褪黑素对人肝癌SMMC-7721细胞的抑制作用
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蔡晓宏. 赵晏. 白艳红. 刘鸿.
褪黑素.人肝癌.群体倍增时间.抑制作用.
参见附件(115kb)。
作者：蔡晓宏赵晏 白艳红 刘鸿
单位：蔡晓宏(西安近代化学研究所 西安 710065)；赵晏(西安交通大学神经生物学研究中心，西安 710061)；白艳红(西安近代化学研究所 西安 710065)；刘鸿(西安交通大学化学教研室 西安 710061)
关键词：褪黑素；人肝癌；群体倍增时间；抑制作用
西安医科大学学报000303摘 要：目的 观察褪黑素对人肝癌SMMC-7721细胞生长抑制作用及其作用机理。方法 采用不同浓度的褪黑素通过体外细胞培养、MTT显色技术研究其抑制作用，以流式细胞仪和电子显微镜技术观察其作用机理。结果 褪黑素对人肝癌SMMC-7721细胞具有抑制作用，其IC30、IC50分别为1.10和2.00mmol/L。以IC30的褪黑素处理SMMC-7721细胞，使其倍增时间由21.1h延长到38.4h。流式细胞仪观察到褪黑素导致SMMC-7721细胞G0/G1期比例升高，S期比例降低。透射电镜可观察到以IC30的褪黑素处理的细胞，其超微结构发生了退行性改变。结论 褪黑素对SMMC-7721细胞具有抑制作用，其作用机理可能是褪黑素导致细胞G0/G1阶段的推迟进行。
中图分类号：R979.1；R734.2 文献标识码：A
文章编号：0258-0659(2000)03-0202-03
Inhibitory effects of melatonin
on human liver carcinoma SMMC-7721 line
Cai Xiaohong，Zhao Yan，Bai Yanhong
(Research Center of Neurobiology ,Xi′an Jiaotong University, Xi′an 710061,China)
ABSTRACT：Objective This paper was to observe the inhibitory effect of melatonin IC30) and 50% inhibitory concentration(IC50)were 1.10 and 2.00mmol/L respectively.In comparison with the case without treatment with melatonin the population doubling time was prolonged from 21.1h to 38.4h when the SMMC-7721 cells were treated with 1.10mmol/L melatonin.Examination with FCM found that the cell was inhibited by melatonin in G0/G1 phase and the cell percentage in S stage decreased.The ultrastructural features of cells treated by melatonin in 1.10mmol/L had degenerative changes when they were observed under TEM.Conclusion Melatonin could inhibit the growth of human liver carcinoma SMMC-7721 cells.The mechanism can be explained by the delay at the G0/G1 stage of the cell cycle caused by melatonin.
KEY WORDS: melatonin;human liver carcinoma;inhibition;population doubling time
褪黑素 (melatonin, Mel) 主要是松果体分泌的一种吲哚胺类激素，其分泌量有明显的昼夜节律， 有利于睡眠[1]。另外 Mel 还可以抑制肿瘤细胞生长，增强人体免疫系统的功能[2]。 以往研究表明Mel与其它抗癌药联合应用，增强其它抗癌药的疗效，降低其副作用[3]。但Mel单独对肿瘤细胞作用的报道较少，本文采用体外细胞培养、MTT显色技术研究Mel单独对人肝癌的抑制作用，并用流式细胞仪和电子显微镜技术对其抗癌机理进行探讨。
1 材料和方法
1.1 主要试剂及仪器
1.1.1 主要试剂 褪黑素(自制)含量99.1%(HPLC 分析)，RPMI1640(美国GIBCO公司)，胎牛血清(浙江省金华市清湖犊牛利用研究所)，MTT(华美生物工程公司)。瘤细胞系SMMC-7721细胞为人肝癌细胞，属贴壁生长的上皮细胞，从第四军医大学细胞生物学研究室引入。
1.1.2 主要仪器 DG3022酶联免疫检测仪(南京华东电子管厂)，流式细胞仪(美国，Coulter公司profile Ⅱ型)，透射电子显微镜(日本，JEM-2000EX型)。
1.2 细胞培养 在37℃恒温条件下，95%空气，5%的CO2，开放培养，3～5d传代一次。在细胞生长于对数生长期时，用0.25%胰蛋白酶消化细胞，制成均匀的细胞悬液，以1.0×105～1.5×105 cells/ml浓度接种于96孔板中。
1.3 MTT显色法检测瘤细胞活性 将100μl细胞悬液接种于96孔板中，第二天加入对照液、Mel液，其浓度分别为0.1、0.5、0.75、1.0、2.5、5.0mmol/L。每种浓度设5个平行孔，置37℃，5%CO2环境中分别培养1～8d。实验终止前4h，每孔加入MTT磷酸缓冲液(MTT为5mg/ml)20μl。实验结束后，每孔加入DMSO150μl终止反应，振荡10min，使MTT还原产物甲月 替(Formazan)完全溶解，用DG3022酶联免疫检测仪测定各孔的光密度值(A值)，实验重复三次。
1.4 形态学观察 以不同浓度Mel将SMMC-7721细胞分组处理，在倒置显微镜下进行活细胞观察。
1.5 透射电镜样品制备 分别取经IC30的Mel处理的或对照的SMMC-7721细胞，胰蛋白酶消化，经PBS(0.1mol/L)洗涤离心后，直接于3%戊二醛4℃固定24h，将固定后的细胞团块切成细条状，PBS(0.1mol/L)洗2次，用1%锇酸浸泡后固定2h，乙醇梯度脱水，环氧丙烷过渡，环氧树脂浸透后包埋，聚合器内聚合，LKB800Ⅳ型超薄切片机切片，铀-铅双染色，透射电镜观察。
1.6 流式细胞术样品制备 分别取经IC30的Mel处理的或对照的SMMC-7721细胞，用0.25%胰蛋白酶消化分散，PBS洗涤，70%乙醇固定，4℃保存备检。上机前，样品用PBS洗涤，先后经1%Triton X-100，0.01%RNase和0.05%PI处理，过300目尼龙网，然后用Profile Ⅱ型流式细胞仪在488nm激发波长下测定细胞DNA含量，并用Multicycle软件分析细胞周期分布情况。
2 结果
2.1 细胞数与光吸收值(A值)的关系 采用直线回归方法分析细胞数量与MTT还原产物Formazan光吸收值的关系。结果显示，SMMC-7721细胞数值在3.16×103～1.0×105范围内，与A值呈正相关。相关系数r=0.996(图1)。
图1 细胞数与MTT还原产物A值的关系
2.2 不同浓度Mel对SMMC-7721细胞的生长抑制作用 随着Mel浓度增加，生长抑制率增加。IC30、IC50、IC70的浓度分别为1.10、2.00、3.50mmol/L。4.00mmol/L的Mel组有较多的细胞死亡，生长抑制率为92.2%。Mel对SMMC-7721细胞的生长抑制作用有浓度依赖性(图2)。
图2 Mel对SMMC-7721细胞的生长抑制曲线
2.3 Mel对SMMC-7721细胞的生长曲线的影响 倍增时间TD以公式计算TD=(t2-t1)lg2(lgA2-lgA1)A1、A2分别是培养t1、t2小时后细胞的A值。对照组TD为21.1h，加药组TD为38.4h。由此说明选用抑制浓度IC30的Mel，使SMMC-7721细胞的倍增时间由原来的21.1h延长到38.4h(图3)。
图3 Mel(IC30)对SMMC-7721细胞生长曲线的影响
2.4 形态学观察 倒置生物显微镜下观察，对照组SMMC-7721细胞生长活跃，核分裂多见，细胞异型性明显。加药组细胞胞质浓缩，体积变小，随着药物浓度的增大和作用时间的延长，细胞数量明显减少，死亡细胞多见。从透射电镜可观察到以IC30的Mel处理细胞其超微结构发生了退行性改变。表现为细胞线粒体肿胀，细胞质胞浆流失，出现空泡，核染色质聚集边缘化，细胞崩解，未观察到凋亡细胞。
2.5 Mel对SMMC-7721细胞周期的影响 将以IC30的Mel处理的细胞，通过流式细胞术分析其结果见附表。由表可看出IC30的Mel对SMMC-7721细胞作用主要使细胞处于G1期的百分率明显增多，相反S期则减小。
附表 Mel对SMMC-7721细胞周期的影响 Mel
(mmol/L)
细胞周期影响(%)
G1+G0
S
G2+M
0
61.4
30.0
8.6
1.10
75.5
14.8
9.7
3 讨论
Mel对肿瘤的抑制作用，报道较多的是Mel与其它抗癌药联用。而单独Mel的抗癌作用报道较少。本工作则是以自制的Mel，其质量达分析纯，含量为99.1%[4]，对人肝癌SMMC-7721细胞株进行体外实验。结果表明Mel能有效地抑制SMMC-7721细胞的生长，并有浓度依赖性和时间依赖性。小剂量(1.10mmol/L)的Mel对SMMC-7721细胞显示缓和的生长抑制作用，剂量大于IC50(2.00mmol/L)时，显示明显的生长抑制作用，同时伴有不同程度的细胞变性死亡等。以1.10mmol/L Mel处理SMMC-7721细胞，使其倍增时间由21.1h延长到38.4h，延长了82.0%，与对肿瘤细胞有诱导效应，且具有酰氨基的类似化合物相比，其IC50较小，如DMSO对MEC-1细胞的IC50为1.59%(204mmol/L)，HMBA对MEC-1细胞IC50[5]为2.86mmol/L，HMBA抗肿瘤作用已进行Ⅰ期临床研究阶段。Mel对肿瘤细胞具有明显的抑制作用，目前未发现对人体有毒副作用，有希望成为新的抗癌药。
关于Mel的抗癌机理，Wilson[6]认为Mel通过阻断雌二醇和表皮生长因子对有丝分裂的促进作用，从而抑制人乳腺癌细胞，导致肿瘤细胞G1阶段的推迟进行。Bruno[7]等观察到Mel能够刺激细胞产生内源性的IL-2、IFN(干扰素)、TNF(肿瘤坏死因子)。单独服用Mel可使α-TNF提高22%，γ-IFN提高15%，IL-2提高10%。我们以IC30Mel处理SMMC-7721细胞，通过透射电镜观察到细胞线粒体肿胀，内质网扩张，因此推测线粒体变性减少了内能量供应，抑制了核酸和蛋白质合成，同时影响了许多酶的活性。通过流式细胞术观察细胞周期发现Mel主要作用于癌细胞的G1→S期，使该阶段进展缓慢，导致G1期细胞比例增加。这一结果与Sean[8]通过Mel增强三苯氧胺来抑制乳腺癌细胞的作用一致。因此我们推测Mel对肿瘤细胞的作用机理可能是Mel阻断某些生长因子，影响了许多肿瘤细胞酶的活性，从而抑制肿瘤细胞生长，这些工作还有待进一步深入研究。
(致谢 本工作得到第四军医大学口腔医学院细胞生物学研究室吴军正教授指导)
参考文献：
[1] Dawson D,Encel N.Melatonin and sleep humans[J].J Pineal Res,1993，15(1)∶1
[2] Mastroni GJM. T-heiper-2 lymphocytes as a peripheral target of melatonin[J].J Pineal Res,1995，18(20)∶84
[3] 蔡晓宏，赵 晏，刘 鸿.褪黑素的抗肿瘤研究进展[J].国外医学肿瘤学分册，1998,25(2)∶90
[4] 蔡晓宏，刘 鸿，赵 晏.褪黑素的合成研究[J].陕西化工，1998,27(2)∶25
[5] 刘 斌，司徒镇强，吴军正.HMBA联合辐射对人粘液表皮样癌MEC-1细胞抑制作用[J].实用口腔医学杂志，1995,11(2)∶136
[6] A Lemus-Wilson,DA Kelly,DE Blask. Melatonin blocks the stimulation effects of prolactin and human breast cancer cell growth in culture[J].British J Cancer,1995,72∶1435
[7] Bruno Neri,Carlo Liorelli ,Fausto Moroni.Modulation of human lympholastoid interferon activity by melatonin in metastatic renal cell carcinoma[J].Cancer,1994,73(12)∶3015
[8] Sean T Wilson ,David E Blask, Athena M.Melatonin agents the sensitivity of MCF-7 human breast cancer cells to tamoxifen in vitro[J].J Clin Endocrinol Metab,1992,75(2)∶669
(收稿日期：1999-10-10 修回日期：1999-12-30)
作者：蔡晓宏赵晏 白艳红 刘鸿
单位：蔡晓宏(西安近代化学研究所 西安 710065)；赵晏(西安交通大学神经生物学研究中心，西安 710061)；白艳红(西安近代化学研究所 西安 710065)；刘鸿(西安交通大学化学教研室 西安 710061)
关键词：褪黑素；人肝癌；群体倍增时间；抑制作用
西安医科大学学报000303摘 要：目的 观察褪黑素对人肝癌SMMC-7721细胞生长抑制作用及其作用机理。方法 采用不同浓度的褪黑素通过体外细胞培养、MTT显色技术研究其抑制作用，以流式细胞仪和电子显微镜技术观察其作用机理。结果 褪黑素对人肝癌SMMC-7721细胞具有抑制作用，其IC30、IC50分别为1.10和2.00mmol/L。以IC30的褪黑素处理SMMC-7721细胞，使其倍增时间由21.1h延长到38.4h。流式细胞仪观察到褪黑素导致SMMC-7721细胞G0/G1期比例升高，S期比例降低。透射电镜可观察到以IC30的褪黑素处理的细胞，其超微结构发生了退行性改变。结论 褪黑素对SMMC-7721细胞具有抑制作用，其作用机理可能是褪黑素导致细胞G0/G1阶段的推迟进行。
中图分类号：R979.1；R734.2 文献标识码：A
文章编号：0258-0659(2000)03-0202-03
Inhibitory effects of melatonin
on human liver carcinoma SMMC-7721 line
Cai Xiaohong，Zhao Yan，Bai Yanhong
(Research Center of Neurobiology ,Xi′an Jiaotong University, Xi′an 710061,China)
ABSTRACT：Objective This paper was to observe the inhibitory effect of melatonin IC30) and 50% inhibitory concentration(IC50)were 1.10 and 2.00mmol/L respectively.In comparison with the case without treatment with melatonin the population doubling time was prolonged from 21.1h to 38.4h when the SMMC-7721 cells were treated with 1.10mmol/L melatonin.Examination with FCM found that the cell was inhibited by melatonin in G0/G1 phase and the cell percentage in S stage decreased.The ultrastructural features of cells treated by melatonin in 1.10mmol/L had degenerative changes when they were observed under TEM.Conclusion Melatonin could inhibit the growth of human liver carcinoma SMMC-7721 cells.The mechanism can be explained by the delay at the G0/G1 stage of the cell cycle caused by melatonin.
KEY WORDS: melatonin;human liver carcinoma;inhibition;population doubling time
褪黑素 (melatonin, Mel) 主要是松果体分泌的一种吲哚胺类激素，其分泌量有明显的昼夜节律， 有利于睡眠[1]。另外 Mel 还可以抑制肿瘤细胞生长，增强人体免疫系统的功能[2]。 以往研究表明Mel与其它抗癌药联合应用，增强其它抗癌药的疗效，降低其副作用[3]。但Mel单独对肿瘤细胞作用的报道较少，本文采用体外细胞培养、MTT显色技术研究Mel单独对人肝癌的抑制作用，并用流式细胞仪和电子显微镜技术对其抗癌机理进行探讨。
1 材料和方法
1.1 主要试剂及仪器
1.1.1 主要试剂 褪黑素(自制)含量99.1%(HPLC 分析)，RPMI1640(美国GIBCO公司)，胎牛血清(浙江省金华市清湖犊牛利用研究所)，MTT(华美生物工程公司)。瘤细胞系SMMC-7721细胞为人肝癌细胞，属贴壁生长的上皮细胞，从第四军医大学细胞生物学研究室引入。
1.1.2 主要仪器 DG3022酶联免疫检测仪(南京华东电子管厂)，流式细胞仪(美国，Coulter公司profile Ⅱ型)，透射电子显微镜(日本，JEM-2000EX型)。
1.2 细胞培养 在37℃恒温条件下，95%空气，5%的CO2，开放培养，3～5d传代一次。在细胞生长于对数生长期时，用0.25%胰蛋白酶消化细胞，制成均匀的细胞悬液，以1.0×105～1.5×105 cells/ml浓度接种于96孔板中。
1.3 MTT显色法检测瘤细胞活性 将100μl细胞悬液接种于96孔板中，第二天加入对照液、Mel液，其浓度分别为0.1、0.5、0.75、1.0、2.5、5.0mmol/L。每种浓度设5个平行孔，置37℃，5%CO2环境中分别培养1～8d。实验终止前4h，每孔加入MTT磷酸缓冲液(MTT为5mg/ml)20μl。实验结束后，每孔加入DMSO150μl终止反应，振荡10min，使MTT还原产物甲月 替(Formazan)完全溶解，用DG3022酶联免疫检测仪测定各孔的光密度值(A值)，实验重复三次。
1.4 形态学观察 以不同浓度Mel将SMMC-7721细胞分组处理，在倒置显微镜下进行活细胞观察。
1.5 透射电镜样品制备 分别取经IC30的Mel处理的或对照的SMMC-7721细胞，胰蛋白酶消化，经PBS(0.1mol/L)洗涤离心后，直接于3%戊二醛4℃固定24h，将固定后的细胞团块切成细条状，PBS(0.1mol/L)洗2次，用1%锇酸浸泡后固定2h，乙醇梯度脱水，环氧丙烷过渡，环氧树脂浸透后包埋，聚合器内聚合，LKB800Ⅳ型超薄切片机切片，铀-铅双染色，透射电镜观察。
1.6 流式细胞术样品制备 分别取经IC30的Mel处理的或对照的SMMC-7721细胞，用0.25%胰蛋白酶消化分散，PBS洗涤，70%乙醇固定，4℃保存备检。上机前，样品用PBS洗涤，先后经1%Triton X-100，0.01%RNase和0.05%PI处理，过300目尼龙网，然后用Profile Ⅱ型流式细胞仪在488nm激发波长下测定细胞DNA含量，并用Multicycle软件分析细胞周期分布情况。
2 结果
2.1 细胞数与光吸收值(A值)的关系 采用直线回归方法分析细胞数量与MTT还原产物Formazan光吸收值的关系。结果显示，SMMC-7721细胞数值在3.16×103～1.0×105范围内，与A值呈正相关。相关系数r=0.996(图1)。
图1 细胞数与MTT还原产物A值的关系
2.2 不同浓度Mel对SMMC-7721细胞的生长抑制作用 随着Mel浓度增加，生长抑制率增加。IC30、IC50、IC70的浓度分别为1.10、2.00、3.50mmol/L。4.00mmol/L的Mel组有较多的细胞死亡，生长抑制率为92.2%。Mel对SMMC-7721细胞的生长抑制作用有浓度依赖性(图2)。
图2 Mel对SMMC-7721细胞的生长抑制曲线
2.3 Mel对SMMC-7721细胞的生长曲线的影响 倍增时间TD以公式计算TD=(t2-t1)lg2(lgA2-lgA1)A1、A2分别是培养t1、t2小时后细胞的A值。对照组TD为21.1h，加药组TD为38.4h。由此说明选用抑制浓度IC30的Mel，使SMMC-7721细胞的倍增时间由原来的21.1h延长到38.4h(图3)。
图3 Mel(IC30)对SMMC-7721细胞生长曲线的影响
2.4 形态学观察 倒置生物显微镜下观察，对照组SMMC-7721细胞生长活跃，核分裂多见，细胞异型性明显。加药组细胞胞质浓缩，体积变小，随着药物浓度的增大和作用时间的延长，细胞数量明显减少，死亡细胞多见。从透射电镜可观察到以IC30的Mel处理细胞其超微结构发生了退行性改变。表现为细胞线粒体肿胀，细胞质胞浆流失，出现空泡，核染色质聚集边缘化，细胞崩解，未观察到凋亡细胞。
2.5 Mel对SMMC-7721细胞周期的影响 将以IC30的Mel处理的细胞，通过流式细胞术分析其结果见附表。由表可看出IC30的Mel对SMMC-7721细胞作用主要使细胞处于G1期的百分率明显增多，相反S期则减小。
附表 Mel对SMMC-7721细胞周期的影响 Mel
(mmol/L)
细胞周期影响(%)
G1+G0
S
G2+M
0
61.4
30.0
8.6
1.10
75.5
14.8
9.7
3 讨论
Mel对肿瘤的抑制作用，报道较多的是Mel与其它抗癌药联用。而单独Mel的抗癌作用报道较少。本工作则是以自制的Mel，其质量达分析纯，含量为99.1%[4]，对人肝癌SMMC-7721细胞株进行体外实验。结果表明Mel能有效地抑制SMMC-7721细胞的生长，并有浓度依赖性和时间依赖性。小剂量(1.10mmol/L)的Mel对SMMC-7721细胞显示缓和的生长抑制作用，剂量大于IC50(2.00mmol/L)时，显示明显的生长抑制作用，同时伴有不同程度的细胞变性死亡等。以1.10mmol/L Mel处理SMMC-7721细胞，使其倍增时间由21.1h延长到38.4h，延长了82.0%，与对肿瘤细胞有诱导效应，且具有酰氨基的类似化合物相比，其IC50较小，如DMSO对MEC-1细胞的IC50为1.59%(204mmol/L)，HMBA对MEC-1细胞IC50[5]为2.86mmol/L，HMBA抗肿瘤作用已进行Ⅰ期临床研究阶段。Mel对肿瘤细胞具有明显的抑制作用，目前未发现对人体有毒副作用，有希望成为新的抗癌药。
关于Mel的抗癌机理，Wilson[6]认为Mel通过阻断雌二醇和表皮生长因子对有丝分裂的促进作用，从而抑制人乳腺癌细胞，导致肿瘤细胞G1阶段的推迟进行。Bruno[7]等观察到Mel能够刺激细胞产生内源性的IL-2、IFN(干扰素)、TNF(肿瘤坏死因子)。单独服用Mel可使α-TNF提高22%，γ-IFN提高15%，IL-2提高10%。我们以IC30Mel处理SMMC-7721细胞，通过透射电镜观察到细胞线粒体肿胀，内质网扩张，因此推测线粒体变性减少了内能量供应，抑制了核酸和蛋白质合成，同时影响了许多酶的活性。通过流式细胞术观察细胞周期发现Mel主要作用于癌细胞的G1→S期，使该阶段进展缓慢，导致G1期细胞比例增加。这一结果与Sean[8]通过Mel增强三苯氧胺来抑制乳腺癌细胞的作用一致。因此我们推测Mel对肿瘤细胞的作用机理可能是Mel阻断某些生长因子，影响了许多肿瘤细胞酶的活性，从而抑制肿瘤细胞生长，这些工作还有待进一步深入研究。
(致谢 本工作得到第四军医大学口腔医学院细胞生物学研究室吴军正教授指导)
参考文献：
[1] Dawson D,Encel N.Melatonin and sleep humans[J].J Pineal Res,1993，15(1)∶1
[2] Mastroni GJM. T-heiper-2 lymphocytes as a peripheral target of melatonin[J].J Pineal Res,1995，18(20)∶84
[3] 蔡晓宏，赵 晏，刘 鸿.褪黑素的抗肿瘤研究进展[J].国外医学肿瘤学分册，1998,25(2)∶90
[4] 蔡晓宏，刘 鸿，赵 晏.褪黑素的合成研究[J].陕西化工，1998,27(2)∶25
[5] 刘 斌，司徒镇强，吴军正.HMBA联合辐射对人粘液表皮样癌MEC-1细胞抑制作用[J].实用口腔医学杂志，1995,11(2)∶136
[6] A Lemus-Wilson,DA Kelly,DE Blask. Melatonin blocks the stimulation effects of prolactin and human breast cancer cell growth in culture[J].British J Cancer,1995,72∶1435
[7] Bruno Neri,Carlo Liorelli ,Fausto Moroni.Modulation of human lympholastoid interferon activity by melatonin in metastatic renal cell carcinoma[J].Cancer,1994,73(12)∶3015
[8] Sean T Wilson ,David E Blask, Athena M.Melatonin agents the sensitivity of MCF-7 human breast cancer cells to tamoxifen in vitro[J].J Clin Endocrinol Metab,1992,75(2)∶669
(收稿日期：1999-10-10 修回日期：1999-12-30)
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