2)漂洗3次.95%乙醇固定10min, PBS漂洗, 备用.
, 百拇医药
1.2.2 免疫组织化学检测CD82表达 采用过氧化物酶标记的链亲和素生物素(SABC)法.制好的细胞片, PBS漂洗;0.1% 的Triton X-100处理10min, PBS漂洗；0.3%过氧化氢甲醇溶液处理30min, PBS洗；非免疫动物血清封闭30min;加CD82单克隆抗体(1∶100稀释),4℃下孵育过夜, PBS漂洗;加生物素标记的(羊抗鼠IgM)二抗,37℃反应30min, PBS漂洗;加入辣根过氧化物酶标记的链霉素卵白素,37℃反应30min, PBS漂洗;DAB显色,蒸馏水漂洗终止显色,苏木素衬染,脱水、透明、封片.
1.2.3 结果判断 染成棕黄色或黄色为CD82表达阳性，切片上75%以上的细胞阳性为该细胞表达阳性.
2 结果
, 百拇医药
免疫组化结果发现，LoVo、HR8348与HCT116表达阴性(图1～3)，HT29与SW480表达阳性(图4、5).
图1 2 3 LoVo、HR8348与HCT116细胞CD82抗原表达均呈阴性 ×200
图4、5 HT29与SW480细胞CD82抗原表达均呈阴性 ×200
3 讨论
肿瘤转移是导致癌肿患者死亡的主要原因，然而，人们对肿瘤转移的分子机制却了解不多. 在目前已知的肿瘤转移相关基因中，Kai1是较为明确的抑制基因. 该基因位于人的第11号染色体p11.2区，长约80kb，翻译出的蛋白质与已发现的CD82结构相同. Kai1/CD82在人体分布广泛，其序列在多种动物中相当保守. 这些提示他具有重要的生物学功能.
, http://www.100md.com
初期的研究认为Kai1/CD82基因是前列腺癌特异性的转移抑制基因[2,3]，而后发现，他对肺癌[4,5]、胰腺癌[6,7]、乳腺癌[8,9]与食管癌[10]等多种肿瘤的转移均有抑制作用.本研究显示, Kai1/CD82在HT29、SW480中表达阳性，在LoVo、HR8348中表达阴性，而前两种细胞系来源于原发瘤，LoVo由转移瘤传代建系[11]，HR8348则是被我国研究者广泛使用转移性较强的细胞株. 我们以往的研究[12]也比较过HT29与LoVo的转移性，发现LoVo细胞的转移性远较HT29为高.这些提示Kai1/CD82的表达与结直肠癌转移潜能存在相反的关系. Maurer et al[13]与Lombardi et al[14]研究组利用大肠癌手术切除标本，用原位杂交或免疫组化的方法进行的研究，与我们得到的结论一致. 同时本研究还观察到，Kai1/CD82在源于原发瘤的细胞系HCT116中表达也为阴性.可以推测，在影响肿瘤转移的多基因、多因素中，Kai1/CD82只是其中之一，可见，肿瘤转移是一个受多种因素调控的复杂的过程. Kai1/D82抑制肿瘤转移的作用基本上已得到大家的公认，但他发挥作用的机制及其生物学功能尚不完全清晰. 他的结构及体外实验[15]提示他在细胞间黏附、细胞与基质的连接中起有一定的作用.另外，Kai1/ D82在肿瘤转移时表达下降的原因也不甚清楚.这些问题的解决有待于进一步的研究.
, http://www.100md.com
4 参考文献
1 Dong JT, Lamb PW, Rinker-Schaeffer CW, Vukanovic J, Ichikawa T, Isaacs JT, Barrett JC. KAI1, a metastasis suppressor gene
for prostate cancer on human chromosome 11p11.2. Science 1995;268: 884-886
2 Ueda T, Ichikawa T, Tamaru J, Mikata A, Akakura K, Akimoto S, Imai T, Yoshie O, Shiraishi T, Yatani R, Ito H, Shimazaki J.
Expression of the KAI1 protein in benign prostatic hyperplasia and prostate cancer. Am J Pathol 1996;149: 1435-1440
, 百拇医药
3 Dong JT, Suzuki H, Pin SS, Bova GS, Schalken JA, Isaacs WB, Barrett JC, Isaacs JT. Down-regulation of the KAI1 metastasis
suppressor gene during the progression of human prostatic cancer infrequently involves gene mutation or allelic loss.
Cancer Res 1996;56: 4387-4390
4 Adachi M, Taki T, Konishi T, Huang CI, Higashiyama M, Miyake M. Novel staging protocol for non-small-cell lung cancers according
, http://www.100md.com
to MRP-1/CD9 and KAI1/CD82 gene expression. J Clin Oncol 1998;16: 1397-1406
5 Higashiyama M, Kodama K, Yokouchi H, Takami K, Adachi M, Taki T, Ishiguro S, Nakamori S, Yoshie O, Miyake M. KAI1/CD82
expression in nonsmall cell lung carcinoma is a novel, favorable prognostic factor: an immunohistochemical analysis.
Cancer 1998;83: 466-474
6 Friess H, Guo XZ, Berberat P, Graber HU, Zimmermann A, Korc M, Buchler MW. Reduced KAI1 expression in pancreatic cancer
, http://www.100md.com
is associated with lymph node and distant metastases. Int J Cancer 1998;79: 349-355
7 Friess H, Guo XZ, Tempia-Caliera AA, Fukuda A, Martignoni ME, Zimmermann A, Korc M, Buchler MW. Differential expression
of metastasis-associated genes in papilla of vater and pancreatic cancer correlates with disease stage.
J Clin Oncol 2001; 19:2422-2432
8 Huang CI, Kohno N, Ogawa E, Adachi M, Taki T, Miyake M. Correlation of reduction in MRP-1/CD9 and KAI1/CD82 expression
, 百拇医药
with recurrences in breast cancer patients. Am J Pathol 1998; 153: 973-983
9 Yang X, Wei LL, Tang C, Slack R, Mueller S, Lippman ME. Overexpression of KAI1 suppresses in vitro invasiveness and In
vivo metastasis in breast cancer cells. Cancer Res 2001; 61: 5284-5288
10 Miyazaki T， Kato H， Shitara Y， Yoshikawa M， Tajima K， Masuda N， Shouji H， Tsukada K， Nakajima T， Kuwano H.
, 百拇医药
Mutation and expression of the metastasis suppressor gene KAI1 in esophageal squamous cell carcinoma.
Cancer 2000; 89: 955-962
11 Trainer DL, Kline T, McCabe FL, Faucette LF, Field J, Chaikin M, Anzano M, Rieman D, Hoffstein S, Li DJ,Gennaro D,Buscarina C,Lynch M,Poste G,Greig R. Biological characterization and oncogene expression in human colorectal carcinoma cell lines.
Int J Cancer 1988；41: 287-296
, 百拇医药
12 邓永键,李祖国,邱红明,黄卓垣，丁彦青，朱梅刚.人大肠癌细胞株的转移潜能及相关特性的比较.世界华人消化杂志 1998；6：33-35
13 Maurer CA, Graber HU, Friess H, Beyermann B, Willi D, Netzer P, Zimmermann A, Buchler MW. Reduced expression of the
metastasis suppressor gene KAI1 in advanced colon cancer and its metastases. Surgery 1999;126:869-880
14 Lombardi DP, Geradts J, Foley JF, Chiao C, Lamb PW, Barrett JC. Loss of KAI1 expression in the progression of colorectal
cancer. Cancer Res 1999; 59: 5724-5731
15 Takaoka A, Hinoda Y, Sato S, Itoh F, Adachi M, Hareyama M, Imai K. Reduced invasive and metastatic potentials of KAI1-
transfected melanoma cells. Jpn J Cancer Res 1998; 89: 397-404, 百拇医药(杨光之，丁彦青，魏荣干)
项目负责人 杨光之，510515，广东省广州市,中国人民解放军第一军医大学基础部病理学教研室. guangzhiy@163.net
电话：020-85140114-89099
收稿日期 2001-12-04 接受日期 2002-01-04
摘要
目的:探讨Kai1/CD82的表达与大肠癌转移潜能的相关性.
方法:采用免疫组织化学方法,检测Kai1/CD82在大肠癌细胞系LoVo、HR8348、HCT116、HT29与SW480细胞的表达.
, http://www.100md.com
结果:Kai1/CD82在LoVo、HR8348与HCT116细胞系呈低水平表达,在HT29与SW480细胞系则呈高水平表达.
结论:Kai1/CD82的表达与结直肠癌细胞转移潜能密切相关.
杨光之，丁彦青，魏荣干. Kai1/CD82在不同转移潜能大肠癌细胞系的表达.世界华人消化杂志 2002;10(4):475-477
0 引言
Kai1基因是Dong et al人[1]于1995年从人的第11号染色体分离出的基因,其编码产物为细胞膜糖蛋白, 由267个氨基酸组成,属于TM4SF(transmembrane 4 superfamily)或称TST(tetra spans transmembrane)家族成员. 近些年的研究认为其与多种肿瘤的转移有关，如前列腺癌、肺癌、胰腺癌等. 为了进一步确定Kai1/CD82与大肠癌转移的关系，我们选用人结直肠腺癌的五种细胞系LoVo、HR8348、HCT116、HT29和SW480，分别观察Kai1/CD82的表达情况,分析其与转移潜能的相关性.
, 百拇医药
1 材料和方法
1.1 材料
1.1.1 细胞系 LoVo、HR8348、HCT116、HT29和SW480细胞系均为本教研室自存.
1.1.2 主要试剂及仪器 RPMI1640与DMEM培养粉, 美国Gibco BRL公司产品;CD82鼠抗人单克隆抗体, 美国Pharmingen公司产品;SABC免疫组化检测试剂盒, 武汉博士德公司产品.
1.2 方法
1.2.1 细胞培养及细胞片制作 LoVo、HR8348、HCT116与HT29细胞采用RPMI1640完全培养基, SW480细胞采用DMEM完全培养基，置37℃含5%CO2孵育箱内培养,取生长状态好的细胞,制成浓度为1×107/ml的细胞悬液,将此细胞悬液一滴接种于已消毒的培养皿中的盖玻片上, 加完全培养基培养48h,然后将细胞生长状态良好的盖玻片取出, 0.01M的PBS(pH7.2)漂洗3次.95%乙醇固定10min, PBS漂洗, 备用.
, 百拇医药
1.2.2 免疫组织化学检测CD82表达 采用过氧化物酶标记的链亲和素生物素(SABC)法.制好的细胞片, PBS漂洗;0.1% 的Triton X-100处理10min, PBS漂洗；0.3%过氧化氢甲醇溶液处理30min, PBS洗；非免疫动物血清封闭30min;加CD82单克隆抗体(1∶100稀释),4℃下孵育过夜, PBS漂洗;加生物素标记的(羊抗鼠IgM)二抗,37℃反应30min, PBS漂洗;加入辣根过氧化物酶标记的链霉素卵白素,37℃反应30min, PBS漂洗;DAB显色,蒸馏水漂洗终止显色,苏木素衬染,脱水、透明、封片.
1.2.3 结果判断 染成棕黄色或黄色为CD82表达阳性，切片上75%以上的细胞阳性为该细胞表达阳性.
2 结果
, 百拇医药
免疫组化结果发现，LoVo、HR8348与HCT116表达阴性(图1～3)，HT29与SW480表达阳性(图4、5).
图1 2 3 LoVo、HR8348与HCT116细胞CD82抗原表达均呈阴性 ×200
图4、5 HT29与SW480细胞CD82抗原表达均呈阴性 ×200
3 讨论
肿瘤转移是导致癌肿患者死亡的主要原因，然而，人们对肿瘤转移的分子机制却了解不多. 在目前已知的肿瘤转移相关基因中，Kai1是较为明确的抑制基因. 该基因位于人的第11号染色体p11.2区，长约80kb，翻译出的蛋白质与已发现的CD82结构相同. Kai1/CD82在人体分布广泛，其序列在多种动物中相当保守. 这些提示他具有重要的生物学功能.
, http://www.100md.com
初期的研究认为Kai1/CD82基因是前列腺癌特异性的转移抑制基因[2,3]，而后发现，他对肺癌[4,5]、胰腺癌[6,7]、乳腺癌[8,9]与食管癌[10]等多种肿瘤的转移均有抑制作用.本研究显示, Kai1/CD82在HT29、SW480中表达阳性，在LoVo、HR8348中表达阴性，而前两种细胞系来源于原发瘤，LoVo由转移瘤传代建系[11]，HR8348则是被我国研究者广泛使用转移性较强的细胞株. 我们以往的研究[12]也比较过HT29与LoVo的转移性，发现LoVo细胞的转移性远较HT29为高.这些提示Kai1/CD82的表达与结直肠癌转移潜能存在相反的关系. Maurer et al[13]与Lombardi et al[14]研究组利用大肠癌手术切除标本，用原位杂交或免疫组化的方法进行的研究，与我们得到的结论一致. 同时本研究还观察到，Kai1/CD82在源于原发瘤的细胞系HCT116中表达也为阴性.可以推测，在影响肿瘤转移的多基因、多因素中，Kai1/CD82只是其中之一，可见，肿瘤转移是一个受多种因素调控的复杂的过程. Kai1/D82抑制肿瘤转移的作用基本上已得到大家的公认，但他发挥作用的机制及其生物学功能尚不完全清晰. 他的结构及体外实验[15]提示他在细胞间黏附、细胞与基质的连接中起有一定的作用.另外，Kai1/ D82在肿瘤转移时表达下降的原因也不甚清楚.这些问题的解决有待于进一步的研究.
, http://www.100md.com
4 参考文献
1 Dong JT, Lamb PW, Rinker-Schaeffer CW, Vukanovic J, Ichikawa T, Isaacs JT, Barrett JC. KAI1, a metastasis suppressor gene
for prostate cancer on human chromosome 11p11.2. Science 1995;268: 884-886
2 Ueda T, Ichikawa T, Tamaru J, Mikata A, Akakura K, Akimoto S, Imai T, Yoshie O, Shiraishi T, Yatani R, Ito H, Shimazaki J.
Expression of the KAI1 protein in benign prostatic hyperplasia and prostate cancer. Am J Pathol 1996;149: 1435-1440
, 百拇医药
3 Dong JT, Suzuki H, Pin SS, Bova GS, Schalken JA, Isaacs WB, Barrett JC, Isaacs JT. Down-regulation of the KAI1 metastasis
suppressor gene during the progression of human prostatic cancer infrequently involves gene mutation or allelic loss.
Cancer Res 1996;56: 4387-4390
4 Adachi M, Taki T, Konishi T, Huang CI, Higashiyama M, Miyake M. Novel staging protocol for non-small-cell lung cancers according
, http://www.100md.com
to MRP-1/CD9 and KAI1/CD82 gene expression. J Clin Oncol 1998;16: 1397-1406
5 Higashiyama M, Kodama K, Yokouchi H, Takami K, Adachi M, Taki T, Ishiguro S, Nakamori S, Yoshie O, Miyake M. KAI1/CD82
expression in nonsmall cell lung carcinoma is a novel, favorable prognostic factor: an immunohistochemical analysis.
Cancer 1998;83: 466-474
6 Friess H, Guo XZ, Berberat P, Graber HU, Zimmermann A, Korc M, Buchler MW. Reduced KAI1 expression in pancreatic cancer
, http://www.100md.com
is associated with lymph node and distant metastases. Int J Cancer 1998;79: 349-355
7 Friess H, Guo XZ, Tempia-Caliera AA, Fukuda A, Martignoni ME, Zimmermann A, Korc M, Buchler MW. Differential expression
of metastasis-associated genes in papilla of vater and pancreatic cancer correlates with disease stage.
J Clin Oncol 2001; 19:2422-2432
8 Huang CI, Kohno N, Ogawa E, Adachi M, Taki T, Miyake M. Correlation of reduction in MRP-1/CD9 and KAI1/CD82 expression
, 百拇医药
with recurrences in breast cancer patients. Am J Pathol 1998; 153: 973-983
9 Yang X, Wei LL, Tang C, Slack R, Mueller S, Lippman ME. Overexpression of KAI1 suppresses in vitro invasiveness and In
vivo metastasis in breast cancer cells. Cancer Res 2001; 61: 5284-5288
10 Miyazaki T， Kato H， Shitara Y， Yoshikawa M， Tajima K， Masuda N， Shouji H， Tsukada K， Nakajima T， Kuwano H.
, 百拇医药
Mutation and expression of the metastasis suppressor gene KAI1 in esophageal squamous cell carcinoma.
Cancer 2000; 89: 955-962
11 Trainer DL, Kline T, McCabe FL, Faucette LF, Field J, Chaikin M, Anzano M, Rieman D, Hoffstein S, Li DJ,Gennaro D,Buscarina C,Lynch M,Poste G,Greig R. Biological characterization and oncogene expression in human colorectal carcinoma cell lines.
Int J Cancer 1988；41: 287-296
, 百拇医药
12 邓永键,李祖国,邱红明,黄卓垣，丁彦青，朱梅刚.人大肠癌细胞株的转移潜能及相关特性的比较.世界华人消化杂志 1998；6：33-35
13 Maurer CA, Graber HU, Friess H, Beyermann B, Willi D, Netzer P, Zimmermann A, Buchler MW. Reduced expression of the
metastasis suppressor gene KAI1 in advanced colon cancer and its metastases. Surgery 1999;126:869-880
14 Lombardi DP, Geradts J, Foley JF, Chiao C, Lamb PW, Barrett JC. Loss of KAI1 expression in the progression of colorectal
cancer. Cancer Res 1999; 59: 5724-5731
15 Takaoka A, Hinoda Y, Sato S, Itoh F, Adachi M, Hareyama M, Imai K. Reduced invasive and metastatic potentials of KAI1-
transfected melanoma cells. Jpn J Cancer Res 1998; 89: 397-404, 百拇医药(杨光之，丁彦青，魏荣干)