北五味子有效组分的研究进展
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北五味子有效组分的研究进展
应国清*，俞志明，单剑峰，易喻
浙江工业大学药学院，杭州，310032
摘要:北五味子是常用传统中药。本文主要对北五味子粗多糖、挥发油、木脂素等有效组分的药理作用及提取工艺进行了综述。
关键词:北五味子，有效组分，提取工艺
Abstract: The fruit of Schisandra chinensis Baill. is a common use traditional Chinese medicine.
This article mainly summarizes the efficient composition's pharmacologic function and distilling technics of crude polysacchaid,essential oil and lignans .
Key words: Schisandra chinensis Turcz. Baill; efficient composition; distilling technics
0 前言
北五味子(Schisandra chinensis Turcz. Baill.)是著名的滋补性中药，因其果实甘、酸、辛、苦、咸五味具全，故名五味子[1]。又名五梅子、玄及、会及、山花椒等[2]。因主产于我国东北各地,也称为辽五味子[3]。始载于《神农本草经》，列为上品，具有益气强阴、养五脏、名目壮筋骨等多种功效[4]。对于五味子的科属问题一直有争议，传统认为五味子归属于木兰科。而刘玉壶将五味子科提升为五味子目；五味子科下设南五味子属和五味子属[5]。五味子属下隶多蕊五味子亚属、中华五味子亚属、团蕊五味子亚属、重瓣五味子亚属、五味子亚属和少蕊五味子亚属(共6亚属) [6]，因此五味子属于五味子科五味子属。
目前我国学者在五味子临床疗效、有效成分提取鉴定、药理作用及植物资源等作了大量的研究，然而涉及到具体的提取分离工艺以及分析方法，则相对而言比较杂乱无章。
本文将对现有资料的整理，对北五味子各有效组分的药理作用做简略介绍，对化学成分提取工艺、分析方法进行综述。
1 五味子的药理作用
五味子的药理研究中，较多的是五味子的各种提取液、煎剂或者浸膏。以下仅就有效组分的药理进行简要的介绍。
1.1五味子粗多糖的药理研究
五味子粗多糖(The coarse polysaccharides from schisandra chineesis,CPSC)含有五味子总多糖和18种以上氨基酸及16种以上微量元素[7]。
五味子粗多糖的初步药理研究表明[8]，五味子粗多糖能明显提高小鼠的耐缺氧能力，具有抗疲劳作用，亦能使正常小鼠胸腺和脾脏的重量增加，并增强小鼠静注胶体碳粒的廓清速率。说明北五味子粗多糖能提高机体对环境的适应能力和防御能力。对CCl4中毒小鼠肝组织丙二醛含量具有明显降低作用，体外实验对小鼠肝均浆脂质过氧化亦产生明显的抑制作用，此外，对部分肝切除小鼠再生有明显促进作用，同时能促进小鼠胆汁分泌，加速了肝内有毒物质的排泄，有利于保护肝脏[7,9]。可使CCl4肝损伤小鼠SGPT活力显著降低；肝糖元含量显著升高；使肝损伤小鼠戊巴比妥那睡眠时间显著缩短[10]。并且还具有升白细胞作用[11,12, 13]，以及对小鼠的免役兴奋作用[13,14]；抗衰老[15]，抑制肿瘤的生长，并具有预防和治疗癌症的潜在价值[16]。
然而，曾靖等人[17]研究发现，五味子多糖对小鼠肝糖原的合成无影响，但能使阿托品增加小鼠肝糖原合成的作用减弱甚至消失，此外五味子多糖对CCl4损伤小鼠肝脏所致的SGPT水平也无影响，由此推出，五味子多糖可能不是五味子制剂保肝作用的主要有效成分。
因此，对五味子粗多糖的研究有必要更加深入，明确其疗效。
1.2五味子木脂素的药理研究
北五味子含多种木脂素成分，包括五味子素、五味子甲素、五味子乙素(γ-五味子素)、五味子丙素、伪-γ-五味子素、五味子醇甲、醇乙、五味子酚、五味子酯甲、酯乙等化学成分[18]以及日本学者提取的戈米辛A、B、D、G、H、前戈米辛等木脂素成分[19]。
五味子醇乙、醇甲、甲素能使正常饥饿小鼠合成肝糖元的能力增加，其中醇乙作用最强。戈米辛A对应激性溃疡的抑制率约为50%，而五味子乙素有抑制胃分泌和利胆作用[19]。五味子甲素和五味子醇甲对小鼠CCl4肝损伤模型作用表明该两种木脂素增强了小鼠肝细胞抵抗CCl4毒性的能力[20] 20世纪70年代初,我国临床研究发现五味子木脂素能明显降低肝炎患者血清谷丙转氨酶(SGPT)水平,引起研究的热潮,并由此开发出治疗肝炎药物联苯双酯。除有明显保肝作用外,这类化合物还具有抗HIV病毒、抗氧化、保护中枢神经系统作用, 以及安定作用引起人们进一步研究的兴趣。从北五味子的果实中分离出来的一种芳基环辛烷类木脂素对HIV-1的逆转录具有一定的抑制作用,IC50=45μM。为了强化其生物活性,人们制备了它的卤代物Ⅰ、Ⅱ,并用于试验测试。Fijihashi等发现,这些化合物的EC50在0.1-0.5μM之间,其中化合物Ⅱ对HIV-1的逆转录的抑制作用比天然产物更具潜力及选择性,其IC50=1μM[21]。；五味子甲素体外能促进成骨细胞的增殖与分化[22]。五味子酚具有很强的抗氧化活性，可抑制Fe2+-半胱氨酸及NADPH-Vitc引起的肝脏微粒体脂质过氧化。γ-五味子素对癌细胞DNA、ATP和核蛋白代谢有影响。五味子乙素和五酚能拮抗雌二醇促进小鼠子宫总量增加的作用，放射免疫和高效液相法证实乙素和五酚能促进小鼠肝微粒代谢[3H]雌二醇速率[23]。五味子醇甲对中枢神经系统不但有安定作用，而且还有抗惊厥作用。腹腔注射明显延长小鼠戊巴比妥钠及巴比妥钠的睡眠时间，减少小鼠自主活动，并加强立血平及戊巴妥钠对自主活动的抑制作用，对抗咖啡因等对自主活动的兴奋作用。并抑制小鼠由电刺激或长期单居引起的激怒行为，对大鼠回避性条件反射及二级条件反射有选择性抑制作用,大剂量使大鼠产生木僵,该木僵可被脑室注射DA所对抗,从实验结果看来,醇甲有广泛中枢抑制作用,并且有安定药的特点[24]。五味子甲素、乙素、丙素、醇乙、酯乙可明显延长小鼠对戊巴比妥钠或环己巴比妥钠的睡眠时间，乙素及酯乙对小鼠的睡眠时间有先延长后缩短的双相性影响[25]。
1.3五味子挥发油的药理研究
原苏联学者报道五味子挥发油不含有醛和酮类成分，他们研究表明挥发油大部分为萜类成分(包括单萜类，含氧单萜类，倍半萜类，含氧倍半萜类)，此外尚有少量醇、酸等含氧成分。而芮和恺等研究发现从五味子挥发油中鉴定了29种化合物，占挥发油重量38.65%，除毕澄茄烯，依兰烯，防风根烯外，其余25种成分均属首次从五味子挥发油中发现，已提出的有sesquicarene,α-花柏烯，花柏醇等。研究认为，五味子挥发油主要成分为萜类化合物[26]。
五味子挥发油的药理作用研究的相对较少。研究发现，五味子挥发油能明显缩短戊巴比妥钠引起小鼠睡眠时间，且与中枢兴奋药士的宁无协同作用，它对肝细胞色素P-450具有明显诱导作用，说明五味子挥发油缩短戊巴比妥钠引起小鼠睡眠时间的机理与其加速戊巴比妥钠的代谢有关，而非对中枢神经系统的直接兴奋作用[19,27]。
2五味子化学成份的提取工艺及分析方法
介于以上有效组分的药理研究，以下具体介绍一下有效组分的提取工艺以及分析方法。
2.1五味子多糖提取工艺及分析方法
将五味子粉碎后，置索氏提取器中,依次用石油醚(30-60℃)、乙醚和80%乙醇回流提取4h。残渣挥干溶剂后，再以水回流提取4h，减压浓缩至一半体积，加入0.1%活性炭,脱色,过滤,滤液加入95%乙醇使溶液含醇80%,静置过夜,过滤,残渣用乙醚、无水乙醇反复洗涤,得五味子多糖。以葡萄糖作对照品，制作标准曲线。用苯酚-硫酸比色法测定多糖含量。最终测得五味子中多糖含量11.98%，平均回收率为102.13% [2]。
张兰杰等将北五味子在恒温70℃下，用稀NaOH溶液调pH=8,水提取三次。合并三次滤液,用薄膜旋转蒸发器浓缩。再经醇析、Savage法脱蛋白、脱脂、脱色、DEAE纤维素柱色谱等步骤,从北五味子中分离出两种多糖组分，硫酸-苯酚法测其含量测得北五味子中粗多糖含量6.1%。北五味子中两种纯多糖含量分别为0.387%,0.061%[28]。
采用不同的提取纯化工艺，对粗多糖的提取效果会产生影响。同时，多糖在纯化过程中的损失也会使测得的多糖含量有所差别，以及产地，采收季节等因素的影响。
2.2五味子木脂素的提取工艺及分析方法
史红波等人[29]对五味子甲素的提取采用了不同方法。①甲醇回流提取法：取五味子粉2g,加80ml甲醇,回流提取1h,离心分离,上清液减压浓缩至干,残留物用甲醇溶净并定容至25ml容量瓶中,待测。②氯仿回流提取法：取五味子粉2g,加80ml氯仿,其余过程同上。③甲醇-氯仿回流提取法：取五味子粉2g,加80ml甲醇-氯仿(2∶1)混合液,其余过程同上。④氯仿超声提取法：取五味子粉2g,加80ml氯仿,超声提取2次,每次20min合并滤液,减压挥干,残留物用甲醇溶解并定容至25ml容量瓶中,待测。⑤正己烷冷浸法：取五味子粉2g,加40ml正己烷,冷浸8h,倾出上清液(I),残渣中加40ml正己烷,冷浸4h,得上清液(II),残渣中再加40ml正己烷,冷浸4h,得上清液(III),弃去残渣,合并上清液(I-III),减压挥干,残留物用甲醇溶解并定容至25ml容量瓶中,待测。
分析采用HPLC法，色谱条件为：色谱柱：HyperilODS2柱(250×4.6mm)；流动相：甲醇-水(70∶30)；流速：1ml/min；检测波长：254nm；柱温：室温；测得五味子甲素的保留时间为21min。五味子甲素在0.04～0.2μg之间时呈线性相关，并有很好的线性条件。测定五味子甲素的含量结果表明：由数据处理及方差分析表明样品中五味子甲素含量顺序为①>③>②>⑤>④,表明①法含量最高即用甲醇回流提取法提取的较完全,可供制定提取五味子甲素及其制剂质量控制时参考。
除对五味子木脂素的常规提取外，刘本等人[30]，利用超临界CO2流体提取五味子中的五味子甲素。精密称取五味子粉末约0.6g,填满提取池。提取前,将装有样品的提取池置于所需操作温度下预热10min。提取条件：静态提取5min,然后动态提取至2h；提取温度分别为40、60和80℃；提取压力分别为10.1、15.2、20.2和25.3Mpa；液体CO2流量为2ml/min。用一个装有甲醇4ml的玻璃接受瓶收集提取物,并在瓶盖上连有一个C18小柱。每次提取完后,用CO2(2ml/min)和甲醇(0.5ml/min)冲洗提取系统(不包括提取池)5min,使沉积于管道中的提取物转移入接受瓶中,并用2ml甲醇将C18小柱中的分析物洗脱入该接受瓶。将该提取液转移到一个25ml容量瓶中,用甲醇稀释至刻度。分析前,将该溶液进一步稀释25倍。高效液相色谱的色谱条件：ODS2C18(250×4.6mm)柱；柱温35℃；流动相为乙腈-水-醋酸(70∶30∶1,v/v/v),流速为1ml/min；紫外检测波长为254nm；进样量20μl。对不同压力，不同提取温度下的提取率，提取速度常数比较可知，用超临界CO2经过0.5h提取,可提取该条件下大于90%的最大提取量,为在较大规模上代替常规有机溶剂提取五味子甲素提供了可能性。
对五味子中木脂素类成分常用醇提取、氯仿提取和水提取等方法,但这些方法存在提取液浓缩或仅提取了种子中1/6-1/5的总木脂素(水提取)等问题。超临界CO2提取作为一种有机溶剂替代提取技术,已用于提取该类成分。但超临界CO2提取技术是一种高压技术,设备要求较高,且昂贵。法多索溶剂是一类新的溶剂系统,主要由1,1,1,2-四氟乙烷组成,已被用于提取天然药物,以及食品和环境介质中的分析物。提取装置是一个手握式提取器,可提取样品量最大到100g。
刘本等人[31]，使用这种低压冷提取装置提取五味子五味子甲素,并与10%甲醇调节的超临界CO2的提取率进行比较。法多索A(1,1,1,2-四氟乙烷),法多索B(法多索A加丙烷),法多索D(法多索A加乙醚),均由英国Advanced Phytonics Ltd.提供。精密称取约0.6g五味子粉末,放入带滤器的法多索提取器中,加10ml法多索溶剂(A,B或D),在室温下振摇这个提取器30min,然后倒置该提取器,并与一个密闭的玻璃瓶相连,小心打开压力阀,让含有五味子甲素的法多索溶液进入这个玻璃瓶。该瓶中的法多索溶剂可在室温下用一个循环装置完全回收,而将提取物留在该瓶中。每个样品重复提取3次。提取物用甲醇溶解,并转移入一个25ml量瓶中,用甲醇稀释至刻度。分析前该溶液再稀释25倍。高效液相色谱仪用于分析提取物。色谱条件:色谱柱:ODS2C18(4.6mm×25cm),流动相：乙腈-水-醋酸(70∶30∶1,v/v/v),流速:1ml/min,紫外检测波长254nm,进样量:20μl。在五味子甲素浓度范围为0.43-43μg/ml时,其面积积分值与浓度呈线性关系。分析结果是法多索A,B或D经过3次1.5h的提取,可提取该条件下约96%的量,这3种溶剂系统的提取曲线相似。比较法多索溶剂和10%甲醇调节的超临界CO2从五味子中提取五味子甲素的提取率。与10%甲醇调节的超临界CO2的提取率相比较,法多索溶剂可得到约94%的提取回收率。法多索溶剂是一类新的溶剂系统,主要由非-氯氟烷组成,不破坏臭氧层,无环境污染。与超临界流体提取设备相比,其设备较便宜,由于其操作是在常温下进行,故能耗较低。从研究中可看到,对于每个样品的提取,使用30mk法多索溶剂,并且该溶剂能在室温下全部回收;对于超临界流体提取,需用60ml液态二氧化碳和6ml甲醇。两类溶剂系统的提取率相近。所以法多索溶剂技术可望用于较大规模提取五味子甲素等木脂素类成分。
除HPLC法对五味子木脂素成分的检测外。也采用TLC法、分光光度法等。......（后略) ......
北五味子有效组分的研究进展
应国清*，俞志明，单剑峰，易喻
浙江工业大学药学院，杭州，310032
摘要:北五味子是常用传统中药。本文主要对北五味子粗多糖、挥发油、木脂素等有效组分的药理作用及提取工艺进行了综述。
关键词:北五味子，有效组分，提取工艺
Abstract: The fruit of Schisandra chinensis Baill. is a common use traditional Chinese medicine.
This article mainly summarizes the efficient composition's pharmacologic function and distilling technics of crude polysacchaid,essential oil and lignans .
Key words: Schisandra chinensis Turcz. Baill; efficient composition; distilling technics
0 前言
北五味子(Schisandra chinensis Turcz. Baill.)是著名的滋补性中药，因其果实甘、酸、辛、苦、咸五味具全，故名五味子[1]。又名五梅子、玄及、会及、山花椒等[2]。因主产于我国东北各地,也称为辽五味子[3]。始载于《神农本草经》，列为上品，具有益气强阴、养五脏、名目壮筋骨等多种功效[4]。对于五味子的科属问题一直有争议，传统认为五味子归属于木兰科。而刘玉壶将五味子科提升为五味子目；五味子科下设南五味子属和五味子属[5]。五味子属下隶多蕊五味子亚属、中华五味子亚属、团蕊五味子亚属、重瓣五味子亚属、五味子亚属和少蕊五味子亚属(共6亚属) [6]，因此五味子属于五味子科五味子属。
目前我国学者在五味子临床疗效、有效成分提取鉴定、药理作用及植物资源等作了大量的研究，然而涉及到具体的提取分离工艺以及分析方法，则相对而言比较杂乱无章。
本文将对现有资料的整理，对北五味子各有效组分的药理作用做简略介绍，对化学成分提取工艺、分析方法进行综述。
1 五味子的药理作用
五味子的药理研究中，较多的是五味子的各种提取液、煎剂或者浸膏。以下仅就有效组分的药理进行简要的介绍。
1.1五味子粗多糖的药理研究
五味子粗多糖(The coarse polysaccharides from schisandra chineesis,CPSC)含有五味子总多糖和18种以上氨基酸及16种以上微量元素[7]。
五味子粗多糖的初步药理研究表明[8]，五味子粗多糖能明显提高小鼠的耐缺氧能力，具有抗疲劳作用，亦能使正常小鼠胸腺和脾脏的重量增加，并增强小鼠静注胶体碳粒的廓清速率。说明北五味子粗多糖能提高机体对环境的适应能力和防御能力。对CCl4中毒小鼠肝组织丙二醛含量具有明显降低作用，体外实验对小鼠肝均浆脂质过氧化亦产生明显的抑制作用，此外，对部分肝切除小鼠再生有明显促进作用，同时能促进小鼠胆汁分泌，加速了肝内有毒物质的排泄，有利于保护肝脏[7,9]。可使CCl4肝损伤小鼠SGPT活力显著降低；肝糖元含量显著升高；使肝损伤小鼠戊巴比妥那睡眠时间显著缩短[10]。并且还具有升白细胞作用[11,12, 13]，以及对小鼠的免役兴奋作用[13,14]；抗衰老[15]，抑制肿瘤的生长，并具有预防和治疗癌症的潜在价值[16]。
然而，曾靖等人[17]研究发现，五味子多糖对小鼠肝糖原的合成无影响，但能使阿托品增加小鼠肝糖原合成的作用减弱甚至消失，此外五味子多糖对CCl4损伤小鼠肝脏所致的SGPT水平也无影响，由此推出，五味子多糖可能不是五味子制剂保肝作用的主要有效成分。
因此，对五味子粗多糖的研究有必要更加深入，明确其疗效。
1.2五味子木脂素的药理研究
北五味子含多种木脂素成分，包括五味子素、五味子甲素、五味子乙素(γ-五味子素)、五味子丙素、伪-γ-五味子素、五味子醇甲、醇乙、五味子酚、五味子酯甲、酯乙等化学成分[18]以及日本学者提取的戈米辛A、B、D、G、H、前戈米辛等木脂素成分[19]。
五味子醇乙、醇甲、甲素能使正常饥饿小鼠合成肝糖元的能力增加，其中醇乙作用最强。戈米辛A对应激性溃疡的抑制率约为50%，而五味子乙素有抑制胃分泌和利胆作用[19]。五味子甲素和五味子醇甲对小鼠CCl4肝损伤模型作用表明该两种木脂素增强了小鼠肝细胞抵抗CCl4毒性的能力[20] 20世纪70年代初,我国临床研究发现五味子木脂素能明显降低肝炎患者血清谷丙转氨酶(SGPT)水平,引起研究的热潮,并由此开发出治疗肝炎药物联苯双酯。除有明显保肝作用外,这类化合物还具有抗HIV病毒、抗氧化、保护中枢神经系统作用, 以及安定作用引起人们进一步研究的兴趣。从北五味子的果实中分离出来的一种芳基环辛烷类木脂素对HIV-1的逆转录具有一定的抑制作用,IC50=45μM。为了强化其生物活性,人们制备了它的卤代物Ⅰ、Ⅱ,并用于试验测试。Fijihashi等发现,这些化合物的EC50在0.1-0.5μM之间,其中化合物Ⅱ对HIV-1的逆转录的抑制作用比天然产物更具潜力及选择性,其IC50=1μM[21]。；五味子甲素体外能促进成骨细胞的增殖与分化[22]。五味子酚具有很强的抗氧化活性，可抑制Fe2+-半胱氨酸及NADPH-Vitc引起的肝脏微粒体脂质过氧化。γ-五味子素对癌细胞DNA、ATP和核蛋白代谢有影响。五味子乙素和五酚能拮抗雌二醇促进小鼠子宫总量增加的作用，放射免疫和高效液相法证实乙素和五酚能促进小鼠肝微粒代谢[3H]雌二醇速率[23]。五味子醇甲对中枢神经系统不但有安定作用，而且还有抗惊厥作用。腹腔注射明显延长小鼠戊巴比妥钠及巴比妥钠的睡眠时间，减少小鼠自主活动，并加强立血平及戊巴妥钠对自主活动的抑制作用，对抗咖啡因等对自主活动的兴奋作用。并抑制小鼠由电刺激或长期单居引起的激怒行为，对大鼠回避性条件反射及二级条件反射有选择性抑制作用,大剂量使大鼠产生木僵,该木僵可被脑室注射DA所对抗,从实验结果看来,醇甲有广泛中枢抑制作用,并且有安定药的特点[24]。五味子甲素、乙素、丙素、醇乙、酯乙可明显延长小鼠对戊巴比妥钠或环己巴比妥钠的睡眠时间，乙素及酯乙对小鼠的睡眠时间有先延长后缩短的双相性影响[25]。
1.3五味子挥发油的药理研究
原苏联学者报道五味子挥发油不含有醛和酮类成分，他们研究表明挥发油大部分为萜类成分(包括单萜类，含氧单萜类，倍半萜类，含氧倍半萜类)，此外尚有少量醇、酸等含氧成分。而芮和恺等研究发现从五味子挥发油中鉴定了29种化合物，占挥发油重量38.65%，除毕澄茄烯，依兰烯，防风根烯外，其余25种成分均属首次从五味子挥发油中发现，已提出的有sesquicarene,α-花柏烯，花柏醇等。研究认为，五味子挥发油主要成分为萜类化合物[26]。
五味子挥发油的药理作用研究的相对较少。研究发现，五味子挥发油能明显缩短戊巴比妥钠引起小鼠睡眠时间，且与中枢兴奋药士的宁无协同作用，它对肝细胞色素P-450具有明显诱导作用，说明五味子挥发油缩短戊巴比妥钠引起小鼠睡眠时间的机理与其加速戊巴比妥钠的代谢有关，而非对中枢神经系统的直接兴奋作用[19,27]。
2五味子化学成份的提取工艺及分析方法
介于以上有效组分的药理研究，以下具体介绍一下有效组分的提取工艺以及分析方法。
2.1五味子多糖提取工艺及分析方法
将五味子粉碎后，置索氏提取器中,依次用石油醚(30-60℃)、乙醚和80%乙醇回流提取4h。残渣挥干溶剂后，再以水回流提取4h，减压浓缩至一半体积，加入0.1%活性炭,脱色,过滤,滤液加入95%乙醇使溶液含醇80%,静置过夜,过滤,残渣用乙醚、无水乙醇反复洗涤,得五味子多糖。以葡萄糖作对照品，制作标准曲线。用苯酚-硫酸比色法测定多糖含量。最终测得五味子中多糖含量11.98%，平均回收率为102.13% [2]。
张兰杰等将北五味子在恒温70℃下，用稀NaOH溶液调pH=8,水提取三次。合并三次滤液,用薄膜旋转蒸发器浓缩。再经醇析、Savage法脱蛋白、脱脂、脱色、DEAE纤维素柱色谱等步骤,从北五味子中分离出两种多糖组分，硫酸-苯酚法测其含量测得北五味子中粗多糖含量6.1%。北五味子中两种纯多糖含量分别为0.387%,0.061%[28]。
采用不同的提取纯化工艺，对粗多糖的提取效果会产生影响。同时，多糖在纯化过程中的损失也会使测得的多糖含量有所差别，以及产地，采收季节等因素的影响。
2.2五味子木脂素的提取工艺及分析方法
史红波等人[29]对五味子甲素的提取采用了不同方法。①甲醇回流提取法：取五味子粉2g,加80ml甲醇,回流提取1h,离心分离,上清液减压浓缩至干,残留物用甲醇溶净并定容至25ml容量瓶中,待测。②氯仿回流提取法：取五味子粉2g,加80ml氯仿,其余过程同上。③甲醇-氯仿回流提取法：取五味子粉2g,加80ml甲醇-氯仿(2∶1)混合液,其余过程同上。④氯仿超声提取法：取五味子粉2g,加80ml氯仿,超声提取2次,每次20min合并滤液,减压挥干,残留物用甲醇溶解并定容至25ml容量瓶中,待测。⑤正己烷冷浸法：取五味子粉2g,加40ml正己烷,冷浸8h,倾出上清液(I),残渣中加40ml正己烷,冷浸4h,得上清液(II),残渣中再加40ml正己烷,冷浸4h,得上清液(III),弃去残渣,合并上清液(I-III),减压挥干,残留物用甲醇溶解并定容至25ml容量瓶中,待测。
分析采用HPLC法，色谱条件为：色谱柱：HyperilODS2柱(250×4.6mm)；流动相：甲醇-水(70∶30)；流速：1ml/min；检测波长：254nm；柱温：室温；测得五味子甲素的保留时间为21min。五味子甲素在0.04～0.2μg之间时呈线性相关，并有很好的线性条件。测定五味子甲素的含量结果表明：由数据处理及方差分析表明样品中五味子甲素含量顺序为①>③>②>⑤>④,表明①法含量最高即用甲醇回流提取法提取的较完全,可供制定提取五味子甲素及其制剂质量控制时参考。
除对五味子木脂素的常规提取外，刘本等人[30]，利用超临界CO2流体提取五味子中的五味子甲素。精密称取五味子粉末约0.6g,填满提取池。提取前,将装有样品的提取池置于所需操作温度下预热10min。提取条件：静态提取5min,然后动态提取至2h；提取温度分别为40、60和80℃；提取压力分别为10.1、15.2、20.2和25.3Mpa；液体CO2流量为2ml/min。用一个装有甲醇4ml的玻璃接受瓶收集提取物,并在瓶盖上连有一个C18小柱。每次提取完后,用CO2(2ml/min)和甲醇(0.5ml/min)冲洗提取系统(不包括提取池)5min,使沉积于管道中的提取物转移入接受瓶中,并用2ml甲醇将C18小柱中的分析物洗脱入该接受瓶。将该提取液转移到一个25ml容量瓶中,用甲醇稀释至刻度。分析前,将该溶液进一步稀释25倍。高效液相色谱的色谱条件：ODS2C18(250×4.6mm)柱；柱温35℃；流动相为乙腈-水-醋酸(70∶30∶1,v/v/v),流速为1ml/min；紫外检测波长为254nm；进样量20μl。对不同压力，不同提取温度下的提取率，提取速度常数比较可知，用超临界CO2经过0.5h提取,可提取该条件下大于90%的最大提取量,为在较大规模上代替常规有机溶剂提取五味子甲素提供了可能性。
对五味子中木脂素类成分常用醇提取、氯仿提取和水提取等方法,但这些方法存在提取液浓缩或仅提取了种子中1/6-1/5的总木脂素(水提取)等问题。超临界CO2提取作为一种有机溶剂替代提取技术,已用于提取该类成分。但超临界CO2提取技术是一种高压技术,设备要求较高,且昂贵。法多索溶剂是一类新的溶剂系统,主要由1,1,1,2-四氟乙烷组成,已被用于提取天然药物,以及食品和环境介质中的分析物。提取装置是一个手握式提取器,可提取样品量最大到100g。
刘本等人[31]，使用这种低压冷提取装置提取五味子五味子甲素,并与10%甲醇调节的超临界CO2的提取率进行比较。法多索A(1,1,1,2-四氟乙烷),法多索B(法多索A加丙烷),法多索D(法多索A加乙醚),均由英国Advanced Phytonics Ltd.提供。精密称取约0.6g五味子粉末,放入带滤器的法多索提取器中,加10ml法多索溶剂(A,B或D),在室温下振摇这个提取器30min,然后倒置该提取器,并与一个密闭的玻璃瓶相连,小心打开压力阀,让含有五味子甲素的法多索溶液进入这个玻璃瓶。该瓶中的法多索溶剂可在室温下用一个循环装置完全回收,而将提取物留在该瓶中。每个样品重复提取3次。提取物用甲醇溶解,并转移入一个25ml量瓶中,用甲醇稀释至刻度。分析前该溶液再稀释25倍。高效液相色谱仪用于分析提取物。色谱条件:色谱柱:ODS2C18(4.6mm×25cm),流动相：乙腈-水-醋酸(70∶30∶1,v/v/v),流速:1ml/min,紫外检测波长254nm,进样量:20μl。在五味子甲素浓度范围为0.43-43μg/ml时,其面积积分值与浓度呈线性关系。分析结果是法多索A,B或D经过3次1.5h的提取,可提取该条件下约96%的量,这3种溶剂系统的提取曲线相似。比较法多索溶剂和10%甲醇调节的超临界CO2从五味子中提取五味子甲素的提取率。与10%甲醇调节的超临界CO2的提取率相比较,法多索溶剂可得到约94%的提取回收率。法多索溶剂是一类新的溶剂系统,主要由非-氯氟烷组成,不破坏臭氧层,无环境污染。与超临界流体提取设备相比,其设备较便宜,由于其操作是在常温下进行,故能耗较低。从研究中可看到,对于每个样品的提取,使用30mk法多索溶剂,并且该溶剂能在室温下全部回收;对于超临界流体提取,需用60ml液态二氧化碳和6ml甲醇。两类溶剂系统的提取率相近。所以法多索溶剂技术可望用于较大规模提取五味子甲素等木脂素类成分。
除HPLC法对五味子木脂素成分的检测外。也采用TLC法、分光光度法等。......（后略) ......
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