内源性哇巴因在大鼠体内的免疫组织化学定位研究
http://www.100md.com
曲毅. 吕卓人. 张明娟. 刘梅颜.
内源性哇巴因.肾上腺皮质激素.免疫组织化学.
参见附件(257kb)。
作者：曲毅 吕卓人 张明娟 刘梅颜
单位：(西安医科大学第一附属医院心内科 西安 710061)
关键词：内源性哇巴因；肾上腺皮质激素；免疫组织化学
西安医科大学学报000205 摘要 目的 探讨内源性哇巴因(Endogenous ouabain,EO)在SD大鼠体内的组织学定位。方法 采用高度特异的抗哇巴因兔血清，用免疫组织化学ABC法观察EO在大鼠体内的分布。结果 免疫组化染色显示在SD大鼠的肾上腺皮质内侧网状带可以观察到丰富的哇巴因免疫反应阳性物质，垂体后叶有较弱的哇巴因免疫反应阳性物质，而下丘脑、肾脏、心肌等组织中并未发现有哇巴因免疫反应阳性物质存在。结论 表明EO主要存在于SD大鼠肾上腺皮质网状带，为EO作为一种新的肾上腺皮质激素提供了形态学依据。
中图分类号 Q454；R335+.4 文献标识码 A 文章编号 0258-0659(2000)02-0104-03
Immunocytochemical localization of endogenous ouabain in the tissues of SD rats
Qu Yi Lü Zhuoren Zhang Mingquan
(Department of Cardiology,First Affiliated Hospital,Xi′an Medical University,Xi′an 710061,China)
ABSTRACT Objective To observe the localization of endogenous ouabain(EO) in the some tissues of SD rats.Methods Immunohistochemical ABC method was used with a high-specify rabbit antiserum against ouabain.Results Ouabain-like immunoreactivities (OLI) were observed in the inner zone of adrenal cortex,known as the zone reticularis.The low level of OLI could be found in the posterior pituitary of SD rat, and no OLI in the hypothalamus, kidney, cardiac muscle and artery.Conclusion OLI were located in the zone reticularis of rat adrenal cortex.This morphological evidence supports that EO is a novel adrenocortical steroid hormone.
KEY WORDS endogenous ouabain adrenocortical hormone immunohistochemistry
内源性哇巴因(Endogenous ouabain,EO)是一种存在于人和哺乳动物组织和血浆中的内源性Na+，K+-ATP酶抑制物，具有调节钠代谢、血管张力和心肌收缩等生理和病理作用，在高血压和心力衰竭等心血管疾病的发生和发展中起着重要作用[1]。近年来对大鼠肾上腺组织和牛肾上腺皮质细胞培养液中EO的含量检测及临床研究报告表明肾上腺皮质是EO的主要来源[2]，但目前尚缺乏关于EO在哺乳动物肾上腺组织分布的形态学证据。本研究采用高度特异的抗哇巴因兔血清，用免疫组织化学ABC法对EO在Sprague-Dawley(SD)大鼠肾上腺、垂体、下丘脑等组织的分布进行观察，为确定EO是一种新的肾上腺皮质激素提供形态学依据。
1 材料和方法
1.1 主要试剂及标本处理
抗哇巴因兔血清由美国Maryland大学医学院高血压研究中心Hamlyn教授惠赠[3]，该抗体与地高辛的交叉反应率为5.2%，与醛固酮、皮质醇和脱氧皮质酮等肾上腺皮质激素的交叉反应率均<0.01%。免疫组织化学ABC试剂盒为美国Vector公司(编号PK6100)。哇巴因及二甲基联苯胺均购自美国Sigma公司。12只成年雄性SD大鼠(体重180～220g，第四军医大学动物中心提供)，用戊巴比妥钠腹腔注射麻醉(50mg/kg)，先经左心室灌注40g/L多聚甲醛-磷酸盐缓冲液(0.1mol/L PB,pH 7.4)300ml后，立即取肾上腺、垂体、下丘脑(前界为视交叉后缘，后界为乳头体后缘)、肾脏、心肌、腹主动脉和股动脉置入同样固定液中后固定1.5h，再浸入200g/L的蔗糖PB溶液中4℃过夜。-20℃恒冷箱切片机中连续冰冻切片，片厚12～18μm。1.2 免疫组织化学ABC法染色
按免疫组织化学ABC法进行染色：体积分数为0.05正常羊血清孵育30min后，加入抗哇巴因兔血清(1∶6 000)，4℃孵育48h；第二抗体为生物素标记的羊抗兔IgG(1∶200),室温下孵育3h；ABC复合物中(1∶100)室温下孵育3h，用二甲基联苯胺-硫酸镍铵加强法进行显色[4]。然后干燥、脱水、透明、DPX封片，Olympus显微镜下观察、照相。
1.3 免疫组织化学吸收实验
将10-6mol/L哇巴因与工作浓度(1∶6 000)的抗哇巴因兔血清混匀，4℃孵育24h，然后离心(3 000r/min,15min)，取上清液替代第一抗体进行染色。阴性对照实验用正常兔血清替代第一抗体进行组化染色。
2 结 果
内源性哇巴因在SD大鼠各组织的免疫组织化学染色结果见表1，哇巴因免疫反应阳性物质主要存在于大鼠的肾上腺皮质网状带。
表1 哇巴因免疫反应阳性物质在SD大鼠各组织的分布 组织类型
染色强度
组织类型
染色强度
肾上腺皮质
垂体前叶
-
球状带
-
中间叶
-
束状带
-
后叶
+
网状带
心房肌
-
肾上腺髓质
-
心室肌
-
下丘脑
-
腹主动脉
-
肾 脏
-
股动脉
-
注：染色强度用“-”～“”表示。“-”代表阴性，“+”代表弱阳性，“”代表阳性，“”代表强阳性
图1 哇巴因免疫反应阳性物质在SD大鼠肾上腺皮质的分布 髓质 ABC法， ×40
图2 哇巴因免疫反应阳性物质在SD大鼠肾上腺皮质的分布(箭头所示) 髓质 ABC法， ×100
图3 用10-6mol/L哇巴因做的大鼠肾上腺皮质吸收实验 ABC法， ×100
图4 哇巴因免疫反应阳性物质在SD大鼠垂体的分布 A：垂体前叶，P：垂体后叶，ABC法， ×40
图5 哇巴因免疫反应阳性物质在SD大鼠垂体后叶的分布(箭头所示) ABC法， ×100
图6 哇巴因免疫反应阳性物质在SD大鼠下丘脑的分布 3V：第三脑室，ABC法， ×40
在SD大鼠肾上腺皮质内侧可以观察到丰富的呈蓝黑色哇巴因免疫反应阳性物质，这些阳性物质主要存在于皮质内侧的网状带，呈点状和条索状分布于细胞质中(见图1，2)。在皮质外侧球状带、束状带以及髓质均未发现哇巴因免疫反应阳性物质的存在。吸收实验呈免疫反应阴性(见图3)。垂体后叶可以观察到较弱的哇巴因免疫反应阳性物质，而垂体前叶和中间叶中没有观察到哇巴因免疫反应阳性物质的存在(见图4，5)。在下丘脑未观察到哇巴因免疫反应阳性物质存在(见图6)。
3 讨 论
大量研究显示哺乳动物体内存在着一种内源性钠泵抑制物(Endogenous sodium pump inhibitor, ESPI)，在水钠代谢和血压调节等方面具有重要的生理和病理生理作用。1991年Hamlyn等率先提出这种ESPI与植物来源的哇巴因无法区别，认为其就是哇巴因或哇巴因极其相似的异构体[5]。近年来采用3H-哇巴因放免法研究发现包括人在内的几种哺乳动物组织中肾上腺EO含量最高；切除正常大鼠的两侧肾上腺后血浆EO浓度较对照组明显下降[1]；清醒状态狗的肾上腺静脉血EO浓度比动脉高5倍，且动静脉间EO的浓度梯度持续存在[6]。这些资料均显示肾上腺是哺乳动物血浆EO的主要来源。最近从人和牛肾上腺皮质细胞培养液中检出哇巴因，为肾上腺皮质是EO的主要来源提供了直接证据[7，8]。为了进一步明确EO在哺乳动物肾上腺组织中的分布，本研究采用特异的抗哇巴因兔血清，采用形态学研究中常用的ABC法对EO在SD大鼠肾上腺、垂体等组织的分布进行定位观察，发现哇巴因免疫反应阳性物质主要存在于大鼠的肾上腺皮质网状带，而在皮质球状带和髓质并未发现有免疫阳性染色，这为EO来源于肾上腺皮质提供了直接的形态学依据。
免疫组织化学法是利用抗原抗体特异性反应对细胞及细胞内的某种物质进行定性、定位检测的一种形态学研究方法。近年来随着标记技术的不断改进，使得该方法检测的敏感性大大增强，成为当今形态学研究领域中不可缺少的手段。我们采用的抗哇巴因抗体与醛固酮、皮质醇等其他皮质类固醇激素交叉反应极弱[3]；用10-6mol/L哇巴因做吸收实验可使肾上腺皮质网状带出现的免疫反应阳性物质显著减弱或消失，证实该抗体具有高度特异性，从而为EO在肾上腺皮质的准确定位提供了保证。
垂体对肾上腺皮质功能的维持和调节具有十分重要的作用[9]。研究显示垂体EO含量仅次于肾上腺组织，10-8mol/L促肾上腺皮质激素(ACTH)能明显刺激牛肾上腺皮质培养细胞分泌哇巴因[8]。本研究还观察到在垂体后叶有较弱的哇巴因免疫反应阳性物质存在，而垂体前叶和中间叶中没有阳性物质。对EO在垂体分布的生理意义目前了解甚少，推测其分布特点可能与参与肾上腺皮质激素的分泌调节有关[10]。另有资料显示下丘脑可能也是EO的一个来源，从下丘脑组织中已纯化出一种钠泵抑制物(Hypothalamus inhibitory factor,HIF)，最近Kawamura证实HIF的化学结构与哇巴因一致，就是EO或哇巴因的异构体[11]。本研究中在下丘脑组织中并没有发现哇巴因免疫反应阳性物质存在，可能与EO在下丘脑组织含量甚微[5]，受到免疫组织化学检测方法灵敏度的限制，故还需采用更为敏感的方法加以证实。
总之，本研究以一种新的视角，采用免疫组织化学方法观察了EO在组织含量较高的肾上腺、垂体组织等中的分布，发现哇巴因免疫反应阳性物质主要存在于SD大鼠肾上腺皮质网状带，为EO作为一种新的肾上腺皮质激素提供了形态学证据。
(致谢：本研究得到了第四军医大学神经科学研究所张旭教授、鲍岚副教授的技术指导和热心帮助，在此表示衷心的感谢。)
陕西省科技研究发展计划项目(97K12-G1)
参考文献
1，Hamlyn JM,Lu ZR, Manunta P et al.Observations on the nature, biosynthesis, secretion and significance of endogenous ouabain[J].Clin Exper Hypertension,1998;20(5)∶523
2，吕卓人，丁国良，杨鼎颐.一种新的肾上腺皮质激素—哇巴因[J].西安医科大学学报，1996；17(1)∶129
3，Harris DN, Clark MA,Fisher JF et al.Development of an immunassay for endogenous digitalis-like factor[J].Hypertension,1991;17(6 Pt 2)∶936
4，Cheng XP,Broberger C, Tong YG et al.Regulation of expression of neuropeptide Y Y1 and Y2 receptors in the arcuate nucleus of fasted rats[J].Brain Res,1998;792(1)∶89
5，Hamlyn JM,Blaustein M,Bove S et al.Identification and characterization of an ouabain-like compound from human plasma[J].Proc Natl Acad Sci USA, 1991;88(4)∶6259
6，Boulanger BR, Lilly MP,Hamlyn JM et al.Ouabain is secreted by the adrenal gland in awake dogs[J].Am J Physiol,1993;264(3 Pt1)∶E413
7，Doris PA,Jenkins LA,Stocco DM.Is ouabain and authentic endogenous mammalian substance derived from the adrenal gland[J]?Hypertension,1994;23(5)∶632
8，曲 毅，吕卓人，葛 衡等.内源性哇巴因分泌调节特性的基础研究[J].中国病理生理杂志，1998；14(7)∶913
9，Quinn QJ, Williams GH. Regulation of aldosterone secretion [A].In :James WHT ed.The Adrenal Gland[M].New York:Raven Press, 1992∶159～189
10，Vinge E, Erfurth EM,Odar-cederlof I.Immunoreactive endogenous digoxin-like substances:plasma levels are dependent on the hypothalamic-pituitary-adrenal axis for release and on kidney function for elimination[J].J Cardiovasc Pharmacol,1993;22(Suppl 2)∶S112
11，Kawamura A, Guo J, Itagki Y et al.On the structure of endogenous ouabain[J].Proc Nalt Acad Sci USA, 1999;96(12)∶6654
(1999-10-25收稿 1999-12-14修回)
作者：曲毅 吕卓人 张明娟 刘梅颜
单位：(西安医科大学第一附属医院心内科 西安 710061)
关键词：内源性哇巴因；肾上腺皮质激素；免疫组织化学
西安医科大学学报000205 摘要 目的 探讨内源性哇巴因(Endogenous ouabain,EO)在SD大鼠体内的组织学定位。方法 采用高度特异的抗哇巴因兔血清，用免疫组织化学ABC法观察EO在大鼠体内的分布。结果 免疫组化染色显示在SD大鼠的肾上腺皮质内侧网状带可以观察到丰富的哇巴因免疫反应阳性物质，垂体后叶有较弱的哇巴因免疫反应阳性物质，而下丘脑、肾脏、心肌等组织中并未发现有哇巴因免疫反应阳性物质存在。结论 表明EO主要存在于SD大鼠肾上腺皮质网状带，为EO作为一种新的肾上腺皮质激素提供了形态学依据。
中图分类号 Q454；R335+.4 文献标识码 A 文章编号 0258-0659(2000)02-0104-03
Immunocytochemical localization of endogenous ouabain in the tissues of SD rats
Qu Yi Lü Zhuoren Zhang Mingquan
(Department of Cardiology,First Affiliated Hospital,Xi′an Medical University,Xi′an 710061,China)
ABSTRACT Objective To observe the localization of endogenous ouabain(EO) in the some tissues of SD rats.Methods Immunohistochemical ABC method was used with a high-specify rabbit antiserum against ouabain.Results Ouabain-like immunoreactivities (OLI) were observed in the inner zone of adrenal cortex,known as the zone reticularis.The low level of OLI could be found in the posterior pituitary of SD rat, and no OLI in the hypothalamus, kidney, cardiac muscle and artery.Conclusion OLI were located in the zone reticularis of rat adrenal cortex.This morphological evidence supports that EO is a novel adrenocortical steroid hormone.
KEY WORDS endogenous ouabain adrenocortical hormone immunohistochemistry
内源性哇巴因(Endogenous ouabain,EO)是一种存在于人和哺乳动物组织和血浆中的内源性Na+，K+-ATP酶抑制物，具有调节钠代谢、血管张力和心肌收缩等生理和病理作用，在高血压和心力衰竭等心血管疾病的发生和发展中起着重要作用[1]。近年来对大鼠肾上腺组织和牛肾上腺皮质细胞培养液中EO的含量检测及临床研究报告表明肾上腺皮质是EO的主要来源[2]，但目前尚缺乏关于EO在哺乳动物肾上腺组织分布的形态学证据。本研究采用高度特异的抗哇巴因兔血清，用免疫组织化学ABC法对EO在Sprague-Dawley(SD)大鼠肾上腺、垂体、下丘脑等组织的分布进行观察，为确定EO是一种新的肾上腺皮质激素提供形态学依据。
1 材料和方法
1.1 主要试剂及标本处理
抗哇巴因兔血清由美国Maryland大学医学院高血压研究中心Hamlyn教授惠赠[3]，该抗体与地高辛的交叉反应率为5.2%，与醛固酮、皮质醇和脱氧皮质酮等肾上腺皮质激素的交叉反应率均<0.01%。免疫组织化学ABC试剂盒为美国Vector公司(编号PK6100)。哇巴因及二甲基联苯胺均购自美国Sigma公司。12只成年雄性SD大鼠(体重180～220g，第四军医大学动物中心提供)，用戊巴比妥钠腹腔注射麻醉(50mg/kg)，先经左心室灌注40g/L多聚甲醛-磷酸盐缓冲液(0.1mol/L PB,pH 7.4)300ml后，立即取肾上腺、垂体、下丘脑(前界为视交叉后缘，后界为乳头体后缘)、肾脏、心肌、腹主动脉和股动脉置入同样固定液中后固定1.5h，再浸入200g/L的蔗糖PB溶液中4℃过夜。-20℃恒冷箱切片机中连续冰冻切片，片厚12～18μm。1.2 免疫组织化学ABC法染色
按免疫组织化学ABC法进行染色：体积分数为0.05正常羊血清孵育30min后，加入抗哇巴因兔血清(1∶6 000)，4℃孵育48h；第二抗体为生物素标记的羊抗兔IgG(1∶200),室温下孵育3h；ABC复合物中(1∶100)室温下孵育3h，用二甲基联苯胺-硫酸镍铵加强法进行显色[4]。然后干燥、脱水、透明、DPX封片，Olympus显微镜下观察、照相。
1.3 免疫组织化学吸收实验
将10-6mol/L哇巴因与工作浓度(1∶6 000)的抗哇巴因兔血清混匀，4℃孵育24h，然后离心(3 000r/min,15min)，取上清液替代第一抗体进行染色。阴性对照实验用正常兔血清替代第一抗体进行组化染色。
2 结 果
内源性哇巴因在SD大鼠各组织的免疫组织化学染色结果见表1，哇巴因免疫反应阳性物质主要存在于大鼠的肾上腺皮质网状带。
表1 哇巴因免疫反应阳性物质在SD大鼠各组织的分布 组织类型
染色强度
组织类型
染色强度
肾上腺皮质
垂体前叶
-
球状带
-
中间叶
-
束状带
-
后叶
+
网状带
心房肌
-
肾上腺髓质
-
心室肌
-
下丘脑
-
腹主动脉
-
肾 脏
-
股动脉
-
注：染色强度用“-”～“”表示。“-”代表阴性，“+”代表弱阳性，“”代表阳性，“”代表强阳性
图1 哇巴因免疫反应阳性物质在SD大鼠肾上腺皮质的分布 髓质 ABC法， ×40
图2 哇巴因免疫反应阳性物质在SD大鼠肾上腺皮质的分布(箭头所示) 髓质 ABC法， ×100
图3 用10-6mol/L哇巴因做的大鼠肾上腺皮质吸收实验 ABC法， ×100
图4 哇巴因免疫反应阳性物质在SD大鼠垂体的分布 A：垂体前叶，P：垂体后叶，ABC法， ×40
图5 哇巴因免疫反应阳性物质在SD大鼠垂体后叶的分布(箭头所示) ABC法， ×100
图6 哇巴因免疫反应阳性物质在SD大鼠下丘脑的分布 3V：第三脑室，ABC法， ×40
在SD大鼠肾上腺皮质内侧可以观察到丰富的呈蓝黑色哇巴因免疫反应阳性物质，这些阳性物质主要存在于皮质内侧的网状带，呈点状和条索状分布于细胞质中(见图1，2)。在皮质外侧球状带、束状带以及髓质均未发现哇巴因免疫反应阳性物质的存在。吸收实验呈免疫反应阴性(见图3)。垂体后叶可以观察到较弱的哇巴因免疫反应阳性物质，而垂体前叶和中间叶中没有观察到哇巴因免疫反应阳性物质的存在(见图4，5)。在下丘脑未观察到哇巴因免疫反应阳性物质存在(见图6)。
3 讨 论
大量研究显示哺乳动物体内存在着一种内源性钠泵抑制物(Endogenous sodium pump inhibitor, ESPI)，在水钠代谢和血压调节等方面具有重要的生理和病理生理作用。1991年Hamlyn等率先提出这种ESPI与植物来源的哇巴因无法区别，认为其就是哇巴因或哇巴因极其相似的异构体[5]。近年来采用3H-哇巴因放免法研究发现包括人在内的几种哺乳动物组织中肾上腺EO含量最高；切除正常大鼠的两侧肾上腺后血浆EO浓度较对照组明显下降[1]；清醒状态狗的肾上腺静脉血EO浓度比动脉高5倍，且动静脉间EO的浓度梯度持续存在[6]。这些资料均显示肾上腺是哺乳动物血浆EO的主要来源。最近从人和牛肾上腺皮质细胞培养液中检出哇巴因，为肾上腺皮质是EO的主要来源提供了直接证据[7，8]。为了进一步明确EO在哺乳动物肾上腺组织中的分布，本研究采用特异的抗哇巴因兔血清，采用形态学研究中常用的ABC法对EO在SD大鼠肾上腺、垂体等组织的分布进行定位观察，发现哇巴因免疫反应阳性物质主要存在于大鼠的肾上腺皮质网状带，而在皮质球状带和髓质并未发现有免疫阳性染色，这为EO来源于肾上腺皮质提供了直接的形态学依据。
免疫组织化学法是利用抗原抗体特异性反应对细胞及细胞内的某种物质进行定性、定位检测的一种形态学研究方法。近年来随着标记技术的不断改进，使得该方法检测的敏感性大大增强，成为当今形态学研究领域中不可缺少的手段。我们采用的抗哇巴因抗体与醛固酮、皮质醇等其他皮质类固醇激素交叉反应极弱[3]；用10-6mol/L哇巴因做吸收实验可使肾上腺皮质网状带出现的免疫反应阳性物质显著减弱或消失，证实该抗体具有高度特异性，从而为EO在肾上腺皮质的准确定位提供了保证。
垂体对肾上腺皮质功能的维持和调节具有十分重要的作用[9]。研究显示垂体EO含量仅次于肾上腺组织，10-8mol/L促肾上腺皮质激素(ACTH)能明显刺激牛肾上腺皮质培养细胞分泌哇巴因[8]。本研究还观察到在垂体后叶有较弱的哇巴因免疫反应阳性物质存在，而垂体前叶和中间叶中没有阳性物质。对EO在垂体分布的生理意义目前了解甚少，推测其分布特点可能与参与肾上腺皮质激素的分泌调节有关[10]。另有资料显示下丘脑可能也是EO的一个来源，从下丘脑组织中已纯化出一种钠泵抑制物(Hypothalamus inhibitory factor,HIF)，最近Kawamura证实HIF的化学结构与哇巴因一致，就是EO或哇巴因的异构体[11]。本研究中在下丘脑组织中并没有发现哇巴因免疫反应阳性物质存在，可能与EO在下丘脑组织含量甚微[5]，受到免疫组织化学检测方法灵敏度的限制，故还需采用更为敏感的方法加以证实。
总之，本研究以一种新的视角，采用免疫组织化学方法观察了EO在组织含量较高的肾上腺、垂体组织等中的分布，发现哇巴因免疫反应阳性物质主要存在于SD大鼠肾上腺皮质网状带，为EO作为一种新的肾上腺皮质激素提供了形态学证据。
(致谢：本研究得到了第四军医大学神经科学研究所张旭教授、鲍岚副教授的技术指导和热心帮助，在此表示衷心的感谢。)
陕西省科技研究发展计划项目(97K12-G1)
参考文献
1，Hamlyn JM,Lu ZR, Manunta P et al.Observations on the nature, biosynthesis, secretion and significance of endogenous ouabain[J].Clin Exper Hypertension,1998;20(5)∶523
2，吕卓人，丁国良，杨鼎颐.一种新的肾上腺皮质激素—哇巴因[J].西安医科大学学报，1996；17(1)∶129
3，Harris DN, Clark MA,Fisher JF et al.Development of an immunassay for endogenous digitalis-like factor[J].Hypertension,1991;17(6 Pt 2)∶936
4，Cheng XP,Broberger C, Tong YG et al.Regulation of expression of neuropeptide Y Y1 and Y2 receptors in the arcuate nucleus of fasted rats[J].Brain Res,1998;792(1)∶89
5，Hamlyn JM,Blaustein M,Bove S et al.Identification and characterization of an ouabain-like compound from human plasma[J].Proc Natl Acad Sci USA, 1991;88(4)∶6259
6，Boulanger BR, Lilly MP,Hamlyn JM et al.Ouabain is secreted by the adrenal gland in awake dogs[J].Am J Physiol,1993;264(3 Pt1)∶E413
7，Doris PA,Jenkins LA,Stocco DM.Is ouabain and authentic endogenous mammalian substance derived from the adrenal gland[J]?Hypertension,1994;23(5)∶632
8，曲 毅，吕卓人，葛 衡等.内源性哇巴因分泌调节特性的基础研究[J].中国病理生理杂志，1998；14(7)∶913
9，Quinn QJ, Williams GH. Regulation of aldosterone secretion [A].In :James WHT ed.The Adrenal Gland[M].New York:Raven Press, 1992∶159～189
10，Vinge E, Erfurth EM,Odar-cederlof I.Immunoreactive endogenous digoxin-like substances:plasma levels are dependent on the hypothalamic-pituitary-adrenal axis for release and on kidney function for elimination[J].J Cardiovasc Pharmacol,1993;22(Suppl 2)∶S112
11，Kawamura A, Guo J, Itagki Y et al.On the structure of endogenous ouabain[J].Proc Nalt Acad Sci USA, 1999;96(12)∶6654
(1999-10-25收稿 1999-12-14修回)
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