柯萨奇病毒感染与克山病
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邱芬. 徐仓宝.
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作者：邱芬 徐仓宝
单位：邱芬 徐仓宝(西安医科大学卫生部微量元素与地方病重点实验室 西安 710061)邱芬(学报编辑部)
关键词：
西安医科大学学报000142 中图分类号 R542.3 文献标识码 A
文章编号 0258-0659(200 0)01-0090-03
克山病是一种地方性心肌病，病因不明。大量调查研究 发 现，克山病病区水、土、粮以及居民体内硒水平低下，给病区人群口服亚硒酸钠预防克山病 取得了肯定效果[1]，提出硒缺乏是克山病发病的重要水土因素之一。但以往我国 北方急型克山病具有年度多发、季节多发和西南儿童亚急型克山病夏秋季多发，常伴有腹痛 、腹泻或呼吸道感染症状等流行病学特点，不能用硒缺乏来解释，并且已从克山病病人早期 血液和尸检脏器中分离出多株肠道病毒，尤其是柯萨奇病毒，故有人提出克山病的病毒病因 学说。近年来，随着分子生物学技术的发展，运用核酸杂交方法从克山病尸检心肌组织中检 测到柯萨奇B组病毒RNA，进一步提示克山病的发病与柯萨奇病毒感染有关。现就这方面的研 究进展情况综述如下。
1 柯萨奇病毒的一般特征
柯萨奇病毒(Coxsackievirus, CV)属微核糖核酸病毒科，肠道病毒属。无囊膜、耐 乙醚、二十面体核衣壳，直径20～30nm，基因组为线状的片段、单股RNA，相对分子质量 2.5×106。该病毒分为A、B两组，A组有1～24个血清型，B组有1～6个血清型[2 ]。研究表明，柯萨奇B组病毒(CVB)与人类心肌炎有关，特别是CVB2、B3、B4、B 5型。CVB感染后可在咽部和肠粘膜细胞中增殖，然后由血流转入靶器官，如心肌等组织。
2 克山病患者CVB分离和检测
自50年代起，克山病研究工作者就开展了克山病有关病毒病因方面的研究，从克山病患者早 期血液、尸检心肌组织中分离到多株柯萨奇病毒。重庆医学院于1973～1977年自四川大竹县 169份克山病病理材料中分离出柯萨奇B1、B4型病毒[3]。黑龙江吴振荣等 从29例急型、亚急型克山病患者分离出柯萨奇B2病毒1株。1977年苏诚钦等从1例亚急型 克山病患者血清中分离出柯萨奇B4型病毒，将该毒株接种到新生小白鼠后，小白鼠心肌肌 束间及心肌细胞内均发生空泡病变[4]。汪国芹等报道从3例病理诊断为亚急型克 山病尸检脏器中分离到3株稳定毒株，经鉴定为柯萨奇B2、A9和未定型1株，电镜下 显示为2 8～32nm小RNA无囊膜肠道病毒属病毒颗粒[5]。但冯树翼等在甘肃地区27例克山病 尸解心脏、血液，用人胚肾、人胚肺、地鼠肾分离培养均未发现病毒。总的来看，克山病患 者体内柯萨奇病毒分离的阳性率不高，型别还比较分散。
在血清学方面，抗病毒抗体的检测报道较多。仇素英等测定了克山病患者血清中柯萨奇 B组病毒中和抗体滴度，23份血清中含有柯萨奇B抗体者17份，其中包含柯萨奇B1、B2 、B3和B4。患者双份血清恢复期抗体滴度呈4倍增高者6份，急性期抗体滴度高达1∶ 64以上者4份。黑龙江地研所、甘肃地研所均对克山病患者双份血清进行柯萨奇B组抗体测 定，呈4倍增高者分别为50%、35%。张鸿源[6]对34例亚急型克山病患者血清 CVB1～6中和抗体测定，结果呈4倍增高者达67.9%，对30例亚急克血清CVB1～ 6 IgM抗体 测定阳性率达66.6%。孙利群对30例亚急克血清CVB1～6 IgM抗体检测，结果同张鸿 源报道 一致，但型别分布以B3、B5为多。笔者对21例潜在型、慢型克山病患者血清CVB 1～6 Ig M,IgG进行检测，结果CVB1～6 IgM阳性率明显高于非病区健康对照组，但明显低于 心肌炎组； CVB1～6 IgG阳性率亦明显高于非病区健康对照组，但与心肌炎组相近，表明潜在型 、慢型克山 病患者有新近CVB感染的证据，提示在克山病的发生和发展中有CVB感染参与的可能[7 ]。以上研究结果表明，克山病患者的柯萨奇B组病毒感染率较高，但型别比较分散。
近年来，随着现代分子生物学技术的推广和应用，采用核酸杂交技术证实了亚急型、慢型克 山病死亡患者心肌组织中有柯萨奇B组病毒RNA存在。1993年钟学宽等[8]用CVBcDN A探针与云南亚急型克山病尸检心肌组织切片原位杂交，证实90%病例心肌组织中有CVB RNA 存在。李延文等[9]运用PCR技术和核酸杂交证实70年代亚急型克山病死亡患者心 肌蜡块中柯萨奇病毒B4的阳性率高达90%。钟学宽[10]、牛美娟[11] 、周令望[12]等相继用原位核酸杂交法检测山东、云南、黑龙江慢型克山病患 者柯萨奇B组病毒RNA ，阳性率分别为64%、73.3%和69.2%。以上研究结果提示，在克山病 发生和发展中有柯萨奇病毒的感染和参与，柯萨奇B组病毒感染可能是克山病致病因素之一 。但还有待进一步流行病学和实验研究证实。
3 硒与CVB
3.1 硒对CVB5在细胞内复制的影响 赵冬玲等 [13]将0.25ml病毒液(CVB5)与等量维持液混合，对照组维持液中不加Na2SeO3 ，实验组维持液中加Na2SeO3 0.5μg/ml,0.05μg/ml,4℃作用2h，分别进行毒力测定。 结果维持液中加Na3SeO3与不加Na2SeO3组病毒毒力相同，证明硒对病毒没有直接灭 活作用。用加Na2SeO3 0.05～0.5μg/ml的营养液连续传代细胞与营养液中不加Na2SeO 3的对照组比较，观察对病毒复制的影响，结果显示：加Na2SeO3的营养液培养的第1 、2代细胞存活率、病毒增殖量与对照组无明显差异，但从第3代起至第10代，细胞存活率明 显提高，病毒在细胞内增殖量明显降低。进一步做加硒培养的第4代细胞感染CVB5病毒的 动 态观察，发现对照组和实验组病毒吸附和穿入到细胞内的量是相同的，而且随着时间的变化 ，对照组病毒增殖量明显高于实验组，活细胞百分率对照组明显低于实验组，表明这种抑制 病毒增殖的主要作用环节可能在影响病毒的生物合成阶段。
3.2 硒对CVB4感染小鼠心脏改变的影响 白锦等 [14]将从亚急型克山病患儿血液中分离得到的柯萨奇B4型病毒，感染其亲代饲 以低硒病区饲料、病区加硒饲料、半合成饲料、半合成加硒饲料和常备饲料的7日龄乳鼠， 结果发现，各组的心脏病变检出率和病变的严重程度与血硒水平呈相反的关系，即血硒越高 的组，其心脏病变检出率越低，病变也越轻；进食同一饲料的动物(病区粮与病区加硒粮， 或 合成饲料与合成加硒饲料)，其子代心肌坏死检出率补硒组均显著低于未补硒组，且与常备 组无显著差异。说明缺硒乳鼠的心脏对病毒的侵犯更为敏感；换句话说补硒对柯萨奇B 4病毒引起的心肌坏死有显著的保护作用。
3.3 柯萨奇B3病毒在缺硒小鼠体内毒性增加 为了 确定硒缺乏是否影响CVB3/20感染的病理后果，Beck[15，16]观察了在 接种单克隆、测序的致心肌炎病毒CVB3/20后，感染小鼠心脏组织的病理学改变。发现 缺硒饲料喂养4周后，小鼠心肌损害比补适量硒小鼠发生的早且严重，接种7天时，适量硒小 鼠心脏显示很轻或不显示病理改变，而缺硒小鼠有明显病理改变。接种14和21d时，适量 硒小鼠心脏仅有中等病理损害(炎性浸润)，而缺硒小鼠具有严重心肌损害(炎性浸润和坏死) 。表明硒缺乏增加了CVB3感染的致心肌炎潜力。同时检测感染后不同时间心脏病毒滴度 ，发现CVB3/20感染的缺硒小鼠在接种7、10、21d病毒滴度均高于适量硒小鼠，且持 续时间长。
为了确定宿主反应的作用，在接种7d时从缺硒或适量硒小鼠分离病毒，在Hela细胞传代一次 ，测定滴度，并接种到7周龄适量硒小鼠，7d后处死取心脏做病理检查和心脏病毒滴度测定 。结果显示：将感染CVB3/20适量硒小鼠分离的病毒接种到适量硒小鼠，在接种后7 d时引起很轻或不引起病理改变，病毒滴度相对较低，毒性程度与未传代的CVB3/20相 似 。然而，经缺硒小鼠传代的病毒在适量硒小鼠的毒性比在适量硒小鼠分离的病毒毒性大，心 脏病毒滴度也明显增高，说明CVB3/20接种至缺硒小鼠时所观察到的表型改变，再将 分离出的病毒传代至适量硒小鼠时仍被保持[17]。与适量硒小鼠相比，缺硒小鼠 心、肝、脾和血清病毒滴度较高。提示，较高的病毒复制率可能增加了突变发生的机会。
3.4 人良性肠道病毒在缺硒小鼠体内变成有毒病毒 B eck等[18]用适量硒或缺硒饲料喂养小鼠(C3H/HEJ，雄性)4周，接种无 毒CVB3/0，分别于接毒7、14、21d处死，取血和心脏，结果与不发生心脏病变的感染适 量 硒小鼠相比，接种不致心肌炎病毒的缺硒小鼠出现明显的心肌病变。即在接种后第7天，缺 硒感染小鼠心脏显示病变，而适量硒感染小鼠直至接种第21天也未发现病变。提示缺硒小鼠 心脏损害的出现可能与病毒复制形式改变有关 。为证实这一点，测定心脏病毒滴度发现，接种CVB3/0的缺硒小鼠病毒滴度比适量硒 小鼠高10倍，且持续时间长。
为确定病毒毒性增加是否由不致心肌炎病毒基因突变的结果，将CVB3/0感染的缺 硒或 适量硒供体小鼠心脏分离的病毒接种到适量硒受体小鼠，发现，接种从缺硒供体小鼠获 得的CVB3/0的适量硒小鼠心肌显示明显的心肌炎改变，而接种从适量硒供体小鼠分离 的CVB3/0的适量硒小鼠心脏正常，前者的心脏病毒滴度比后者高300倍。结果提示，由 于在缺硒宿主体内复制结果而引起基因突变，使不致心肌炎的CVB3/0突变为致心肌炎 病毒，并且传代至适量硒宿主时仍有毒性。
1995年Beck[19]把从缺硒小鼠分离到的CVB3/0进行测序，并与原来不致心肌炎 的CVB3/0进行对比，发现6个核苷酸突变位点(234、788、2271、2438、3324和7334) 。同时将这些序列改变同已知致心肌炎株(CVB3/20)比较，发现所有6个核苷酸是一 样的，只有2690位点的核苷酸没有改变。
3.5 硒缺乏宿主CVB3毒性增强的机制 硒缺乏小鼠 体内CVB3突变发生的机制尚不清楚，设想可能是氧化性损害的增加，快速复制和缺乏校 对能力三个因素相互作用的结果。具有抗氧化作用的硒缺乏可使病毒引起的心脏病理损害加 剧，提示宿主氧化应激增加。氧化应激状态可导致自由基增加，后者可损害细胞膜、细胞蛋 白和DNA，自由基增加可影响免疫系统或改变心肌细胞膜及代谢，使病毒达到较高滴度并持 续较长时间。病毒逃避了正常清除机制从而有较长的复制时间，也可增加突变的机会。
柯萨奇病毒是一种RNA病毒，其突变率每个核苷酸拷贝为10-3～10-5， 这意味着每个基因突变率至少比白细胞DNA高10倍。这种差异的生物学基础是因为缺乏DNA病 毒所具有的识别和修复复制误差的校对机制(RNA校对复制酶)，如在抗氧化剂(硒或Vit E)缺 乏情况下则可能进一步加速病毒已经较高的RNA基因组演化率，产生更多的遗传误差。
新近研究表明，柯萨奇病毒B3还有编码硒蛋白的启动子，在正常硒水平条件下，柯萨奇 病毒B3可以表达硒蛋白，柯萨奇病毒B3表达的硒蛋白具有抑制病毒自身复制作用。但 在低硒条件下，柯萨奇病毒B3不能够表达硒蛋白，其抑制自身复制作用消失，使得柯萨 奇病毒B3在体内大量复制，心脏病毒滴度增加，对心脏细胞造成直接破坏[20] 。这是低硒条件下柯萨奇病毒B3致病的机制之一。
4 展 望
近年来，关于低硒与其相关因素与克山病发病关系的研究已取得一些进展，就现有资料来看 ，克山病无疑是一种由复合致病因素引起的地方性心肌病。低硒是决定克山病地区性分布的 基本病因，同时还得有一些诱发因素(条件因素)参与作用。这些因素并不存在明显的地区性 差异，但能对克山病的临床发病、年度多发、季节多发发挥重要影响。从以上克山病病毒病 因及有关动物实验研究表明，在克山病的发生和发展过程中可能有CVB感染参与，但这种感 染在克山病发病中究竟起什么作用，是主要原因还是条件因素，还需进一步做如下工作。① 把柯萨奇病毒RNA的检测与克山病的临床经过和病理改变密切结合起来；②扩大对照，除病 区和非病区健康对照外，还应与非病区心肌炎、心肌病病例进行比较研究；③对克山病病情 的监测，除病区人群外，还应密切注视邻近非病区心肌炎流行情况[21]；④采用 PCR及核酸测序技术，对病区新发克山病患者血液中的柯萨奇病毒B3易变区进行扩增、酶 切分析和测序，并与非病区心肌炎患者血液中的柯萨毒B3易变区基因序列进行 对比研究，这将为揭示该病发病机制提供新的信息。
陕西省科委基金资助项目
参考文献
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(1999-07-10收稿 1999-09-05修回)
作者：邱芬 徐仓宝
单位：邱芬 徐仓宝(西安医科大学卫生部微量元素与地方病重点实验室 西安 710061)邱芬(学报编辑部)
关键词：
西安医科大学学报000142 中图分类号 R542.3 文献标识码 A
文章编号 0258-0659(200 0)01-0090-03
克山病是一种地方性心肌病，病因不明。大量调查研究 发 现，克山病病区水、土、粮以及居民体内硒水平低下，给病区人群口服亚硒酸钠预防克山病 取得了肯定效果[1]，提出硒缺乏是克山病发病的重要水土因素之一。但以往我国 北方急型克山病具有年度多发、季节多发和西南儿童亚急型克山病夏秋季多发，常伴有腹痛 、腹泻或呼吸道感染症状等流行病学特点，不能用硒缺乏来解释，并且已从克山病病人早期 血液和尸检脏器中分离出多株肠道病毒，尤其是柯萨奇病毒，故有人提出克山病的病毒病因 学说。近年来，随着分子生物学技术的发展，运用核酸杂交方法从克山病尸检心肌组织中检 测到柯萨奇B组病毒RNA，进一步提示克山病的发病与柯萨奇病毒感染有关。现就这方面的研 究进展情况综述如下。
1 柯萨奇病毒的一般特征
柯萨奇病毒(Coxsackievirus, CV)属微核糖核酸病毒科，肠道病毒属。无囊膜、耐 乙醚、二十面体核衣壳，直径20～30nm，基因组为线状的片段、单股RNA，相对分子质量 2.5×106。该病毒分为A、B两组，A组有1～24个血清型，B组有1～6个血清型[2 ]。研究表明，柯萨奇B组病毒(CVB)与人类心肌炎有关，特别是CVB2、B3、B4、B 5型。CVB感染后可在咽部和肠粘膜细胞中增殖，然后由血流转入靶器官，如心肌等组织。
2 克山病患者CVB分离和检测
自50年代起，克山病研究工作者就开展了克山病有关病毒病因方面的研究，从克山病患者早 期血液、尸检心肌组织中分离到多株柯萨奇病毒。重庆医学院于1973～1977年自四川大竹县 169份克山病病理材料中分离出柯萨奇B1、B4型病毒[3]。黑龙江吴振荣等 从29例急型、亚急型克山病患者分离出柯萨奇B2病毒1株。1977年苏诚钦等从1例亚急型 克山病患者血清中分离出柯萨奇B4型病毒，将该毒株接种到新生小白鼠后，小白鼠心肌肌 束间及心肌细胞内均发生空泡病变[4]。汪国芹等报道从3例病理诊断为亚急型克 山病尸检脏器中分离到3株稳定毒株，经鉴定为柯萨奇B2、A9和未定型1株，电镜下 显示为2 8～32nm小RNA无囊膜肠道病毒属病毒颗粒[5]。但冯树翼等在甘肃地区27例克山病 尸解心脏、血液，用人胚肾、人胚肺、地鼠肾分离培养均未发现病毒。总的来看，克山病患 者体内柯萨奇病毒分离的阳性率不高，型别还比较分散。
在血清学方面，抗病毒抗体的检测报道较多。仇素英等测定了克山病患者血清中柯萨奇 B组病毒中和抗体滴度，23份血清中含有柯萨奇B抗体者17份，其中包含柯萨奇B1、B2 、B3和B4。患者双份血清恢复期抗体滴度呈4倍增高者6份，急性期抗体滴度高达1∶ 64以上者4份。黑龙江地研所、甘肃地研所均对克山病患者双份血清进行柯萨奇B组抗体测 定，呈4倍增高者分别为50%、35%。张鸿源[6]对34例亚急型克山病患者血清 CVB1～6中和抗体测定，结果呈4倍增高者达67.9%，对30例亚急克血清CVB1～ 6 IgM抗体 测定阳性率达66.6%。孙利群对30例亚急克血清CVB1～6 IgM抗体检测，结果同张鸿 源报道 一致，但型别分布以B3、B5为多。笔者对21例潜在型、慢型克山病患者血清CVB 1～6 Ig M,IgG进行检测，结果CVB1～6 IgM阳性率明显高于非病区健康对照组，但明显低于 心肌炎组； CVB1～6 IgG阳性率亦明显高于非病区健康对照组，但与心肌炎组相近，表明潜在型 、慢型克山 病患者有新近CVB感染的证据，提示在克山病的发生和发展中有CVB感染参与的可能[7 ]。以上研究结果表明，克山病患者的柯萨奇B组病毒感染率较高，但型别比较分散。
近年来，随着现代分子生物学技术的推广和应用，采用核酸杂交技术证实了亚急型、慢型克 山病死亡患者心肌组织中有柯萨奇B组病毒RNA存在。1993年钟学宽等[8]用CVBcDN A探针与云南亚急型克山病尸检心肌组织切片原位杂交，证实90%病例心肌组织中有CVB RNA 存在。李延文等[9]运用PCR技术和核酸杂交证实70年代亚急型克山病死亡患者心 肌蜡块中柯萨奇病毒B4的阳性率高达90%。钟学宽[10]、牛美娟[11] 、周令望[12]等相继用原位核酸杂交法检测山东、云南、黑龙江慢型克山病患 者柯萨奇B组病毒RNA ，阳性率分别为64%、73.3%和69.2%。以上研究结果提示，在克山病 发生和发展中有柯萨奇病毒的感染和参与，柯萨奇B组病毒感染可能是克山病致病因素之一 。但还有待进一步流行病学和实验研究证实。
3 硒与CVB
3.1 硒对CVB5在细胞内复制的影响 赵冬玲等 [13]将0.25ml病毒液(CVB5)与等量维持液混合，对照组维持液中不加Na2SeO3 ，实验组维持液中加Na2SeO3 0.5μg/ml,0.05μg/ml,4℃作用2h，分别进行毒力测定。 结果维持液中加Na3SeO3与不加Na2SeO3组病毒毒力相同，证明硒对病毒没有直接灭 活作用。用加Na2SeO3 0.05～0.5μg/ml的营养液连续传代细胞与营养液中不加Na2SeO 3的对照组比较，观察对病毒复制的影响，结果显示：加Na2SeO3的营养液培养的第1 、2代细胞存活率、病毒增殖量与对照组无明显差异，但从第3代起至第10代，细胞存活率明 显提高，病毒在细胞内增殖量明显降低。进一步做加硒培养的第4代细胞感染CVB5病毒的 动 态观察，发现对照组和实验组病毒吸附和穿入到细胞内的量是相同的，而且随着时间的变化 ，对照组病毒增殖量明显高于实验组，活细胞百分率对照组明显低于实验组，表明这种抑制 病毒增殖的主要作用环节可能在影响病毒的生物合成阶段。
3.2 硒对CVB4感染小鼠心脏改变的影响 白锦等 [14]将从亚急型克山病患儿血液中分离得到的柯萨奇B4型病毒，感染其亲代饲 以低硒病区饲料、病区加硒饲料、半合成饲料、半合成加硒饲料和常备饲料的7日龄乳鼠， 结果发现，各组的心脏病变检出率和病变的严重程度与血硒水平呈相反的关系，即血硒越高 的组，其心脏病变检出率越低，病变也越轻；进食同一饲料的动物(病区粮与病区加硒粮， 或 合成饲料与合成加硒饲料)，其子代心肌坏死检出率补硒组均显著低于未补硒组，且与常备 组无显著差异。说明缺硒乳鼠的心脏对病毒的侵犯更为敏感；换句话说补硒对柯萨奇B 4病毒引起的心肌坏死有显著的保护作用。
3.3 柯萨奇B3病毒在缺硒小鼠体内毒性增加 为了 确定硒缺乏是否影响CVB3/20感染的病理后果，Beck[15，16]观察了在 接种单克隆、测序的致心肌炎病毒CVB3/20后，感染小鼠心脏组织的病理学改变。发现 缺硒饲料喂养4周后，小鼠心肌损害比补适量硒小鼠发生的早且严重，接种7天时，适量硒小 鼠心脏显示很轻或不显示病理改变，而缺硒小鼠有明显病理改变。接种14和21d时，适量 硒小鼠心脏仅有中等病理损害(炎性浸润)，而缺硒小鼠具有严重心肌损害(炎性浸润和坏死) 。表明硒缺乏增加了CVB3感染的致心肌炎潜力。同时检测感染后不同时间心脏病毒滴度 ，发现CVB3/20感染的缺硒小鼠在接种7、10、21d病毒滴度均高于适量硒小鼠，且持 续时间长。
为了确定宿主反应的作用，在接种7d时从缺硒或适量硒小鼠分离病毒，在Hela细胞传代一次 ，测定滴度，并接种到7周龄适量硒小鼠，7d后处死取心脏做病理检查和心脏病毒滴度测定 。结果显示：将感染CVB3/20适量硒小鼠分离的病毒接种到适量硒小鼠，在接种后7 d时引起很轻或不引起病理改变，病毒滴度相对较低，毒性程度与未传代的CVB3/20相 似 。然而，经缺硒小鼠传代的病毒在适量硒小鼠的毒性比在适量硒小鼠分离的病毒毒性大，心 脏病毒滴度也明显增高，说明CVB3/20接种至缺硒小鼠时所观察到的表型改变，再将 分离出的病毒传代至适量硒小鼠时仍被保持[17]。与适量硒小鼠相比，缺硒小鼠 心、肝、脾和血清病毒滴度较高。提示，较高的病毒复制率可能增加了突变发生的机会。
3.4 人良性肠道病毒在缺硒小鼠体内变成有毒病毒 B eck等[18]用适量硒或缺硒饲料喂养小鼠(C3H/HEJ，雄性)4周，接种无 毒CVB3/0，分别于接毒7、14、21d处死，取血和心脏，结果与不发生心脏病变的感染适 量 硒小鼠相比，接种不致心肌炎病毒的缺硒小鼠出现明显的心肌病变。即在接种后第7天，缺 硒感染小鼠心脏显示病变，而适量硒感染小鼠直至接种第21天也未发现病变。提示缺硒小鼠 心脏损害的出现可能与病毒复制形式改变有关 。为证实这一点，测定心脏病毒滴度发现，接种CVB3/0的缺硒小鼠病毒滴度比适量硒 小鼠高10倍，且持续时间长。
为确定病毒毒性增加是否由不致心肌炎病毒基因突变的结果，将CVB3/0感染的缺 硒或 适量硒供体小鼠心脏分离的病毒接种到适量硒受体小鼠，发现，接种从缺硒供体小鼠获 得的CVB3/0的适量硒小鼠心肌显示明显的心肌炎改变，而接种从适量硒供体小鼠分离 的CVB3/0的适量硒小鼠心脏正常，前者的心脏病毒滴度比后者高300倍。结果提示，由 于在缺硒宿主体内复制结果而引起基因突变，使不致心肌炎的CVB3/0突变为致心肌炎 病毒，并且传代至适量硒宿主时仍有毒性。
1995年Beck[19]把从缺硒小鼠分离到的CVB3/0进行测序，并与原来不致心肌炎 的CVB3/0进行对比，发现6个核苷酸突变位点(234、788、2271、2438、3324和7334) 。同时将这些序列改变同已知致心肌炎株(CVB3/20)比较，发现所有6个核苷酸是一 样的，只有2690位点的核苷酸没有改变。
3.5 硒缺乏宿主CVB3毒性增强的机制 硒缺乏小鼠 体内CVB3突变发生的机制尚不清楚，设想可能是氧化性损害的增加，快速复制和缺乏校 对能力三个因素相互作用的结果。具有抗氧化作用的硒缺乏可使病毒引起的心脏病理损害加 剧，提示宿主氧化应激增加。氧化应激状态可导致自由基增加，后者可损害细胞膜、细胞蛋 白和DNA，自由基增加可影响免疫系统或改变心肌细胞膜及代谢，使病毒达到较高滴度并持 续较长时间。病毒逃避了正常清除机制从而有较长的复制时间，也可增加突变的机会。
柯萨奇病毒是一种RNA病毒，其突变率每个核苷酸拷贝为10-3～10-5， 这意味着每个基因突变率至少比白细胞DNA高10倍。这种差异的生物学基础是因为缺乏DNA病 毒所具有的识别和修复复制误差的校对机制(RNA校对复制酶)，如在抗氧化剂(硒或Vit E)缺 乏情况下则可能进一步加速病毒已经较高的RNA基因组演化率，产生更多的遗传误差。
新近研究表明，柯萨奇病毒B3还有编码硒蛋白的启动子，在正常硒水平条件下，柯萨奇 病毒B3可以表达硒蛋白，柯萨奇病毒B3表达的硒蛋白具有抑制病毒自身复制作用。但 在低硒条件下，柯萨奇病毒B3不能够表达硒蛋白，其抑制自身复制作用消失，使得柯萨 奇病毒B3在体内大量复制，心脏病毒滴度增加，对心脏细胞造成直接破坏[20] 。这是低硒条件下柯萨奇病毒B3致病的机制之一。
4 展 望
近年来，关于低硒与其相关因素与克山病发病关系的研究已取得一些进展，就现有资料来看 ，克山病无疑是一种由复合致病因素引起的地方性心肌病。低硒是决定克山病地区性分布的 基本病因，同时还得有一些诱发因素(条件因素)参与作用。这些因素并不存在明显的地区性 差异，但能对克山病的临床发病、年度多发、季节多发发挥重要影响。从以上克山病病毒病 因及有关动物实验研究表明，在克山病的发生和发展过程中可能有CVB感染参与，但这种感 染在克山病发病中究竟起什么作用，是主要原因还是条件因素，还需进一步做如下工作。① 把柯萨奇病毒RNA的检测与克山病的临床经过和病理改变密切结合起来；②扩大对照，除病 区和非病区健康对照外，还应与非病区心肌炎、心肌病病例进行比较研究；③对克山病病情 的监测，除病区人群外，还应密切注视邻近非病区心肌炎流行情况[21]；④采用 PCR及核酸测序技术，对病区新发克山病患者血液中的柯萨奇病毒B3易变区进行扩增、酶 切分析和测序，并与非病区心肌炎患者血液中的柯萨毒B3易变区基因序列进行 对比研究，这将为揭示该病发病机制提供新的信息。
陕西省科委基金资助项目
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(1999-07-10收稿 1999-09-05修回)
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