青藤碱对家兔血管平滑肌细胞增殖的影响
http://www.100md.com
李乐.
青藤碱.内皮素.血管平滑肌细胞增殖.氚-胸腺嘧啶核苷.
参见附件(176kb)。
作者：李乐
单位：李乐(西安交通大学基础医学院药理学教研室，西安 710061)
关键词：青藤碱；内皮素；血管平滑肌细胞增殖；氚-胸腺嘧啶核苷
西安医科大学学报000304摘 要：目的 研究青藤碱对血管平滑肌细胞增殖作用及DNA合成的影响。方法 采用内皮素刺激的离体家兔血管平滑肌细胞增殖模型，细胞计数，氚-胸腺嘧啶核苷掺入方法。结果 青藤碱明显抑制血管平滑肌细胞增殖反应及DNA合成，呈剂量依赖关系。结论 表明青藤碱具有抗血管平滑肌细胞增殖作用。
中图分类号：R972.4 文献标识码：A
文章编号：0258-0659(2000)03-0205-02
Effects of Sinomenine on proliferation
of vascular smooth muscle cells
Li Le
(Department of Pharmacology,Basical Medicine College， Xi′an Jiaotong University, Xi′an 710061,China)
ABSTRACT： Objective To determine the effets of sinomenine(Sin )on ET-stimulated proliferation and DNA synthesis of the experimental models of proliferation of cultured isolated rabbit aortic smooth muscle cells.Methods The experimental models of proliferation of cultrued isolated rabbit aortic smooth muscle stimulated by endothelin (ET) were established and cell account and 3 H-thymidine (3H-TdR) incorporation were used.Results The results indicated that Sin markedly inhibited VSMC proliferation and DNA synthesis in the dese-dependent manner.Conclusion It is confirmed that Sin possesses anti-proliferation of VSMC.
KEY WORDS: sinomenine;endothelin;VSMC;3H-TdR
血管平滑肌细胞(Vascular smooth muscle cell, VSMC)异常增殖是引起动脉粥样硬化(Atherosclerosis, As)和血管成形术后再狭窄(restenosis after angioplasty, RAA)病变的关键因素之一；因而抑制VSMC异常增殖已成为治疗As和RAA的重要环节[1]。
青藤碱(Sinomenine, Sin)是从印防已科植物青藤(Sinomenium acutum(Thunb)Rehb, et Wils)中提取的生物碱单体[2]。我们以往的研究表明Sin具有明显而持久的降血压作用[2]，但此作用是否与Sin拮抗VSMC增殖相关，有待证实。本实验用已证实能促进VSMC增殖的内皮素(Endothelin,ET)建立了培养家兔VSMC增殖模型[3]，观察了Sin对VSMC细胞增殖及DNA合成的影响，并以钙拮抗剂硝苯啶(Nifidipine, Nif)为阳性对照，以期初步探讨Sin抗高血压作用环节。
1 材料与方法
1.1 动物 新西兰纯种大白兔，体重(2.1±0.2)kg,雌雄兼用，由上海二医科大学实验动物中心提供。
1.2 药品和试剂 Sin为西安制药厂原料药品；Nif ,ET-1，美国Sigma化学公司产品；胎牛血清(FCS)，胰酶，杭州四季青生物试剂公司产品；氚-胸腺嘧啶核苷(3H-TdR)，上海原子能研究所产品，放射比活度851TBq/mol。
1.3 血管平滑肌原代及传代培养 取健康新西兰纯种大白兔，击头致昏，无菌条件下取胸主动脉平滑肌组织，以胰酶消化法进行原代VSMC 37℃，5%CO2静置培养，于光镜、电镜下行细胞鉴定[4]；一般于2～3d后，可见VSMC已贴壁生长，细胞呈梭形，逐渐重叠达多层，高低起伏呈“峰谷”状，以20%FCS M199培养基每周换液二次待细胞长满瓶壁后，进行传代培养。实验所用VSMC为3～6代。
1.4 细胞计数 采用生长稳定的3～4代VSMC，共分为六组。A组：加5% FCS M199培养液；B组：5% FCS+0.1μmol/L+ ET； C组:5%FCS+0.1μmol/L ET+Sin 10μmol/L; D组：5% FCS+0.1μmol/L ET+ Sin 30μmol/L;E组：5% FCS+0.1μmol/L ET+Sin 100 μmol/L;F组：5% FCS+ET 0.1μmol/L+Nif 10μmol/L;每天用含相应试剂与药物的培养液换液一次，连续37℃ 5%CO2静置培养72h后，终止培养，用常规胎盼蓝排除法在光镜下进行细胞计数。
1.5 3H-TdR掺入量[5]测定 配制2×105个/ml细胞悬液，接种于24孔培养板，每组8孔，实验分组同细胞计数分组，每孔加入细胞悬液后37℃ 5%CO2培养24h后，换5%FCS M199培养基，48h后换20% FCSM199培养基，同时加入相应药物，继续培养18h后，各组均加入3H-TdR(740MBq/L)，再培养6h后终止培养，收集细胞，滤膜烘干后置闪烁瓶中，加入闪烁液，静置10h后在液闪计数仪(FJ 2107，德国产)上进行放射强度测定。
1.6 统计分析 所有数据以
±s表示，以组间t检验或量效关系Tr检验进行统计学处理。
2 结果
2.1 ET-1与细胞计数的关系 与对照组(A组)比较，加入ET-1，VSMC细胞计数差异有显著性意义，证实了ET促VSMC的增殖作用(表1)。
表1 Sin对FCS诱导的VSMC增殖细胞计数、DNA合成3H-TdR掺入量的影响(±s,n=6) 组别
浓度(μmol/L)
细胞计数/×104
3 H-TdR/CPM
A FCS
5%
8.25±2.34
2245±394
B FCS+ET
5%+0.1
17.10±3.15**
12441±1746**
C FCS+ET+Sin
5%+0.1+10
13.84±1.75*
7152±745**
D FCS+ET+Sin
5%+0.1+30
12.15±2.74*
3849±592**
E FCS+ET+Sin
5%+0.1+100
11.34±2.11*
1454±517**
F FCS+ET+Nif
5%+0.1+10
12.65±2.01*
5874±814**
与A组比较或与B组比较 *P<0.01， **P<0.012.2 Sin对ET-1促VSMC增殖的作用 在加入ET-1的同时，加入梯度浓度的Sin ,Sin组的VSMC细胞计数差异有显著性意义，并呈剂量依赖关系(r=0.9316,n=6,P<0.05)(表1)。
2.3 ET-1对3H-TdR掺入量的影响 与对照A组比较， ET组的3H-TdR掺入量计数差异有显著性意义，表明ET促进细胞DNA合成(表1)。
2.4 Sin对3H-TdR掺入量的影响 在加入ET的同时，加入梯度浓度的Sin,3H-TdR的掺入量差异有显著性意义(P<0.01),并呈剂量依赖关系(r=0.9467,n=6,P<0.01)(表1)。Nif对3H-TdR的掺入量差异亦有显著性意义(P<0.01)(表1)。
3 讨论
高血压发病机制目前尚不完全清楚，但已被公认为一种多基因因素疾病。而高血压病理基础为动脉粥样硬化，除了血管内皮损伤，脂质沉积，单核细胞泡沫化外，还表现出VSMC异常增殖，后者在影响动脉粥样硬化进程及预后多方面起重要作用，同时也是RAA病变的关键因素之一，因而开发抑制VSMC的药物成为近年来国内外研究的热点之一[6]。
我们课题组曾对Sin药效学进行过较为系统的研究，偏重于电生理和血流动力学方面，已经证实Sin具有较明显的降血压、钙拮抗和抗心律失常等作用，这些作用对VSMC增殖似有针对性，为此，我们初步观察了Sin对VSMC增殖的影响。
在正常动物体内，VSMC通常处于不分裂状态，即细胞周期的G0/G1期(静止期)。体外培养的VSMC在缺少血清的条件下，合成也停止。为此，为观察药物对VSMC增殖的影响，往往需要在生长静止期VSMC培养液中加入血清等促生长因子诱导VSMC细胞同步进入增殖周期[6]。我们采用已证实能促进VSMC增殖的ET建立VSMC增殖模型。研究结果ET增加VSMC细胞计数及DNA合成的3H-TdR掺入量，表明ET确有促VSMC增殖作用。而Sin剂量依赖地抑制VSMC细胞计数及3H-TdR掺入量，钙拮抗剂Nif也明显抑制VSMC细胞计数及3H-TdR掺入量。近年来研究显示[7]，VSMC异常增殖受许多生长因子、癌基因调控，受VSMC凋亡的影响，与细胞内传导系统密切相关，Sin抗VSMC增殖作用与上述环节的关系，有待进一步研究，从本实验结果可初步认为，Sin降血压作用可能与Sin抑制VSMC增殖有关。
基金项目：陕西省卫生厅基金资助(1999)
参考文献：
[1] Shwartz SM,Murry CE.Proliferation and the monoclonal origrins of atherosclerotic lesions[J].Annu Ker Med, 1998，49(1)∶437
[2] 周金黄，王建华主编.中药药理与临床研究进展(第2册)[M].第一版，北京：中国科学技术出版社，1993∶66～82
[3] Neuser D，Stasch JP.Knorr A, et al.Inhibition by atrial natriuretic pep-tide of endothelin-1.Stimulated proliferation of vajchlar smooth muscle cells[J].J Cardiovasc Pharmaol,1993,22(sap 18)∶6257
[4] Xiong Yili, Qian Jianqing, Wang Hongwei.Effects of Ddph on proliferaton of vascular smooth muscle cells and expression of PDG F-B,bfGF,GSN,C-myc[J].Chin Pharmacol Bull, 1997,13(4)∶311
[5] Cheng Youqin, Wu Shanshan, Wang Shiwen ,et al.The Zihibition of endogenous carbon monoxide on vascular smmoth muscle cell proliferaton induced by endothelin[J].Chin J Cardiol, 1998,26(3)∶217
[6] Campan M,Desgranges C, Gadeau AP ,et al.Cell cycle dependent gene expression in quiesent stimulated and asynchronously cycling arterial smooth muscle cells in culture[J].J Cell Physiol,1992,15(3)∶493
[7] Chen HW, Huang KC.Effect of curcumin on cell cycle progression and apoptosis in rascular smooth muscle cells[J].Brit J of pharmacol, 1998,12(2)∶1029
(收稿日期：1999-10-20 修回日期：1999-12-28)
作者：李乐
单位：李乐(西安交通大学基础医学院药理学教研室，西安 710061)
关键词：青藤碱；内皮素；血管平滑肌细胞增殖；氚-胸腺嘧啶核苷
西安医科大学学报000304摘 要：目的 研究青藤碱对血管平滑肌细胞增殖作用及DNA合成的影响。方法 采用内皮素刺激的离体家兔血管平滑肌细胞增殖模型，细胞计数，氚-胸腺嘧啶核苷掺入方法。结果 青藤碱明显抑制血管平滑肌细胞增殖反应及DNA合成，呈剂量依赖关系。结论 表明青藤碱具有抗血管平滑肌细胞增殖作用。
中图分类号：R972.4 文献标识码：A
文章编号：0258-0659(2000)03-0205-02
Effects of Sinomenine on proliferation
of vascular smooth muscle cells
Li Le
(Department of Pharmacology,Basical Medicine College， Xi′an Jiaotong University, Xi′an 710061,China)
ABSTRACT： Objective To determine the effets of sinomenine(Sin )on ET-stimulated proliferation and DNA synthesis of the experimental models of proliferation of cultured isolated rabbit aortic smooth muscle cells.Methods The experimental models of proliferation of cultrued isolated rabbit aortic smooth muscle stimulated by endothelin (ET) were established and cell account and 3 H-thymidine (3H-TdR) incorporation were used.Results The results indicated that Sin markedly inhibited VSMC proliferation and DNA synthesis in the dese-dependent manner.Conclusion It is confirmed that Sin possesses anti-proliferation of VSMC.
KEY WORDS: sinomenine;endothelin;VSMC;3H-TdR
血管平滑肌细胞(Vascular smooth muscle cell, VSMC)异常增殖是引起动脉粥样硬化(Atherosclerosis, As)和血管成形术后再狭窄(restenosis after angioplasty, RAA)病变的关键因素之一；因而抑制VSMC异常增殖已成为治疗As和RAA的重要环节[1]。
青藤碱(Sinomenine, Sin)是从印防已科植物青藤(Sinomenium acutum(Thunb)Rehb, et Wils)中提取的生物碱单体[2]。我们以往的研究表明Sin具有明显而持久的降血压作用[2]，但此作用是否与Sin拮抗VSMC增殖相关，有待证实。本实验用已证实能促进VSMC增殖的内皮素(Endothelin,ET)建立了培养家兔VSMC增殖模型[3]，观察了Sin对VSMC细胞增殖及DNA合成的影响，并以钙拮抗剂硝苯啶(Nifidipine, Nif)为阳性对照，以期初步探讨Sin抗高血压作用环节。
1 材料与方法
1.1 动物 新西兰纯种大白兔，体重(2.1±0.2)kg,雌雄兼用，由上海二医科大学实验动物中心提供。
1.2 药品和试剂 Sin为西安制药厂原料药品；Nif ,ET-1，美国Sigma化学公司产品；胎牛血清(FCS)，胰酶，杭州四季青生物试剂公司产品；氚-胸腺嘧啶核苷(3H-TdR)，上海原子能研究所产品，放射比活度851TBq/mol。
1.3 血管平滑肌原代及传代培养 取健康新西兰纯种大白兔，击头致昏，无菌条件下取胸主动脉平滑肌组织，以胰酶消化法进行原代VSMC 37℃，5%CO2静置培养，于光镜、电镜下行细胞鉴定[4]；一般于2～3d后，可见VSMC已贴壁生长，细胞呈梭形，逐渐重叠达多层，高低起伏呈“峰谷”状，以20%FCS M199培养基每周换液二次待细胞长满瓶壁后，进行传代培养。实验所用VSMC为3～6代。
1.4 细胞计数 采用生长稳定的3～4代VSMC，共分为六组。A组：加5% FCS M199培养液；B组：5% FCS+0.1μmol/L+ ET； C组:5%FCS+0.1μmol/L ET+Sin 10μmol/L; D组：5% FCS+0.1μmol/L ET+ Sin 30μmol/L;E组：5% FCS+0.1μmol/L ET+Sin 100 μmol/L;F组：5% FCS+ET 0.1μmol/L+Nif 10μmol/L;每天用含相应试剂与药物的培养液换液一次，连续37℃ 5%CO2静置培养72h后，终止培养，用常规胎盼蓝排除法在光镜下进行细胞计数。
1.5 3H-TdR掺入量[5]测定 配制2×105个/ml细胞悬液，接种于24孔培养板，每组8孔，实验分组同细胞计数分组，每孔加入细胞悬液后37℃ 5%CO2培养24h后，换5%FCS M199培养基，48h后换20% FCSM199培养基，同时加入相应药物，继续培养18h后，各组均加入3H-TdR(740MBq/L)，再培养6h后终止培养，收集细胞，滤膜烘干后置闪烁瓶中，加入闪烁液，静置10h后在液闪计数仪(FJ 2107，德国产)上进行放射强度测定。
1.6 统计分析 所有数据以
±s表示，以组间t检验或量效关系Tr检验进行统计学处理。2 结果
2.1 ET-1与细胞计数的关系 与对照组(A组)比较，加入ET-1，VSMC细胞计数差异有显著性意义，证实了ET促VSMC的增殖作用(表1)。
表1 Sin对FCS诱导的VSMC增殖细胞计数、DNA合成3H-TdR掺入量的影响(
±s,n=6) 组别浓度(μmol/L)
细胞计数/×104
3 H-TdR/CPM
A FCS
5%
8.25±2.34
2245±394
B FCS+ET
5%+0.1
17.10±3.15**
12441±1746**
C FCS+ET+Sin
5%+0.1+10
13.84±1.75*
7152±745**
D FCS+ET+Sin
5%+0.1+30
12.15±2.74*
3849±592**
E FCS+ET+Sin
5%+0.1+100
11.34±2.11*
1454±517**
F FCS+ET+Nif
5%+0.1+10
12.65±2.01*
5874±814**
与A组比较或与B组比较 *P<0.01， **P<0.012.2 Sin对ET-1促VSMC增殖的作用 在加入ET-1的同时，加入梯度浓度的Sin ,Sin组的VSMC细胞计数差异有显著性意义，并呈剂量依赖关系(r=0.9316,n=6,P<0.05)(表1)。
2.3 ET-1对3H-TdR掺入量的影响 与对照A组比较， ET组的3H-TdR掺入量计数差异有显著性意义，表明ET促进细胞DNA合成(表1)。
2.4 Sin对3H-TdR掺入量的影响 在加入ET的同时，加入梯度浓度的Sin,3H-TdR的掺入量差异有显著性意义(P<0.01),并呈剂量依赖关系(r=0.9467,n=6,P<0.01)(表1)。Nif对3H-TdR的掺入量差异亦有显著性意义(P<0.01)(表1)。
3 讨论
高血压发病机制目前尚不完全清楚，但已被公认为一种多基因因素疾病。而高血压病理基础为动脉粥样硬化，除了血管内皮损伤，脂质沉积，单核细胞泡沫化外，还表现出VSMC异常增殖，后者在影响动脉粥样硬化进程及预后多方面起重要作用，同时也是RAA病变的关键因素之一，因而开发抑制VSMC的药物成为近年来国内外研究的热点之一[6]。
我们课题组曾对Sin药效学进行过较为系统的研究，偏重于电生理和血流动力学方面，已经证实Sin具有较明显的降血压、钙拮抗和抗心律失常等作用，这些作用对VSMC增殖似有针对性，为此，我们初步观察了Sin对VSMC增殖的影响。
在正常动物体内，VSMC通常处于不分裂状态，即细胞周期的G0/G1期(静止期)。体外培养的VSMC在缺少血清的条件下，合成也停止。为此，为观察药物对VSMC增殖的影响，往往需要在生长静止期VSMC培养液中加入血清等促生长因子诱导VSMC细胞同步进入增殖周期[6]。我们采用已证实能促进VSMC增殖的ET建立VSMC增殖模型。研究结果ET增加VSMC细胞计数及DNA合成的3H-TdR掺入量，表明ET确有促VSMC增殖作用。而Sin剂量依赖地抑制VSMC细胞计数及3H-TdR掺入量，钙拮抗剂Nif也明显抑制VSMC细胞计数及3H-TdR掺入量。近年来研究显示[7]，VSMC异常增殖受许多生长因子、癌基因调控，受VSMC凋亡的影响，与细胞内传导系统密切相关，Sin抗VSMC增殖作用与上述环节的关系，有待进一步研究，从本实验结果可初步认为，Sin降血压作用可能与Sin抑制VSMC增殖有关。
基金项目：陕西省卫生厅基金资助(1999)
参考文献：
[1] Shwartz SM,Murry CE.Proliferation and the monoclonal origrins of atherosclerotic lesions[J].Annu Ker Med, 1998，49(1)∶437
[2] 周金黄，王建华主编.中药药理与临床研究进展(第2册)[M].第一版，北京：中国科学技术出版社，1993∶66～82
[3] Neuser D，Stasch JP.Knorr A, et al.Inhibition by atrial natriuretic pep-tide of endothelin-1.Stimulated proliferation of vajchlar smooth muscle cells[J].J Cardiovasc Pharmaol,1993,22(sap 18)∶6257
[4] Xiong Yili, Qian Jianqing, Wang Hongwei.Effects of Ddph on proliferaton of vascular smooth muscle cells and expression of PDG F-B,bfGF,GSN,C-myc[J].Chin Pharmacol Bull, 1997,13(4)∶311
[5] Cheng Youqin, Wu Shanshan, Wang Shiwen ,et al.The Zihibition of endogenous carbon monoxide on vascular smmoth muscle cell proliferaton induced by endothelin[J].Chin J Cardiol, 1998,26(3)∶217
[6] Campan M,Desgranges C, Gadeau AP ,et al.Cell cycle dependent gene expression in quiesent stimulated and asynchronously cycling arterial smooth muscle cells in culture[J].J Cell Physiol,1992,15(3)∶493
[7] Chen HW, Huang KC.Effect of curcumin on cell cycle progression and apoptosis in rascular smooth muscle cells[J].Brit J of pharmacol, 1998,12(2)∶1029
(收稿日期：1999-10-20 修回日期：1999-12-28)
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