一氧化氮对培养的大鼠垂体组织催乳素释放的影响
http://www.100md.com
周劲松. 宋天保.
参见附件(174kb)。
作者：周劲松 宋天保
单位：(西安医科大学组织胚胎学教研室 西安 710061)
关键词：一氧化氮；催乳素；组织培养；垂体
西安医科大学学报000202 摘要 将大鼠垂体组织培养于KRB缓冲液中并加入不同浓度的一氧化氮生成抑制剂L-硝基精氨酸甲酯或一氧化氮供体硝普钠，孵育60min，收集KRB。用放射免疫法测定KRB中催乳素的含量。结果显示：L-硝基精氨酸甲酯和硝普钠能以剂量依赖性方式刺激和抑制垂体组织释放催乳素，提示一氧化氮对催乳素的分泌有抑制作用。
中图分类号 R329.3 文献标识码 A 文章编号 0258-0659(2000)02-0095-02
Influence of nitric oxide on prolactin release of cultured pituitary tissue from rats
Zhou Jinsong Song Tianbao
(Department of Histology and Embryology,Xi′an Medical University, Xi′an 710061,China)
ABSTRACT Various concentration of nitro-L-arginine methyl ester (nitric oxide synthase inhibitor) and sodium nitroprusside (nitric oxide donor ) were added into KRB buffer, in which rats pituitary tissue was cultured.After 60min,KRB were collected and the content of PRL were determined by RIA.The results showed that nitro-L-arginine methyl ester and sodium nitroprusside could stimuate or inhibit prolactin release from rats pituitary tissue in a dose-dependent manner.It suggests nitric oxide may play an inhibition role for prolactin secretion.
KEY WORDS nitric oxide prolactin tissue culture pituitary
一氧化氮(Nitric oxide ,NO)是一种结构简单、半衰期短且化学性质非常活泼的气体信息分子。在体内，NO由NO合酶(Nitric Oxide synthase,NOS)通过氧化L-精氨酸(L-Arg)末端的一个胍基氮而产生，同时伴随着cAMP浓度上升。近年来研究发现，垂体前叶内分布有大量的NOS阳性细胞和纤维，提示NO可能影响垂体前叶的激素释放[1]，国内尚无此方面报道，国外研究不多，结果不一[2，3]。本实验利用组织培养方法，观察NO生成抑制剂L-硝基精氨酸甲酯(L-NAME)和NO供体硝普钠(SNP)对垂体前叶催乳素(PRL)的影响，以期深入研究NO对垂体前叶功能的调节。
1 材料和方法
1.1 垂体组织培养 选用体重150g左右的健康雄性SD大鼠，断头处死后迅速取脑垂体，用KRB缓冲液(pH 7.4)洗净后纵切为二，浸入1ml KRB中，置24孔培养板内，37℃下孵育60min。
1.2 L-NAME和SNP对垂体PRL释放的影响 更换KRB 1ml，并在KRB中分别加入终浓度为0.5×10-3、1×10-3和5×10-3mol/L的L-NAME和SNP，继续孵育60min后吸取KRB，用化学发光法测定KRB中NO的含量，并用放射免疫法测定KRB中PRL含量。
1.2.1 化学发光法 测定步骤如下(南京聚力生物医学研究所)：试剂1：NADPH(还原辅酶Ⅱ)和黄素腺嘌呤二核苷酸(FAD)。试剂2：硝酸还原酶。试剂3：盐酸。试剂4：氯丙嗪。测定步骤：①标准管(S)、样本管(U)和空白管(B)中各加入100μl的标准液、样本和双蒸水。②加入0.1ml试剂1，再在液面上方加入50μl的试剂2，充分混匀后，37℃水浴1h。③各加0.5ml的试剂3和试剂4，充分混匀后，室温静置10min。④B管调零，540nm,0.5cm比色杯测定消光值。⑤计算：NOμmol/L=(样品管消光值/标准管消光值)×100。
1.2.2 放免测定法 测定步骤如下：①在各有200μl的NSB、样本和一系列(0～100ng/ml)标准双管中加入100μl的125I-PRL溶液。②各加入PRL 抗体100μl(NSB管中加入100μl双蒸水)，37℃孵育3.5h。③加入PEG-第二抗体溶液500μl，混匀后3 500r/min离心20min，测定沉淀物的CPM值。④计算标准双管CPM平均值。⑤按B/B0%=(B-NSB)/(B0-NSB)×100%公式计算出标准管和样品的B/B0%。其中B代表每对试管的CPM均值，B0代表0标准管CPM均值，NSB代表非特异性结合的双管CPM均值。⑥以各标准管B/B0%为纵轴，标准管PRL含量为横轴作标准曲线，查得样本的PRL含量。
1.3 统计学处理 用t检验检测各组间差异之显著性。
2 结 果
2.1 L-NAME对垂体PRL释放的影响 随着L-NAME浓度的升高，KRB液中的NO含量降低，而PRL含量却迅速上升，且各组间有显著性差异(P<0.01)(见表1)。
2.2 SNP对垂体PRL释放的影响 NO含量随SNP浓度上升而上升，而PRL含量却逐渐下降，且各组间有显著性差异(P<0.01)(见表2)。
表1 L-NAME对垂体PRL释放的影响(
±s,n=4)
组别
L-NAME浓度(mol/L)
NO含量(μmol/L)
时间(min)
PRL含量(μg/L)
对照
0
2154.26±28.56
60
0.43±0.04
1
0.5×10-3
229.61±12.65
60
3.98±0.25
2
1×10-3
148.44±5.36＃
60
6.27±0.40＃
3
5×10-3
58.30±2.41＃△
60
7.62±0.39＃△
注：与对照组相比P<0.01,＃与第一组相比P<0.01,△与第二组相比P<0.01表2 SNP对垂体PRL释放的影响(±s,n=4) 组别
SNP浓度(mol/L)
NO含量(μmol/L)
时间(min)
PRL含量(μg/L)
对照
0
2.18±0.03
60
0.44±0.03
1
0.5×10-3
384.9±8.07
60
0.38±0.03
2
1×10-3
673.84±13.59＃
60
0.31±0.02＃
3
5×10-3
2790.25±65.88＃△
60
0.26±0.02＃△
注：与对照组相比P<0.01,＃与第一组相比P<0.01,△与第二组相比P<0.01
3 讨 论
NO参与体内多种生理和病理过程，如血管舒张、凝血、免疫、休克、记忆及细胞毒作用等。垂体前叶中存在大量NOS阳性细胞。这些细胞有些是内分泌细胞，有些则是滤泡星形细胞，且它们之间有明显的形态学联系，提示NO可能参与调节垂体前叶的激素分泌[1]。
NO对PRL分泌的影响已有报道，但结果不一[2，3]。给去卵巢猫腹腔注射雌二醇和孕酮后，可引起PRL大量释放，但若再注射L-NAME则逆转上述变化[2]。Brunetti等[4]用胰酶消化大鼠垂体组织后，用DMEM进行细胞培养，然后加入NOS竞争性抑制剂NG-硝基精氨酸(NNLA)，发现PRL释放量随NNLA浓度上升而下降。提示NO可促进PRL释放。但如果用KRB来培养垂体组织，SNP却使PRL分泌下降[3]；而能螯合NO的血红蛋白却使其分泌量增加[5]，说明NO抑制了PRL的分泌。本文结果与此相同，并发现NO对PRL释放的抑制作用具有剂量依赖性特点。
上述实验结果的不同，可能与实验动物，给药方式和实验条件等的不同有关。如在细胞培养时缺乏许多不明因素的影响，且培养液中已存在4×10-4mol/L的NOS底物(L-Arg)；而体内实验又存在多种因素干扰，如NO生成抑制剂或NO供体不仅仅可直接作用于垂体PRL细胞，也可作用于其他细胞如多巴胺分泌细胞[3]或影响孕酮分泌，从而间接干扰PRL的释放[6]，甚至可通过体内存在的兴奋性氨基酸(EAA)-NO系统来调节PRL释放[7]，使NO对PRL释放的影响复杂化。本实验通过组织培养方法，排除了细胞培养及体内实验时NO对PRL调节的不稳定性，又保留了PRL细胞周围业已存在的NOS阳性成分如滤泡星形细胞，从而使PRL细胞的微环境更接近于体内，因而能更直接地反映NO对PRL分泌的影响。
参考文献
1，Vankelecom H,Matthys P,Denet C.Inducible nitric oxide synthase in the anterior pituitary gland:induction by interferon-γ in a subpopulation of folliculostellate cells and in an unidentifiable population of non-hormone-secreting cells[J].J Histo Cytochem,1997;45(6)∶847
2，Bonavera JJ,Sahu A, Karal PS et al.Evidence in support of nitric oxide(NO) involvement in the cyclic release of prolactin and LH surges[J].Brain Res,1994;660(1)∶175
3，Duvilanski BH,Zambruno C,Seilicovich A et al.Role of nitric oxide in control of prolactin release by the adenohypophysis [J].Proc Nat1 Acad Sci USA,1995;92(1)∶170
4，Brunetti L,Ragazzoni Z,Preziosi P et al.A possible role for nitric oxide but not for prostaglandin E2 in basal and interleukin-l-β-induced PRL release[J].Life Sci,1995;56(15)∶277
5，Vankelecom H,Matthys P,Denet C.Involvement of nitric oxide in the interferon gamma induced hormone and prolactin secretion in anterior pituitary cell culture[J].Mol Cell Endocrinol,1997;129(2)∶157
6，Yamauchi J,Miyazaki M,Lwasaki S et al.Effects of nitric oxide on ovalation and ovarian steroidogenesis and prostaglandin production in the rabbit[J].Endocrinol,1997;138(9)∶3630
7，Liu Y,Shenouda D,Bilfinger TV et al.Morphine stimulates nitric oxide release from invertebrate microglia[J].Brain Res,1996;722(1～2)∶125
(1999-07-18收稿 1999-09-26修回)
作者：周劲松 宋天保
单位：(西安医科大学组织胚胎学教研室 西安 710061)
关键词：一氧化氮；催乳素；组织培养；垂体
西安医科大学学报000202 摘要 将大鼠垂体组织培养于KRB缓冲液中并加入不同浓度的一氧化氮生成抑制剂L-硝基精氨酸甲酯或一氧化氮供体硝普钠，孵育60min，收集KRB。用放射免疫法测定KRB中催乳素的含量。结果显示：L-硝基精氨酸甲酯和硝普钠能以剂量依赖性方式刺激和抑制垂体组织释放催乳素，提示一氧化氮对催乳素的分泌有抑制作用。
中图分类号 R329.3 文献标识码 A 文章编号 0258-0659(2000)02-0095-02
Influence of nitric oxide on prolactin release of cultured pituitary tissue from rats
Zhou Jinsong Song Tianbao
(Department of Histology and Embryology,Xi′an Medical University, Xi′an 710061,China)
ABSTRACT Various concentration of nitro-L-arginine methyl ester (nitric oxide synthase inhibitor) and sodium nitroprusside (nitric oxide donor ) were added into KRB buffer, in which rats pituitary tissue was cultured.After 60min,KRB were collected and the content of PRL were determined by RIA.The results showed that nitro-L-arginine methyl ester and sodium nitroprusside could stimuate or inhibit prolactin release from rats pituitary tissue in a dose-dependent manner.It suggests nitric oxide may play an inhibition role for prolactin secretion.
KEY WORDS nitric oxide prolactin tissue culture pituitary
一氧化氮(Nitric oxide ,NO)是一种结构简单、半衰期短且化学性质非常活泼的气体信息分子。在体内，NO由NO合酶(Nitric Oxide synthase,NOS)通过氧化L-精氨酸(L-Arg)末端的一个胍基氮而产生，同时伴随着cAMP浓度上升。近年来研究发现，垂体前叶内分布有大量的NOS阳性细胞和纤维，提示NO可能影响垂体前叶的激素释放[1]，国内尚无此方面报道，国外研究不多，结果不一[2，3]。本实验利用组织培养方法，观察NO生成抑制剂L-硝基精氨酸甲酯(L-NAME)和NO供体硝普钠(SNP)对垂体前叶催乳素(PRL)的影响，以期深入研究NO对垂体前叶功能的调节。
1 材料和方法
1.1 垂体组织培养 选用体重150g左右的健康雄性SD大鼠，断头处死后迅速取脑垂体，用KRB缓冲液(pH 7.4)洗净后纵切为二，浸入1ml KRB中，置24孔培养板内，37℃下孵育60min。
1.2 L-NAME和SNP对垂体PRL释放的影响 更换KRB 1ml，并在KRB中分别加入终浓度为0.5×10-3、1×10-3和5×10-3mol/L的L-NAME和SNP，继续孵育60min后吸取KRB，用化学发光法测定KRB中NO的含量，并用放射免疫法测定KRB中PRL含量。
1.2.1 化学发光法 测定步骤如下(南京聚力生物医学研究所)：试剂1：NADPH(还原辅酶Ⅱ)和黄素腺嘌呤二核苷酸(FAD)。试剂2：硝酸还原酶。试剂3：盐酸。试剂4：氯丙嗪。测定步骤：①标准管(S)、样本管(U)和空白管(B)中各加入100μl的标准液、样本和双蒸水。②加入0.1ml试剂1，再在液面上方加入50μl的试剂2，充分混匀后，37℃水浴1h。③各加0.5ml的试剂3和试剂4，充分混匀后，室温静置10min。④B管调零，540nm,0.5cm比色杯测定消光值。⑤计算：NOμmol/L=(样品管消光值/标准管消光值)×100。
1.2.2 放免测定法 测定步骤如下：①在各有200μl的NSB、样本和一系列(0～100ng/ml)标准双管中加入100μl的125I-PRL溶液。②各加入PRL 抗体100μl(NSB管中加入100μl双蒸水)，37℃孵育3.5h。③加入PEG-第二抗体溶液500μl，混匀后3 500r/min离心20min，测定沉淀物的CPM值。④计算标准双管CPM平均值。⑤按B/B0%=(B-NSB)/(B0-NSB)×100%公式计算出标准管和样品的B/B0%。其中B代表每对试管的CPM均值，B0代表0标准管CPM均值，NSB代表非特异性结合的双管CPM均值。⑥以各标准管B/B0%为纵轴，标准管PRL含量为横轴作标准曲线，查得样本的PRL含量。
1.3 统计学处理 用t检验检测各组间差异之显著性。
2 结 果
2.1 L-NAME对垂体PRL释放的影响 随着L-NAME浓度的升高，KRB液中的NO含量降低，而PRL含量却迅速上升，且各组间有显著性差异(P<0.01)(见表1)。
2.2 SNP对垂体PRL释放的影响 NO含量随SNP浓度上升而上升，而PRL含量却逐渐下降，且各组间有显著性差异(P<0.01)(见表2)。
表1 L-NAME对垂体PRL释放的影响(
±s,n=4)组别
L-NAME浓度(mol/L)
NO含量(μmol/L)
时间(min)
PRL含量(μg/L)
对照
0
2154.26±28.56
60
0.43±0.04
1
0.5×10-3
229.61±12.65
60
3.98±0.25
2
1×10-3
148.44±5.36＃
60
6.27±0.40＃
3
5×10-3
58.30±2.41＃△
60
7.62±0.39＃△
注：与对照组相比P<0.01,＃与第一组相比P<0.01,△与第二组相比P<0.01表2 SNP对垂体PRL释放的影响(
±s,n=4) 组别SNP浓度(mol/L)
NO含量(μmol/L)
时间(min)
PRL含量(μg/L)
对照
0
2.18±0.03
60
0.44±0.03
1
0.5×10-3
384.9±8.07
60
0.38±0.03
2
1×10-3
673.84±13.59＃
60
0.31±0.02＃
3
5×10-3
2790.25±65.88＃△
60
0.26±0.02＃△
注：与对照组相比P<0.01,＃与第一组相比P<0.01,△与第二组相比P<0.01
3 讨 论
NO参与体内多种生理和病理过程，如血管舒张、凝血、免疫、休克、记忆及细胞毒作用等。垂体前叶中存在大量NOS阳性细胞。这些细胞有些是内分泌细胞，有些则是滤泡星形细胞，且它们之间有明显的形态学联系，提示NO可能参与调节垂体前叶的激素分泌[1]。
NO对PRL分泌的影响已有报道，但结果不一[2，3]。给去卵巢猫腹腔注射雌二醇和孕酮后，可引起PRL大量释放，但若再注射L-NAME则逆转上述变化[2]。Brunetti等[4]用胰酶消化大鼠垂体组织后，用DMEM进行细胞培养，然后加入NOS竞争性抑制剂NG-硝基精氨酸(NNLA)，发现PRL释放量随NNLA浓度上升而下降。提示NO可促进PRL释放。但如果用KRB来培养垂体组织，SNP却使PRL分泌下降[3]；而能螯合NO的血红蛋白却使其分泌量增加[5]，说明NO抑制了PRL的分泌。本文结果与此相同，并发现NO对PRL释放的抑制作用具有剂量依赖性特点。
上述实验结果的不同，可能与实验动物，给药方式和实验条件等的不同有关。如在细胞培养时缺乏许多不明因素的影响，且培养液中已存在4×10-4mol/L的NOS底物(L-Arg)；而体内实验又存在多种因素干扰，如NO生成抑制剂或NO供体不仅仅可直接作用于垂体PRL细胞，也可作用于其他细胞如多巴胺分泌细胞[3]或影响孕酮分泌，从而间接干扰PRL的释放[6]，甚至可通过体内存在的兴奋性氨基酸(EAA)-NO系统来调节PRL释放[7]，使NO对PRL释放的影响复杂化。本实验通过组织培养方法，排除了细胞培养及体内实验时NO对PRL调节的不稳定性，又保留了PRL细胞周围业已存在的NOS阳性成分如滤泡星形细胞，从而使PRL细胞的微环境更接近于体内，因而能更直接地反映NO对PRL分泌的影响。
参考文献
1，Vankelecom H,Matthys P,Denet C.Inducible nitric oxide synthase in the anterior pituitary gland:induction by interferon-γ in a subpopulation of folliculostellate cells and in an unidentifiable population of non-hormone-secreting cells[J].J Histo Cytochem,1997;45(6)∶847
2，Bonavera JJ,Sahu A, Karal PS et al.Evidence in support of nitric oxide(NO) involvement in the cyclic release of prolactin and LH surges[J].Brain Res,1994;660(1)∶175
3，Duvilanski BH,Zambruno C,Seilicovich A et al.Role of nitric oxide in control of prolactin release by the adenohypophysis [J].Proc Nat1 Acad Sci USA,1995;92(1)∶170
4，Brunetti L,Ragazzoni Z,Preziosi P et al.A possible role for nitric oxide but not for prostaglandin E2 in basal and interleukin-l-β-induced PRL release[J].Life Sci,1995;56(15)∶277
5，Vankelecom H,Matthys P,Denet C.Involvement of nitric oxide in the interferon gamma induced hormone and prolactin secretion in anterior pituitary cell culture[J].Mol Cell Endocrinol,1997;129(2)∶157
6，Yamauchi J,Miyazaki M,Lwasaki S et al.Effects of nitric oxide on ovalation and ovarian steroidogenesis and prostaglandin production in the rabbit[J].Endocrinol,1997;138(9)∶3630
7，Liu Y,Shenouda D,Bilfinger TV et al.Morphine stimulates nitric oxide release from invertebrate microglia[J].Brain Res,1996;722(1～2)∶125
(1999-07-18收稿 1999-09-26修回)
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