第三十章 聚合酶链式反应
聚合酶链式反应简称PCR,是近年发展起来的一种体外扩增特异DNA片段技术，短时间在体外可获得数百万个特异的DNA序列拷贝。PCR具有特异性强，灵敏度高，操作简单，快速的特点。
【原理】
PCR技术是模板DNA，引物和4种脱氧核糖核苷酸的条件下依赖于DNA聚合酶系酶促反应，其特异性取决于引物和模板的DNA的特异性结合，反应分三步进行：变性、退火、延伸为一个循环，约30个循环，2h左右将靶DNA扩增数百万倍。
【适应证】
适用于细菌、病毒、衣原体、支原体、真菌、螺旋体感染、遗传性疾病等疾病。
【方法】
1． 取材：根据检查的目的和要求可取血（遗传病），分泌物或前列腺液（淋病及非淋病性尿道炎），疱液（单纯疱疹），活体组织（肿瘤、尖锐湿疣等组织制成匀浆）。材料置"PBS"液中，保存于-20℃备用。
2． 提取标本中的DNA
将待检标本中加50 l裂解液（1×PCR缓冲液0.5％NP-0.05吐温-20）再加20 g/ml蛋白酶k混匀，55℃水浴1h以暴露DNA，95℃水浴中10min，灭活蛋白酶k，离心取上清液-20℃保存备用。
3． PCR扩增
各20pmol/L的引物，样品3～5 l，反应液1 l，无菌石蜡油覆盖，97℃变性10min，加入Tag DNA聚合酶后，按94℃变性，57℃退火，70℃各1min循环，进行30个循环后，最后72℃延伸5min。
4． 扩增产物的检测
取15 l扩增物经2％琼脂糖凝胶中电泳1h，置溴化锭染色后在紫外线灯下观察特异性的DNA紫光带为阳性。
不同的标本来源、不同的引物，所要求的反应条件不尽相同，具体操作方法，按试剂盒说明进行。
【注意事项】
由于PCR具有较强大的扩增能力，微量的污染都可导致假阳性，在操作的每一个环节都要避免污染的发生。, http://www.100md.com
【原理】
PCR技术是模板DNA，引物和4种脱氧核糖核苷酸的条件下依赖于DNA聚合酶系酶促反应，其特异性取决于引物和模板的DNA的特异性结合，反应分三步进行：变性、退火、延伸为一个循环，约30个循环，2h左右将靶DNA扩增数百万倍。
【适应证】
适用于细菌、病毒、衣原体、支原体、真菌、螺旋体感染、遗传性疾病等疾病。
【方法】
1． 取材：根据检查的目的和要求可取血（遗传病），分泌物或前列腺液（淋病及非淋病性尿道炎），疱液（单纯疱疹），活体组织（肿瘤、尖锐湿疣等组织制成匀浆）。材料置"PBS"液中，保存于-20℃备用。
2． 提取标本中的DNA
将待检标本中加50 l裂解液（1×PCR缓冲液0.5％NP-0.05吐温-20）再加20 g/ml蛋白酶k混匀，55℃水浴1h以暴露DNA，95℃水浴中10min，灭活蛋白酶k，离心取上清液-20℃保存备用。
3． PCR扩增
各20pmol/L的引物，样品3～5 l，反应液1 l，无菌石蜡油覆盖，97℃变性10min，加入Tag DNA聚合酶后，按94℃变性，57℃退火，70℃各1min循环，进行30个循环后，最后72℃延伸5min。
4． 扩增产物的检测
取15 l扩增物经2％琼脂糖凝胶中电泳1h，置溴化锭染色后在紫外线灯下观察特异性的DNA紫光带为阳性。
不同的标本来源、不同的引物，所要求的反应条件不尽相同，具体操作方法，按试剂盒说明进行。
【注意事项】
由于PCR具有较强大的扩增能力，微量的污染都可导致假阳性，在操作的每一个环节都要避免污染的发生。, http://www.100md.com