乙型肝炎病毒前-前-S蛋白在大肠杆菌中的表达和纯化
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王春花, 成 军, 郎振为, 李蕴茹, 闫 杰
王春花,成军,李蕴茹,闫杰,张黎颖,郎振为,通讯作者,:,摘要,目的,方法,结果,结论,1,2.2,重组前-前-S蛋白的表达、纯化及免疫学检
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参见附件(531KB，3页)。
王春花,成军,李蕴茹, 闫杰,张黎颖,北京地坛医院传染病研究所 北京市 100011
郎振为,北京地坛医院病理科 北京市 100011
国家自然科学基金攻关项目,No. C03011402, No. C30070689
军队“九、五”科技攻关项目,No. 98D063
军队回国留学人员启动基金项目,No. 98H038
军队“十、五”科技攻关青年基金项目,No. 01Q138
军队“十、五”科技攻关面上项目,No. 01MB135
通讯作者:成军,100011, 北京市东城区安定门外大街地坛公园13号,北京地坛医院传染病研究所. cj@genetherapy.com.cn
电话: 010-64481639 传真:010-64281540
收稿日期:2005-01-10 接受日期:2005-05-25
摘要目的:在大肠杆菌中表达乙型肝炎病毒(HBV)前-前-S蛋白，并进行纯化和鉴定.
方法:通过聚合酶链式反应(PCR)获得HBV前-前-S基因，将前-前-S克隆至PET32a+，构建原核表达重组质粒，在大肠杆菌中诱导表达，表达产物进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)，考马斯亮蓝染色.采用凝胶电泳回收纯化.经Western blot.
结果:成功扩增获得HBV的前-前-S编码基因片断，并构建大肠杆菌表达载体.表达载体转化的大肠杆菌经过IPTG的诱导，裂解，SDS-PAGE，结果显示得到了目的蛋白Mr28000.以抗-His的单克隆抗体进行的westernblot杂交实验，结果表明表达、纯化的目的蛋白具有特异性免疫反应识别.
结论:成功表达HBV的前-前-S蛋白，对于研究HBV的前-前-S蛋白的免疫原性和生物学特性奠定了坚实的基础.
王春花,成军,郎振为, 李蕴茹, 闫杰,张黎颖. 乙型肝炎病毒前-前-S蛋白在大肠杆菌中的表达和纯化.世界华人消化杂志 2005;13(15):1894-18961 (PDF) 乙型肝炎病毒前-前-S基因及其编码产物序列.
2.2 重组前-前-S蛋白的表达、纯化及免疫学检测分析将重组阳性质粒转入大肠杆菌E.coliBL21，经IPTG诱导得到表达.表达产物进行SDS-PAGE(120g/L)，考马斯亮蓝染色.结果表明其表达产物主要以包涵体形式存在，Mr28 000，纯化后的包涵体未显示其他杂带(图2).蛋白印迹试验表明，表达的重组蛋白与His抗体可产生特异性结合，在Mr28 000左右有明显杂交信号(图3).
图2 (PDF) 前前S融合蛋白的SDS-PAGE凝胶电泳分析. M: Marker; 1: 纯化后的包涵体;2: 包涵体洗液; 3:包涵体; 4: 诱导的前前S融合蛋白裂解液;5: 未诱导的前前S融合蛋白裂解液.
图3 (PDF) 前前S融合蛋白的蛋白印迹实验.M: Marker; 1: 未诱导的前前S融合蛋白裂解液;2: 诱导的前前S融合蛋白裂解液.
3 讨论1979年，Gelibertet al首次报告了HBV基因组的全序列，并定位了4个ORF.我国学者于1984年报道了大陆HBV株(adr)的序列[15].目前在美国国立卫生研究院(NIH)的核苷酸序列数据库(GenBank)中，存储了200多个HBV全基因组序列，但之后学者对4个ORF分区的界定并无异议，沿用至今.前-前-S区ORF在1983年Fujiyamaet al[16]克隆的adr亚型的S基因产物中最早被提及 ......
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