酶法测定CO2CP中一点终点法和二点终点法的比较
【摘要】
目的 比较在单试剂酶法中一点终点法和二点终点法测定二氧化碳结合力(CO2CP)的优劣。
方法 选择患者标本15例(含脂血标本、溶血标本、黄疸标本)用2种不同方法检测，比较检测有干扰标本时2种方法的优劣，再选择用已知浓度标准血清用2种方法检测10次，比较检测无干扰标本时2种方法的优劣。
结果 检测有干扰标本时，二点终点法明显优于一点终点法；检测无干扰标本时，一点终点法较好，但2种方法测得结果差异无显著性(P>0.05)。
结论 在单试剂酶法条件下使用二点终点法能消除部分样品空白，检测结果更灵敏、准确。
【关键词】 二氧化碳结合力；单试剂酶法；一点终点法；二点终点法
我科新近采用单试剂酶法测定二氧化碳结合力(CO2CP)，由于单试剂酶法无法自动消除样品空白，而样本质量(溶血、脂血、黄疸血清、血清中含有药物等干扰物)对CO2CP的测定有很大影响。因此，选择一个良好的定标测定方法尤为重要。本文尝试用一点终点法和二点终点法对CO2CP测定作比较，筛选出使用单试剂酶法试剂时比较适用的校标、测定方法，现报告如下。
1 材料与方法
1.1 材料 日本岛津CL-8000全自动生化分析仪；浙江东欧(单试剂酶法，批号20050121)；标准液1(试剂盒自带，浓度25mmol/L)；标准液2(迈克公司，批号0604091，浓度25mmol/L)；
1.2 方法
1.2.1 测定原理
磷酸烯醇式丙酮酸+HCO-3—草酰乙酸+H2PO-4草酰乙酸+NADH+H+—苹果酸+NAD+NADH吸光度在380nm有最大吸收峰，NADH的减少与样品中CO2含量成正比。
1.2.2 一点终点法(方法1，为试剂厂家提供方法) 在反应过程中，读取第16点吸光度(1点=17.9s)作为待测物(试剂空白、标准、样品)最终吸光度,以标准液1校标，反应曲线见图1。
计算公式:
CO2CP(mmol/L)=[(A空白-A样品)/(A空白-A标准)]×25=(A空白-A样品)×K1
K1=-0.0491,A空白=1890.2mAbs(以下所有吸光度单位均为mAbs)
1.2.3 二点终点法(方法2) 在反应过程中，读取第2点作为A1，第16点作为A2，以标准液1校标，反应曲线见图2。
图1 一点终点法反应曲线
图2 二点终点法反应曲线
计算公式：
CO2CP(mmol/L)=[(ΔA空白-ΔA样品)/(ΔA空白-ΔA标准)]×25=(ΔA空白-ΔA样品 )×K2
其中，ΔA=ΔA1-ΔA2，K2=-0.0697，ΔA空白=1387.5-1275.8=111.7
1.2.4 两种检测方法的应用及结果 取患者新鲜血清标本15例(含脂血、溶血、黄疸标本)，同时用2种方法定标、检测，结果见表1。用2种方法同时检测标准液2共10次，求SD、CV、均值，并统计学方法采用t检验。结果见表2。
表1 患者新鲜血清15例检测结果
注：其中*表示6号标本重度脂血，ABS表示吸光度过高，仪器无法检测；**表示8号标本轻度脂血；△表示9号标本中度溶血；△△表示11号标本重度溶血；#表示12号标本黄疸血清；##因科室尚未购买质控血清，暂以此标准液代之
表2 标准液2测定10次检测结果
注：P>0.05
2 结果分析
表1中，6号标本为重度脂血，2种方法仪器都报警，说明该试剂该方法抗脂血干扰能力较差。值得注意的是9号标本用方法1测结果为0，检查其曲线，曲线很好，有反应过程，吸光度从2306.6下降到1916.2，按常理判断不应为0，可仔细分析，就能知道为什么会有这样的结果。
可以看出，9号的样品空白非常高，它反应后吸光度虽然也大大下降，但仍然大于A空白(1890.2)，根据公式CO2CP=(A空白-A样品)×(-0.0569)，其值当然为0。如果用方法2的计算公式CO2CP=(ΔA空白-ΔA样品)×(-0.0659)计算此结果，CO2CP=111.7-(2306.6-1916.2)×(-00659)=18.0，这与方法2测得结果(16)基本一致。从表1中也可看出，脂血、溶血等含干扰因素的其他标本用方法2测定时，结果也相对要好一些，因为在反应过程中测的第二点吸光度实际上就是反应初期吸光度，它包括了样品的基础吸光度，可以看成是样品空白。利用ΔA来计算CO2CP含量，实际上扣除了样品空白，基本能够消除干扰物对吸光度的影响。
为什么9号标本会有如此高的样品空白，估计与溶血有关，溶血从两方面影响CO2CP的测定，一是溶血后RBC内HCO3-释放出来，这会导致CO2CP升高，二是HB能使300～500nm的吸光度大大增加，这会导致CO2CP下降，而后者的影响效果远远大于前者，而且血液中的CO2CP也随时会扩散到空气中，这可与一的影响相抵消。但溶血的影响会这么大以至于结果为0吗？从11号重度溶血标本结果可以看出，对9号标本的干扰还不仅仅是溶血，肯定还有其他不可知的因素，比如药物的影响等。这同时也说明了干扰CO2CP测定的因素很多，在有条件的情况下，宜选择双试剂、双波长检测的试剂盒。
从表2可以看出，测定没有干扰物的样品时，方法1较佳，因为测的都是第16点的吸光度，此时反应也接近尾声，曲线也趋于平稳，吸光度比较稳定，因此结果也比较稳定。而方法2中测的第二点吸光度反应刚开始，反应比较复杂，吸光度相对而言不太稳定，随机误差较大。这也导致结果的稳定性稍差，但两者差异无显著性(P>0.05)。
3 结论
综上所述，对溶血、脂血、黄疸、有药物等干扰的异常标本，方法2明显优于方法1，对无干扰的常规标本，方法1比方法2的稳定性较好，但差异无显著性(P>0.05)。因此综合以上因素考虑，使用单试剂酶法试剂检测CO2CP时，使用方法2不失为一种较佳的能消除样品空白的方法。
作者单位： 443000 四川都江堰，都江堰市中国水利水电第十工程局医院
(编辑：小 南), http://www.100md.com(杨 梅)
目的 比较在单试剂酶法中一点终点法和二点终点法测定二氧化碳结合力(CO2CP)的优劣。
方法 选择患者标本15例(含脂血标本、溶血标本、黄疸标本)用2种不同方法检测，比较检测有干扰标本时2种方法的优劣，再选择用已知浓度标准血清用2种方法检测10次，比较检测无干扰标本时2种方法的优劣。
结果 检测有干扰标本时，二点终点法明显优于一点终点法；检测无干扰标本时，一点终点法较好，但2种方法测得结果差异无显著性(P>0.05)。
结论 在单试剂酶法条件下使用二点终点法能消除部分样品空白，检测结果更灵敏、准确。
【关键词】 二氧化碳结合力；单试剂酶法；一点终点法；二点终点法
我科新近采用单试剂酶法测定二氧化碳结合力(CO2CP)，由于单试剂酶法无法自动消除样品空白，而样本质量(溶血、脂血、黄疸血清、血清中含有药物等干扰物)对CO2CP的测定有很大影响。因此，选择一个良好的定标测定方法尤为重要。本文尝试用一点终点法和二点终点法对CO2CP测定作比较，筛选出使用单试剂酶法试剂时比较适用的校标、测定方法，现报告如下。
1 材料与方法
1.1 材料 日本岛津CL-8000全自动生化分析仪；浙江东欧(单试剂酶法，批号20050121)；标准液1(试剂盒自带，浓度25mmol/L)；标准液2(迈克公司，批号0604091，浓度25mmol/L)；
1.2 方法
1.2.1 测定原理
磷酸烯醇式丙酮酸+HCO-3—草酰乙酸+H2PO-4草酰乙酸+NADH+H+—苹果酸+NAD+NADH吸光度在380nm有最大吸收峰，NADH的减少与样品中CO2含量成正比。
1.2.2 一点终点法(方法1，为试剂厂家提供方法) 在反应过程中，读取第16点吸光度(1点=17.9s)作为待测物(试剂空白、标准、样品)最终吸光度,以标准液1校标，反应曲线见图1。
计算公式:
CO2CP(mmol/L)=[(A空白-A样品)/(A空白-A标准)]×25=(A空白-A样品)×K1
K1=-0.0491,A空白=1890.2mAbs(以下所有吸光度单位均为mAbs)
1.2.3 二点终点法(方法2) 在反应过程中，读取第2点作为A1，第16点作为A2，以标准液1校标，反应曲线见图2。
图1 一点终点法反应曲线
图2 二点终点法反应曲线
计算公式：
CO2CP(mmol/L)=[(ΔA空白-ΔA样品)/(ΔA空白-ΔA标准)]×25=(ΔA空白-ΔA样品 )×K2
其中，ΔA=ΔA1-ΔA2，K2=-0.0697，ΔA空白=1387.5-1275.8=111.7
1.2.4 两种检测方法的应用及结果 取患者新鲜血清标本15例(含脂血、溶血、黄疸标本)，同时用2种方法定标、检测，结果见表1。用2种方法同时检测标准液2共10次，求SD、CV、均值，并统计学方法采用t检验。结果见表2。
表1 患者新鲜血清15例检测结果
注：其中*表示6号标本重度脂血，ABS表示吸光度过高，仪器无法检测；**表示8号标本轻度脂血；△表示9号标本中度溶血；△△表示11号标本重度溶血；#表示12号标本黄疸血清；##因科室尚未购买质控血清，暂以此标准液代之
表2 标准液2测定10次检测结果
注：P>0.05
2 结果分析
表1中，6号标本为重度脂血，2种方法仪器都报警，说明该试剂该方法抗脂血干扰能力较差。值得注意的是9号标本用方法1测结果为0，检查其曲线，曲线很好，有反应过程，吸光度从2306.6下降到1916.2，按常理判断不应为0，可仔细分析，就能知道为什么会有这样的结果。
可以看出，9号的样品空白非常高，它反应后吸光度虽然也大大下降，但仍然大于A空白(1890.2)，根据公式CO2CP=(A空白-A样品)×(-0.0569)，其值当然为0。如果用方法2的计算公式CO2CP=(ΔA空白-ΔA样品)×(-0.0659)计算此结果，CO2CP=111.7-(2306.6-1916.2)×(-00659)=18.0，这与方法2测得结果(16)基本一致。从表1中也可看出，脂血、溶血等含干扰因素的其他标本用方法2测定时，结果也相对要好一些，因为在反应过程中测的第二点吸光度实际上就是反应初期吸光度，它包括了样品的基础吸光度，可以看成是样品空白。利用ΔA来计算CO2CP含量，实际上扣除了样品空白，基本能够消除干扰物对吸光度的影响。
为什么9号标本会有如此高的样品空白，估计与溶血有关，溶血从两方面影响CO2CP的测定，一是溶血后RBC内HCO3-释放出来，这会导致CO2CP升高，二是HB能使300～500nm的吸光度大大增加，这会导致CO2CP下降，而后者的影响效果远远大于前者，而且血液中的CO2CP也随时会扩散到空气中，这可与一的影响相抵消。但溶血的影响会这么大以至于结果为0吗？从11号重度溶血标本结果可以看出，对9号标本的干扰还不仅仅是溶血，肯定还有其他不可知的因素，比如药物的影响等。这同时也说明了干扰CO2CP测定的因素很多，在有条件的情况下，宜选择双试剂、双波长检测的试剂盒。
从表2可以看出，测定没有干扰物的样品时，方法1较佳，因为测的都是第16点的吸光度，此时反应也接近尾声，曲线也趋于平稳，吸光度比较稳定，因此结果也比较稳定。而方法2中测的第二点吸光度反应刚开始，反应比较复杂，吸光度相对而言不太稳定，随机误差较大。这也导致结果的稳定性稍差，但两者差异无显著性(P>0.05)。
3 结论
综上所述，对溶血、脂血、黄疸、有药物等干扰的异常标本，方法2明显优于方法1，对无干扰的常规标本，方法1比方法2的稳定性较好，但差异无显著性(P>0.05)。因此综合以上因素考虑，使用单试剂酶法试剂检测CO2CP时，使用方法2不失为一种较佳的能消除样品空白的方法。
作者单位： 443000 四川都江堰，都江堰市中国水利水电第十工程局医院
(编辑：小 南), http://www.100md.com(杨 梅)