非何杰金淋巴瘤P16基因缺失及其与组织亚型和治疗的关系
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姚红霞. 胡志华. 苏群豪. 陈志斌.
非何杰金淋巴瘤.P16基因.缺失.组织亚型.
参见附件(174kb)。
作者：姚红霞 胡志华 苏群豪 陈志斌 李淑萍 柴玲
单位：(海南医学院附院血液科,海口 570102)
关键词：非何杰金淋巴瘤；P16基因；缺失；组织亚型
西安医科大学学报000312摘 要：目的 探讨非何杰金淋巴瘤(NHL)中P16基因缺失情况及其与组织亚型和治疗的关系。方法 采用聚合酶链反应-单链构象多态银染技术(PCR-SSCP)检测29例非何杰金淋巴瘤患者P16基因的变化。结果 29例非何杰金淋巴瘤中12例存在P16基因缺失，总缺失率41.3%；12例缺失中有6例在两个疗程化疗后缺失消失；高度恶性淋巴瘤缺失率高。结论 P16基因缺失在NHL发病中起一定作用，其发生率与组织亚型和治疗效果有关。
中图分类号：R733.1 文献标识码：A
文章编号：0258-0659(2000)03-0229-02
Study of P16 gene mutation and its correlation
with tissue subtype and effectiveness in
non-Hodgkin′s lymphoma
Yao Hongxia，Hu Zhihua，Su Qunhao
(Department of Hematology, Teaching Hospital ,Hainan Medical College, Haikou 570102,China)
ABSTRACT：Objective To investigate the alteration of P16 gene mutation and its correlation with tissue subtype and effectiveness in non-Hodgkin′s lymphoma (NHL).Methods A total of 29 human non-Hodgkin′s lymphoma were examined for mutations in exon 2 by using PCR-SSCP silver staining technique.Results Mutations were found in 12 out of 29 cases(41.3%) with non-Hodgkin′s lymphoma .No deletion was found in any of the low-grade NHL.The mutations of P16 gene disapperaed after treatment remission.Conclusion The mutation of P16 gene may be related with the occurrence, tissue subtype and effectiveness in NHL.
KEY WORDS: NHL;P16 gene ;mutation;PCR-SSCP
淋巴瘤是常见的血液肿瘤，中国人以非何杰金淋巴瘤发病为主，其发生发展与癌基因的激活及抑癌基因的失活有关。P16基因是新发现的一种抑癌基因，因其在细胞周期调控中起重要作用而倍受重视。目前国内外对P16基因的分析着重在突变类型，而对其突变与组织亚型及治疗关系的观察尚少。为此，本研究应用聚合酶链反应-单链DNA构象多态分析(PCR-SSCP)观察了非何杰金淋巴瘤P16基因的变化。
1 材料和方法
1.1 病例及取材 29例非何杰金淋巴瘤患者选自海南医学院及海南省人民医院，均经病理学及免疫学确诊。标本均在化疗前采取，对有突变病例于第2次化疗后复查P16基因，化疗方案为CHOP，疗程5d，每28d一个周期。正常对照组30例为健康体检者。
1.2 检测方法
1.2.1 DNA制备 先分离提取单个核细胞，加SDS饱和氯化钠离心，加乙醇沉淀DNA。
1.2.2 PCR扩增 根据P16基因序列设计第2外显子1对引物，上游：5′ AGCAGCATG GAGCCTTCGGCT3′,下游：5′TTTGA ATTCAATCGGGGATGTCTG3′。引物由解放军基因研究所合成，扩增产物220bp。扩增体系：总反应体积30μl，模板DNA 200ng，引物1μmol/L,Taq酶0.2μl。首次变性温度94℃ 1min，94℃35s、55℃45s、72℃50s，重复36个循环，72℃延伸3min，4℃终止反应。扩增产物于2.5%琼脂糖凝胶电泳后紫外灯下观察结果。Marker为PBR322/HaeⅢ。
1.2.3 SSCP和银染 取20μl PCR扩增产物加2μl溴酚兰混合后煮沸5min，速置冰水混合物5min，加入8%聚丙稀酰胺凝胶电泳3h(电压120V)后银染：10%乙醇、1%硝酸各浸泡5min，冲洗，再放入染色液中浸泡10min后冲洗，加显色液5～10min出现条带后用乙酸终止反应。
2 结果
2.1 PCR扩增结果 29例非何杰金淋巴瘤中P16基因缺失12例，缺失率占41.3%。见图1和图2。
图1 PCR扩增结果
M：Marker；+：阳性对照；NHL：非何杰金淋巴瘤
图2 PCR银染结果
M：Marker；N:正常对照；箭头示条带增多移位
2.2 P16基因缺失与病理类型的关系 29例非何杰金淋巴瘤中，低度恶性淋巴瘤13例，未见1例P16基因缺失(0/13)，高度恶性淋巴瘤16例，其中有10例缺失(10/16)，缺失率为62.5%。T细胞型淋巴瘤11例中有8例缺失(8/11)，缺失率72.7%，B细胞型淋巴瘤12例中有1例缺失(1/12)，缺失率8.3%。
2.3 P16基因缺失与治疗效果的关系 12例治疗前有P16基因缺失的病人，第二疗程联合化疗后有8例缺失消失，4例缺失存在。
3 讨论
P16基因为细胞周期依赖激酶(CDK)抑制蛋白基因家族中率先被克隆的EcoRI,片段长度约23kb,由3个外显子组成[1]，定位于染色体9p21区。细胞周期的正常演进依赖于周期蛋白(Cyclin)和抑制蛋白对CDK3的正负平衡调节作用。CyclinD与CDK4和CDK6结合，激活两者，导致PRb磷酸化，失去抑制转录因子启动DNA合成的作用，使细胞不能从G1期进入S期。Cyclin激活过程可因P16蛋白与CDK4结合而受抑制，P16对CyclinD/CDK4抑制作用的消失，细胞发生异常增生形成肿瘤[2]。
P16基因的功能失活形成主要包括基因的缺失、重排、突变和甲基化，其中以纯合缺失为主。P16在淋巴瘤中的不同亚型缺失率不同，总缺失率低于ALL，而高于其他造血系统肿瘤。Stranks[3]观察了14例非何杰金淋巴瘤患者细胞中有6例存在P16基因缺失，其中3例病人经历了从低度恶性向高度恶性的转变。Neumeister[4]用半定量PCR方法检测了胃肠型P16基因纯合缺失情况，发现在高度恶性淋巴瘤中缺失率达14%，而在低度恶性淋巴瘤中无缺失，认为P16基因缺失可能提示肿瘤从低度向高度恶性的转变。本组29例非何杰金淋巴瘤患者中有12例存在P16基因缺失，且高度恶性及B细胞型患者缺失率高，低度恶性淋巴瘤中未见缺失，与文献报道结果一致。Garcia[5]采用southern杂交分析103例非何杰金淋巴瘤病人，有7例存在P16基因的改变，其中4例为纯合缺失，3例是基因重排，他还作了P16基因突变的生存分析，发现P16基因异常与生存缩短一致，认为在对肿瘤的多种分析中，P16基因的异常应列为和LDH、β2-MG一样影响预后的因素。本文进行治疗前后对比，治疗前缺失12例病人中，在第二疗程联合化疗后有8例消失，4例缺失仍存在，后者为联合化疗效果欠佳病人，也说明了P16基因与治疗效果及预后的关系。
基金项目：海南省自然科学基金资助项目(No.39613)
参考文献：
[1] 赵温利，郭卫星，田志刚.肿瘤抑制基因P16的进展[J].国外医学肿瘤学分册，1997，24(4)∶199
[2] 刘明利.P16基因家族在血液系统恶性肿瘤中的研究新进展[J].国外医学输血及血液学分册，1997，20(4)∶206
[3]Stranks G,Height SE,Mitchell P,et al.Deletion and rearrangement of CDKN in lymphoid maligance[J].Blood ,1995，85(4)∶893
[4]Neumeister P, Hoefler G, Beham-Schmid S,et al.Deletion analysis of the P16 tumor suppressor gene in gastrointestinal mucosa associated lymphoid tissue lymphomas[J].Gastrointerology,1997，112(6)∶1871
[5] Garcia SR, Gonzalez M, Vargas M ,et al.Deletion and rerrangments of cyclin-dependent kinase 4 inhibitor gene p16 are associated with poor prognosis in B cell non-Hodgkin′s lymphomas[J].Leukemia， 1997，11(11)∶1915
(收稿日期:1999-10-22 修回日期：2000-02-23)
作者：姚红霞 胡志华 苏群豪 陈志斌 李淑萍 柴玲
单位：(海南医学院附院血液科,海口 570102)
关键词：非何杰金淋巴瘤；P16基因；缺失；组织亚型
西安医科大学学报000312摘 要：目的 探讨非何杰金淋巴瘤(NHL)中P16基因缺失情况及其与组织亚型和治疗的关系。方法 采用聚合酶链反应-单链构象多态银染技术(PCR-SSCP)检测29例非何杰金淋巴瘤患者P16基因的变化。结果 29例非何杰金淋巴瘤中12例存在P16基因缺失，总缺失率41.3%；12例缺失中有6例在两个疗程化疗后缺失消失；高度恶性淋巴瘤缺失率高。结论 P16基因缺失在NHL发病中起一定作用，其发生率与组织亚型和治疗效果有关。
中图分类号：R733.1 文献标识码：A
文章编号：0258-0659(2000)03-0229-02
Study of P16 gene mutation and its correlation
with tissue subtype and effectiveness in
non-Hodgkin′s lymphoma
Yao Hongxia，Hu Zhihua，Su Qunhao
(Department of Hematology, Teaching Hospital ,Hainan Medical College, Haikou 570102,China)
ABSTRACT：Objective To investigate the alteration of P16 gene mutation and its correlation with tissue subtype and effectiveness in non-Hodgkin′s lymphoma (NHL).Methods A total of 29 human non-Hodgkin′s lymphoma were examined for mutations in exon 2 by using PCR-SSCP silver staining technique.Results Mutations were found in 12 out of 29 cases(41.3%) with non-Hodgkin′s lymphoma .No deletion was found in any of the low-grade NHL.The mutations of P16 gene disapperaed after treatment remission.Conclusion The mutation of P16 gene may be related with the occurrence, tissue subtype and effectiveness in NHL.
KEY WORDS: NHL;P16 gene ;mutation;PCR-SSCP
淋巴瘤是常见的血液肿瘤，中国人以非何杰金淋巴瘤发病为主，其发生发展与癌基因的激活及抑癌基因的失活有关。P16基因是新发现的一种抑癌基因，因其在细胞周期调控中起重要作用而倍受重视。目前国内外对P16基因的分析着重在突变类型，而对其突变与组织亚型及治疗关系的观察尚少。为此，本研究应用聚合酶链反应-单链DNA构象多态分析(PCR-SSCP)观察了非何杰金淋巴瘤P16基因的变化。
1 材料和方法
1.1 病例及取材 29例非何杰金淋巴瘤患者选自海南医学院及海南省人民医院，均经病理学及免疫学确诊。标本均在化疗前采取，对有突变病例于第2次化疗后复查P16基因，化疗方案为CHOP，疗程5d，每28d一个周期。正常对照组30例为健康体检者。
1.2 检测方法
1.2.1 DNA制备 先分离提取单个核细胞，加SDS饱和氯化钠离心，加乙醇沉淀DNA。
1.2.2 PCR扩增 根据P16基因序列设计第2外显子1对引物，上游：5′ AGCAGCATG GAGCCTTCGGCT3′,下游：5′TTTGA ATTCAATCGGGGATGTCTG3′。引物由解放军基因研究所合成，扩增产物220bp。扩增体系：总反应体积30μl，模板DNA 200ng，引物1μmol/L,Taq酶0.2μl。首次变性温度94℃ 1min，94℃35s、55℃45s、72℃50s，重复36个循环，72℃延伸3min，4℃终止反应。扩增产物于2.5%琼脂糖凝胶电泳后紫外灯下观察结果。Marker为PBR322/HaeⅢ。
1.2.3 SSCP和银染 取20μl PCR扩增产物加2μl溴酚兰混合后煮沸5min，速置冰水混合物5min，加入8%聚丙稀酰胺凝胶电泳3h(电压120V)后银染：10%乙醇、1%硝酸各浸泡5min，冲洗，再放入染色液中浸泡10min后冲洗，加显色液5～10min出现条带后用乙酸终止反应。
2 结果
2.1 PCR扩增结果 29例非何杰金淋巴瘤中P16基因缺失12例，缺失率占41.3%。见图1和图2。
图1 PCR扩增结果
M：Marker；+：阳性对照；NHL：非何杰金淋巴瘤
图2 PCR银染结果
M：Marker；N:正常对照；箭头示条带增多移位
2.2 P16基因缺失与病理类型的关系 29例非何杰金淋巴瘤中，低度恶性淋巴瘤13例，未见1例P16基因缺失(0/13)，高度恶性淋巴瘤16例，其中有10例缺失(10/16)，缺失率为62.5%。T细胞型淋巴瘤11例中有8例缺失(8/11)，缺失率72.7%，B细胞型淋巴瘤12例中有1例缺失(1/12)，缺失率8.3%。
2.3 P16基因缺失与治疗效果的关系 12例治疗前有P16基因缺失的病人，第二疗程联合化疗后有8例缺失消失，4例缺失存在。
3 讨论
P16基因为细胞周期依赖激酶(CDK)抑制蛋白基因家族中率先被克隆的EcoRI,片段长度约23kb,由3个外显子组成[1]，定位于染色体9p21区。细胞周期的正常演进依赖于周期蛋白(Cyclin)和抑制蛋白对CDK3的正负平衡调节作用。CyclinD与CDK4和CDK6结合，激活两者，导致PRb磷酸化，失去抑制转录因子启动DNA合成的作用，使细胞不能从G1期进入S期。Cyclin激活过程可因P16蛋白与CDK4结合而受抑制，P16对CyclinD/CDK4抑制作用的消失，细胞发生异常增生形成肿瘤[2]。
P16基因的功能失活形成主要包括基因的缺失、重排、突变和甲基化，其中以纯合缺失为主。P16在淋巴瘤中的不同亚型缺失率不同，总缺失率低于ALL，而高于其他造血系统肿瘤。Stranks[3]观察了14例非何杰金淋巴瘤患者细胞中有6例存在P16基因缺失，其中3例病人经历了从低度恶性向高度恶性的转变。Neumeister[4]用半定量PCR方法检测了胃肠型P16基因纯合缺失情况，发现在高度恶性淋巴瘤中缺失率达14%，而在低度恶性淋巴瘤中无缺失，认为P16基因缺失可能提示肿瘤从低度向高度恶性的转变。本组29例非何杰金淋巴瘤患者中有12例存在P16基因缺失，且高度恶性及B细胞型患者缺失率高，低度恶性淋巴瘤中未见缺失，与文献报道结果一致。Garcia[5]采用southern杂交分析103例非何杰金淋巴瘤病人，有7例存在P16基因的改变，其中4例为纯合缺失，3例是基因重排，他还作了P16基因突变的生存分析，发现P16基因异常与生存缩短一致，认为在对肿瘤的多种分析中，P16基因的异常应列为和LDH、β2-MG一样影响预后的因素。本文进行治疗前后对比，治疗前缺失12例病人中，在第二疗程联合化疗后有8例消失，4例缺失仍存在，后者为联合化疗效果欠佳病人，也说明了P16基因与治疗效果及预后的关系。
基金项目：海南省自然科学基金资助项目(No.39613)
参考文献：
[1] 赵温利，郭卫星，田志刚.肿瘤抑制基因P16的进展[J].国外医学肿瘤学分册，1997，24(4)∶199
[2] 刘明利.P16基因家族在血液系统恶性肿瘤中的研究新进展[J].国外医学输血及血液学分册，1997，20(4)∶206
[3]Stranks G,Height SE,Mitchell P,et al.Deletion and rearrangement of CDKN in lymphoid maligance[J].Blood ,1995，85(4)∶893
[4]Neumeister P, Hoefler G, Beham-Schmid S,et al.Deletion analysis of the P16 tumor suppressor gene in gastrointestinal mucosa associated lymphoid tissue lymphomas[J].Gastrointerology,1997，112(6)∶1871
[5] Garcia SR, Gonzalez M, Vargas M ,et al.Deletion and rerrangments of cyclin-dependent kinase 4 inhibitor gene p16 are associated with poor prognosis in B cell non-Hodgkin′s lymphomas[J].Leukemia， 1997，11(11)∶1915
(收稿日期:1999-10-22 修回日期：2000-02-23)
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