利用脐带血穿刺标本产前诊断杜氏肌营养不良症1例
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利用脐带血穿刺标本产前诊断杜氏肌营养不良症1例
北京大学人民医院 刘国莉* 赵耘 刘春雨 黄振宇 张丽江
孕妇34岁，妊1产0，籍贯上海，家族中其舅舅、弟弟均患杜氏肌营养不良症(Duchenne muscular dystrophy，DMD)，皆于少年期死亡。本人非近亲结婚，孕18周，要求产前诊断，转入我院。孕期无特殊，B超提示胎儿与孕周相符、未见异常。入院后行B超引导下羊膜腔穿刺，诊断胎儿为男性后行胎儿脐带血穿刺，抽取胎儿血化验肌酸磷酸肌酶，并按常规方法提取DNA。同时取孕妇外周血做DNA检测。按照Beggs[1]和Chamberlain[2]方法设计了16对引物，包含肌营养不良蛋白(dystrophin)基因启动子(Pm)、外显子3、6、8、13、17、19、43-52(46、51除外)及60易发生基因缺失热点区(引物由北京三博远志生物技术有限公司提供)。DNA PCR扩增均分两次在2个反应管中进行，分别用9对引物[1]和7对引物[2],前者方法同文献1，后者方法与文献2大体相同，只是将退火温度改为54℃。取反应液10μl和DNA 大小标记物同时点样于1.4%琼脂糖凝胶中，80V电压电泳1小时。结果：孕妇外周血和胎儿血结果见表1，显示脐血CPK 523U/L，CK-MB 32U/L，LDH 403 U/L均显著升高，AST轻度异常，孕妇相应酶学亦有轻度改变。PCR扩增结果如图1示：胎儿外显子47、50、52、45、48、49有基因缺失，孕妇为携带者，相应条带较正常阳性对照的条带有减弱。向家属交代病情后，要求其终止妊娠，于孕23周行药物引产，娩一男死胎，外观未见明显异常。
1. DNA Marker 2. 阳性对照 3. 孕妇 1. DNA Marker 2. 阳性对照 3. 孕妇
4. 胎儿 5. 阴性对照 4. 胎儿 5. 阴性对照
图1 多重PCR扩增电泳结果
表1：孕妇及胎儿相关肌酶指标测定结果
受检对象ALT(U/L)AST(U/L)CPK(U/L)LDH(U/L)α-羟丁酸脱氢酶(U/L)CPK-MB(U/L)孕 妇
胎 儿20
223
45719
523224
403150
24911
32各指标
正常值0~400~4024~200114~24095~2700~5讨论：
DMD是一种严重致死性X连锁隐性遗传病，发病率为1/3500活男婴，临床表现以肌肉进行性萎缩和无力为特征，患者一般在20岁前死亡。由于本病目前尚无有效的治疗方法，只能进行产前基因诊断以杜绝患儿的出生。DMD基因位于Xp21区，长2200kb，cDNA全长14kb，含79个外显子。已报道65%的基因突变为大片段缺失，5～10%为复制，25～30%为点突变、小缺失或小插入，基因突变的大热点区为外显子44～53、小热点区位于基因5'端[3]。目前的基因检测方法有多重PCR、定量多重PCR、Southern杂交、 RT-PCR、FISH等。国内、外关于DMD产前基因诊断已有报道[4-6]：王敏等[4]应用荧光标记聚合酶链反应扩增9个微卫星片段，进行基因型分析，成功诊断了1例DMD患病胎儿；曾溢滔等[5]在取得中国人Xp21区限制性片段长度多态性基础上，应用连锁分析对2例DMD高危妊娠进行了产前诊断。鉴于60%的患者的基因异常为缺失，故建立1种简便而有效的缺失检出方法具有重要意义。Beggs和Chamberlain设计了18对引物[1, 2]，可使缺失病例的检出率达到90%以上。本文中未包含该基因的外显子4、12、51，增添了外显子50来进行PCR扩增，结果显示缺失的分布主要集中在外显子47、50、52、45、48、49，与国外的基因缺失热点区分布相似，结合脐血肌酶结果，考虑该胎儿为DMD患儿，予以终止妊娠。Emery等[7]对高危DMD的胎儿血的CPK数值及肌肉活检结果进行了研究，结果提示单纯根据胎儿血肌酶结果诊断DMD存在假阴性，应结合病理检查或分子生物学实验结果来综合判断。据我们所知，本实验是国内第一例应用脐带血穿刺标本，同时进行胎儿肌酶化验及基因检测来诊断DMD患病胎儿。实验中应用的多重PCR方法，在数小时内可检出DMD基因的缺失，且操作简便，勿需特别仪器，扩增后对结果的判定也比较直观和容易，因此多重PCR是一种简便、快速、适于推广的检测DMD基因缺失的方法。但该方法不能解决非缺失病例的诊断，可进一步通过扩增微卫星片段或在限制性片段长度多态性基础上应用连锁分析进行DMD的产前诊断。
由于孕妇为携带者，出院后需在指导下进行下次妊娠：(1)人工受精，进行精子性别选择，去除"Y"精子，使其孕女婴，可靠性约80%；同时对女婴进行产前诊断，检出致病基因携带者的几率为50%。(2)如受孕仍为男性，再次发生同样疾病的可能性为50%，故必须经产前诊断，如可排除致病基因缺陷，证实该男胎正常，其后代可不再受此病困扰。
参考文献：
1. Beggs AH, Koenig M, Boyce FM, et al. Detection of 98% of DMD/BMD gene deletions by polymerase chain reaction. Hum Genet, 1990, 86: 45-48.
2. Chamberlain JS, Gibbs RA, Ranier JE, et al. Deletion screening of the Duchenne muscular dystrophy locus via multiplex DNA amplification. Nucleic Acids Res, 1988, 23: 11141-11156 ......
利用脐带血穿刺标本产前诊断杜氏肌营养不良症1例
北京大学人民医院 刘国莉* 赵耘 刘春雨 黄振宇 张丽江
孕妇34岁，妊1产0，籍贯上海，家族中其舅舅、弟弟均患杜氏肌营养不良症(Duchenne muscular dystrophy，DMD)，皆于少年期死亡。本人非近亲结婚，孕18周，要求产前诊断，转入我院。孕期无特殊，B超提示胎儿与孕周相符、未见异常。入院后行B超引导下羊膜腔穿刺，诊断胎儿为男性后行胎儿脐带血穿刺，抽取胎儿血化验肌酸磷酸肌酶，并按常规方法提取DNA。同时取孕妇外周血做DNA检测。按照Beggs[1]和Chamberlain[2]方法设计了16对引物，包含肌营养不良蛋白(dystrophin)基因启动子(Pm)、外显子3、6、8、13、17、19、43-52(46、51除外)及60易发生基因缺失热点区(引物由北京三博远志生物技术有限公司提供)。DNA PCR扩增均分两次在2个反应管中进行，分别用9对引物[1]和7对引物[2],前者方法同文献1，后者方法与文献2大体相同，只是将退火温度改为54℃。取反应液10μl和DNA 大小标记物同时点样于1.4%琼脂糖凝胶中，80V电压电泳1小时。结果：孕妇外周血和胎儿血结果见表1，显示脐血CPK 523U/L，CK-MB 32U/L，LDH 403 U/L均显著升高，AST轻度异常，孕妇相应酶学亦有轻度改变。PCR扩增结果如图1示：胎儿外显子47、50、52、45、48、49有基因缺失，孕妇为携带者，相应条带较正常阳性对照的条带有减弱。向家属交代病情后，要求其终止妊娠，于孕23周行药物引产，娩一男死胎，外观未见明显异常。
1. DNA Marker 2. 阳性对照 3. 孕妇 1. DNA Marker 2. 阳性对照 3. 孕妇
4. 胎儿 5. 阴性对照 4. 胎儿 5. 阴性对照
图1 多重PCR扩增电泳结果
表1：孕妇及胎儿相关肌酶指标测定结果
受检对象ALT(U/L)AST(U/L)CPK(U/L)LDH(U/L)α-羟丁酸脱氢酶(U/L)CPK-MB(U/L)孕 妇
胎 儿20
223
45719
523224
403150
24911
32各指标
正常值0~400~4024~200114~24095~2700~5讨论：
DMD是一种严重致死性X连锁隐性遗传病，发病率为1/3500活男婴，临床表现以肌肉进行性萎缩和无力为特征，患者一般在20岁前死亡。由于本病目前尚无有效的治疗方法，只能进行产前基因诊断以杜绝患儿的出生。DMD基因位于Xp21区，长2200kb，cDNA全长14kb，含79个外显子。已报道65%的基因突变为大片段缺失，5～10%为复制，25～30%为点突变、小缺失或小插入，基因突变的大热点区为外显子44～53、小热点区位于基因5'端[3]。目前的基因检测方法有多重PCR、定量多重PCR、Southern杂交、 RT-PCR、FISH等。国内、外关于DMD产前基因诊断已有报道[4-6]：王敏等[4]应用荧光标记聚合酶链反应扩增9个微卫星片段，进行基因型分析，成功诊断了1例DMD患病胎儿；曾溢滔等[5]在取得中国人Xp21区限制性片段长度多态性基础上，应用连锁分析对2例DMD高危妊娠进行了产前诊断。鉴于60%的患者的基因异常为缺失，故建立1种简便而有效的缺失检出方法具有重要意义。Beggs和Chamberlain设计了18对引物[1, 2]，可使缺失病例的检出率达到90%以上。本文中未包含该基因的外显子4、12、51，增添了外显子50来进行PCR扩增，结果显示缺失的分布主要集中在外显子47、50、52、45、48、49，与国外的基因缺失热点区分布相似，结合脐血肌酶结果，考虑该胎儿为DMD患儿，予以终止妊娠。Emery等[7]对高危DMD的胎儿血的CPK数值及肌肉活检结果进行了研究，结果提示单纯根据胎儿血肌酶结果诊断DMD存在假阴性，应结合病理检查或分子生物学实验结果来综合判断。据我们所知，本实验是国内第一例应用脐带血穿刺标本，同时进行胎儿肌酶化验及基因检测来诊断DMD患病胎儿。实验中应用的多重PCR方法，在数小时内可检出DMD基因的缺失，且操作简便，勿需特别仪器，扩增后对结果的判定也比较直观和容易，因此多重PCR是一种简便、快速、适于推广的检测DMD基因缺失的方法。但该方法不能解决非缺失病例的诊断，可进一步通过扩增微卫星片段或在限制性片段长度多态性基础上应用连锁分析进行DMD的产前诊断。
由于孕妇为携带者，出院后需在指导下进行下次妊娠：(1)人工受精，进行精子性别选择，去除"Y"精子，使其孕女婴，可靠性约80%；同时对女婴进行产前诊断，检出致病基因携带者的几率为50%。(2)如受孕仍为男性，再次发生同样疾病的可能性为50%，故必须经产前诊断，如可排除致病基因缺陷，证实该男胎正常，其后代可不再受此病困扰。
参考文献：
1. Beggs AH, Koenig M, Boyce FM, et al. Detection of 98% of DMD/BMD gene deletions by polymerase chain reaction. Hum Genet, 1990, 86: 45-48.
2. Chamberlain JS, Gibbs RA, Ranier JE, et al. Deletion screening of the Duchenne muscular dystrophy locus via multiplex DNA amplification. Nucleic Acids Res, 1988, 23: 11141-11156 ......
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