黄芪与当归对人脐静脉内皮细胞增殖及VEGF表达的影响
摘要：目的： 探讨黄芪与当归对内皮细胞(ECs)增殖周期及血管内皮细胞生长因子(VEGF)表达的影响。方法： 以体外培养人脐静脉内皮细胞(HUVEC)为模型，HUVEC经分离、原代和传代培养与鉴定，选择第4或第5代细胞进行实验；MTT法检测不同剂量黄芪与当归对细胞增殖的影响；流式细胞仪检测黄芪与当归对HUVEC增殖周期的影响；半定量RTPCR检测黄芪与当归对HUVEC的VEGF mRNA表达的影响。结果：细胞周期检测显示黄芪及当归组S期细胞数显著增多(P<0.01)。黄芪+当归组G0G1期细胞数明显减少(P<0.05)，S期和G2M期细胞数明显增多(P<0.05)。 RTPCR结果表明，黄芪与当归使HUVEC的VEGF mRNA表达明显增强，黄芪+当归(200 μg/ml)组是对照组的1.82倍；当归(200 μg/ml)组是对照组的1.88倍；黄芪(200 μg/ml)组是对照组的1.51倍。结论：黄芪与当归及其复方具有促进内皮细胞增殖作用，黄芪+当归可明显促进HUVEC的DNA合成及有丝分裂。黄芪与当归可促进HUVEC的VEGF mRNA表达，提示黄芪与当归通过刺激VEGF表达而促血管新生。
关键词： 内皮细胞; 内皮细胞生长因子; 细胞增殖; 黄芪; 当归
Culture of human umbilical vein endothelial cells in vitro and effects of astragalus
membranaceus and angelica sinensis on vascular endothelial growth factor
LI Yueshan, ZHANG Jianlong, XUE Lei
(Department of Pathophysiology, Xinjiang Medical University, Urumqi 830054, China)
Abstract Objective: To investigate the effects of astragalus membranaceus and angelica sinensis on the proliferation of endothelial cells, cell cycle and the expression of vascular endothelial growth factor(VEGF) mRNA in human umbilical vein endothelial cells (HUVEC ). Methods: To culture human umbilical vein endothelial cells as target cells in vitro. Factor Ⅷrelated antigen determined was masculine in the cultures, with monoclonal antibody and SABC immunohistochemistry kit. The proliferation of HUVEC in different concentrations of astragalus membranaceus, angelica sinensis, that include 100, 200, 400 μg/ml，were observed with MTT method. The changes of cell cycle of the cultures after administration of astragalus membranaceus, angelica sinensis in 200 μg/ml were observed using flow cytometer. The decoction of them on VEGF mRNA expression of HUVEC were observed by using RTPCR method. Results: The contribution of astragalus membranaceus in 200 μg/ml concentration and the decoction in 200, 400 μg/ml concentration was most evident. The decoction of astragalus membranaceus and angelica sinensis enhanced the synthesis of DNA and mitosis in cultured endothelial cells. The cultures treated with astragalus membranaceus, angelica sinensis, and the decoction in 200 μg/ml showed increased VEGF gene expression respectively as compared with negative control. Conclution: Astragalus membranaceus, angelica sinensis, and the decoction of them promoted proliferation of cultured HUVEC in vitro, increased the mRNA and expression of VEGF in the cultured HUVEC.
Key words: vascular endothelial growth factor; astragalus memb ranaceus; angelica sinensis; endothelial cells; proliferation
血管内皮细胞(EC)在血管新生中发挥重要作用[1]，将血管内皮细胞培养在适当的细胞外基质中，在各种促血管新生因子的作用下可以形成毛细血管样的网络结构和血管样结构[2]，而加入抑制血管新生的药物可以引起网络样结构或血管样结构的破坏。因此血管内皮细胞的培养已成为研究血管新生的发生、发展、影响因素及其调控机制等方面的细胞模型。
血管内皮细胞生长因子(VEGF)特异性作用于血管内皮细胞，可促血管新生。中医药关于活血化瘀、益气补血等药物的研究为中药促血管新生的研究提供了重要线索。其中黄芪与当归及其组方当归补血汤抗心肌缺血损伤及对血管内皮细胞的保护作用已有报道[3]。但黄芪与当归对血管新生及血管内皮细胞生长因子表达影响的研究目前尚无报道[4]。本研究以体外培养人脐静脉内皮细胞(HUVEC)为模型，研究黄芪与当归对HUVEC的生长周期和VEGF mRNA表达的影响。
1材料和方法
1.1主要仪器CO2培养箱(美国REVCO公司)，倒置相差显微镜及全自动照相系统(德国LEICA公司)，EPICS ELITE流式细胞仪(美国COULTER公司)，PTC200PCR仪(美国Watertown产品),SUNRISE酶标仪(奥地利TECAN公司)。
1.2细胞培养参考文献[5]的方法, 无菌收集新生儿脐带血，采用“酶灌注法”消化细胞，培养液为DMEM(加入10 %FBS、EGF 10 μg/L、青霉素 100 U/L、链霉素 100 mg/L)，于 37℃、5%CO2 培养箱中进行原代培养。待细胞长成单层后，用0.25%胰蛋白酶消化传代，培养条件同上。HUVEC经细胞形态学鉴定，免疫组化Ⅷ因子相关抗原检测证实为阳性，实验中取4代HUVEC进行实验。
1.3实验用中药的制备
1.3.1黄芪+当归复方水煎剂的制备称取蒙古黄芪80 g、当归40 g，置煎药锅内，加水浸泡2 h，文火煎煮1 h，滤出煎液，再加水文火煎煮，滤出煎液，合并煎液，浓缩至生药浓度为1 g/ml。用PBS稀释至40 mg/ml，经0.45 μm的微孔滤膜过滤除菌，分装封闭，置4℃保存。使用时用DMEM培养液稀释成终浓度分别为100、200、400 μg/ml，加入细胞培养瓶或培养板。
1.3.2黄芪和当归单味药水煎剂的制备分别称取黄芪、当归各80 g，同上操作，使用时用DMEM培养液稀释成终浓度分别为100、200、400 μg/ml，加入细胞培养瓶或培养板。
1.4MTT法检测黄芪与当归对细胞增殖的影响第4代HUVEC经消化、清洗，制成细胞悬液。经细胞记数为4×104/ml，将细胞悬液接种于96孔培养板内，每孔200 μl。常规培养3 d，显微镜下观察细胞呈鹅卵石样铺开排列，弃去培养液。实验分为黄芪组、当归组、黄芪+当归组及对照组。各组分别设100、200、400 μg/ml 3个剂量小组，按200 μl/孔加入含药培养液，每个剂量组设6个复孔，对照组只加正常培养液，继续常规培养24 h。弃去培养液，按MTT法测定各孔492 nm处的吸光度(OD值)。证实黄芪、当归及其组方各组从200 μg/ml浓度开始对HUVEC均有促增殖作用(P<0.01)，因此选用200 μg/ml为实验终浓度。
1.5黄芪与当归对HUVEC生长周期的影响[6] 将第4代HUVEC接种于50 ml的培养瓶，常规培养24 h。加无血清培养液继续培养24 h后，使细胞处于G0期。实验分组同上，各组药物浓度为200 μg/ml，每组5瓶细胞，吸去无血清培养液，加入含药全培养液，再培养24 h。常规消化，分别移入试管内，离心清洗细胞，经70%乙醇(4℃预冷)固定，加入0.5 ml RNAase工作液，37℃避光消化。加入50 μl 碘化丙啶(PI)工作液染色，上样，经流式细胞仪检测分析，每组5瓶细胞平行测定(n=5)。
1.6半定量RTPCR法检测HUVEC的VEGF mRNA水平表达[7,8]将第4代HUVEC接种于250 ml的培养瓶，待细胞融合生长后，实验分为黄芪组、当归组、黄芪+当归组及对照组，各组分别设200 μg/ml 和400 μg/ml两个剂量小组。各组分别加入含药培养液3 ml，对照组加入3 ml正常培养液，继续常规培养24 h。收集细胞，按照Trizol试剂说明的方法提取细胞总RNA。经反转录(2 μg RNA，4 μl反应体积)得到20 μl cDNA，直接PCR。VEGFPCR引物由上海博亚生物技术公司合成，内对照引物βactin(510 bp)：正义链：5′GAT TCC TAT GTG GGC GAC GAG 3′，反义链：5′CCA TCT CTT GCT CGA AGT CC 3′。VEGF引物：正义链：5′CCT GGT GGA CAT CTT CCA GGA GTA CC3′，反义链：5′GAA GCT CAT CTC TCC TAT GTG CTG GC3′经PAGE纯化。VEGF引物扩增产物为196 bp，该对引物跨越内含子，从而排除了基因组DNA的影响。经VEGFPCR(50 μl反应体系)，上样电泳，平行作一孔DNA Marker(3 μl)。紫外灯下观察DNA条带拍照片记录。电泳胶立即进行光密度扫描，以βactin扩增产物校正作相对量分析。
2结果
2.1Ⅷ因子相关抗原Ⅷ因子相关抗原是血管内皮细胞的特有抗原，用Ⅷ因子相关抗原的单克隆抗体SABC免疫组化染色法，检测培养的HUVEC Ⅷ因子相关抗原为阳性，在显微镜下可见HUVEC胞浆着色为棕黄色，细胞核不着色，细胞界限清楚，而背景无着色。证实原代和传代培养的细胞为血管内皮细胞。
2.2黄芪与当归对HUVEC生长周期的影响结果显示，正常培养的HUVEC周期中G0G1期、S期及G2M期细胞分布比例正常。黄芪组G0G1期细胞数明显减少(P<0.05)，S期细胞数明显增多(P<0.05)，提示黄芪(200 μg/ml)有促进内皮细胞DNA合成的作用。当归组G0G1期细胞数显著减少(P<0.01)，S期细胞数显著增多(P<0.01)，G2M期细胞数有增加趋势，但与对照组相比差异无统计学意义，提示当归(200 μg/ml)有明显促进内皮细胞DNA合成的作用。黄芪+当归组G0G1期细胞数明显减少(P<0.05)，S期和G2M期细胞数明显增多(P<0.05)，提示黄芪+当归可明显促进HUVEC的DNA合成及有丝分裂。说明黄芪与当归均可促进内皮细胞的增殖，见图1～4及表1。
表1黄芪与当归对HUVEC生长周期的影响[略]
图1-图4 略
2.3RTPCR结果分析PCR产物经2%琼脂糖凝胶电泳与DNA Marker比较，证实扩增的目的片段大小完全吻合。用图像采集分析系统进行灰度扫描，作扫描面积积分半定量分析，比较各组VEGF/βactin 灰度比值。结果显示，黄芪+当归(200 μg/ml)组是对照组的1.82倍,黄芪+当归(400 μg/ml)组是对照组的1.47倍,当归(200 μg/ml)组是对照组的1.88倍,当归(400 μg/ml)组是对照组的1.72倍,黄芪(200 μg/ml)组是对照组的1.51倍,黄芪(400 μg/ml)组是对照组的2.1倍。重复实验，结果反映一致(图5),说明黄芪与当归可促进体外培养HUVEC的VEGF mRNA表达。
图5VEGF 和βactin RTPCR产物电泳图 略
表 2黄芪与当归对HUVEC 的VEGF mRNA表达的影响[略]
3讨论
3.1血管内皮细胞目前已成为研究血管新生的理想细胞模型[9]。血管新生可利用的细胞类型主要有HUVEC、ECV304内皮细胞株、EA.hy926内皮细胞株及人微血管内皮细胞培养。人脐静脉内皮细胞培养具有来源充足、取材与操作方便及能获得较多细胞等优点。本实验分离的HUVEC经原代和传代培养后，细胞生长迅速，逐渐形成排列紧密、边界清楚、呈鹅卵石样铺开排列的单层细胞，传代后的HUVEC体积增大，胞浆丰富，可见双核及核分裂细胞，说明细胞生长旺盛。检测Ⅷ因子相关抗原为阳性，第3～5天是生长最旺盛时期，处于对数生长期。说明培养的HUVEC保持了良好的内皮细胞生物学状态。
3.2VEGF调控血管新生与药物干预促血管新生调节的关键是VEGF基因表达和蛋白合成释放的调节。通过药物的干预，促进血管内皮细胞VEGF的表达与释放，从而达到治疗性血管新生，这是血管新生研究的新趋势[10,11]。目前有通过基因转移技术使VEGF在治疗部位得以表达，促血管新生及其药物干预的研究，包括体外研究和体内研究两种途径，其中体外研究模型可分为内皮细胞培养和血管条培养，内皮细胞培养是研究VEGF及药物干预促血管新生的理想模型。本实验在细胞模型上使用黄芪与当归及其复方，终浓度在100~400 μg/ml范围内对体外培养的HUVEC有促生长作用,并使内皮细胞存活率保持在95%以上，促进VEGF的表达，说明黄芪与当归有利于血管新生内皮细胞的增殖及损伤后的修复生长。
3.3黄芪与当归对内皮细胞促增殖和细胞周期的作用黄芪和当归是临床常用的活血中药，两药配伍即可成为经典的当归补血汤中药，对黄芪与当归药的药理作用已有较多研究，朱瑾波等[12]研究证实黄芪具有促血管新生作用，这与黄芪在中医临床常用于治疗慢性皮肤溃疡和创口久不愈合有一定关系。本研究证实黄芪与当归有促血管内皮细胞增殖作用。目前，用血管内皮细胞培养模型研究黄芪与当归促血管新生的作用机制少见报道。本研究显示，黄芪和当归均促进内皮细胞DNA合成；黄芪+当归组G0G1期细胞数明显减少(P<0.05)，S期和G2M期细胞数明显增多(P<0.05)，说明黄芪与当归复方可明显促进体外培养HUVEC的DNA合成及有丝分裂。黄芪与当归复方促内皮细胞增殖作用可有利于血管新生过程、血管内皮的保护及损伤后的修复。
3.4黄芪与当归对内皮细胞VEGF表达的影响VEGF主要通过它的受体Flt1和Flk1/KDR调节血管新生。本实验通过RTPCR证实了黄芪与当归可促进体外培养HUVEC的VEGF mRNA表达，与黄芪和当归促内皮细胞增殖反应有一致性。由于中药具有多靶点作用的特点，本实验中黄芪与当归的促增殖作用与VEGF受体的变化及黄芪与当归促内皮细胞VEGF表达作用与HIF1的关系等作用机制需做进一步的研究探讨。
参考文献：
[1]陈冬梅，汪海. 血管内皮细胞功能与心血管疾病相关因子研究进展[J]. 中国药理学通报,2003, 19(4): 361365.
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[3]王国庆，易成，周宏远. 中药与血管生成的研究进展[J]. 微循环学杂志,2003, 13(1): 3335.
[4]吴岩，祝彼得. 当归补血汤对内皮细胞增殖和粘附分子表达的影响[J]. 华西医科大学学报,2001, 32(4)：593595.
[5]鄂征. 组织培养和分子细胞学技术[M]. 北京：科学出版社, 1995. 3476.
[6]章静波.细胞生物学实用方法与技术[J]. 北京：北京医科大学、中国协和医科大学联合出版社, 1995.15.
[7]Isner JM. Myocardial gene therapy[J]. Nature, 2002, 415(10): 234239.
[8]Kathry JB, Susan FM, Anna B, et al. A novel in vitro assay for human angiogenesis[J]. Lab Invest, 1996, 75(4): 539534.
[9]Gerber HP, condorelli F, Park J, et al. Differential transcription regulation of the two vascular endothelial growth factor receptor genes, Fit1, but not Fik1/KDR, is upregulation by hypoxia[J]. J Biol Chem, 1997, 272(38): 2365923667.
[10]Jaffe EA, Nochman RL, Becker CG, et al. Culture of human endothelial cells from umbilical veins : Identifecation by morphologic and immunologic criteria[J]. J Clin Invest,1973, 52(11): 27452756.
[11]Mombouli JV, Vanhoutte PM. Endothelial dysfunction: A novel therapeutic target: endothelial dysfunction from physiology to therapy[J]. J Mol Cell Cardiol, 1999，31(1): 6174.
[12]朱瑾波，李玉鼎，李玉书. 黄芪治疗慢性皮肤溃疡对血管生成过程的机制探讨[J]. 河北中医, 1996, 18(4)：2122.
1新疆医科大学病理生理学教研室，新疆乌鲁木齐830054; 2广州医学院内科学教研室，广东广州510182, 百拇医药(李悦山 张建龙 薛磊)
关键词： 内皮细胞; 内皮细胞生长因子; 细胞增殖; 黄芪; 当归
Culture of human umbilical vein endothelial cells in vitro and effects of astragalus
membranaceus and angelica sinensis on vascular endothelial growth factor
LI Yueshan, ZHANG Jianlong, XUE Lei
(Department of Pathophysiology, Xinjiang Medical University, Urumqi 830054, China)
Abstract Objective: To investigate the effects of astragalus membranaceus and angelica sinensis on the proliferation of endothelial cells, cell cycle and the expression of vascular endothelial growth factor(VEGF) mRNA in human umbilical vein endothelial cells (HUVEC ). Methods: To culture human umbilical vein endothelial cells as target cells in vitro. Factor Ⅷrelated antigen determined was masculine in the cultures, with monoclonal antibody and SABC immunohistochemistry kit. The proliferation of HUVEC in different concentrations of astragalus membranaceus, angelica sinensis, that include 100, 200, 400 μg/ml，were observed with MTT method. The changes of cell cycle of the cultures after administration of astragalus membranaceus, angelica sinensis in 200 μg/ml were observed using flow cytometer. The decoction of them on VEGF mRNA expression of HUVEC were observed by using RTPCR method. Results: The contribution of astragalus membranaceus in 200 μg/ml concentration and the decoction in 200, 400 μg/ml concentration was most evident. The decoction of astragalus membranaceus and angelica sinensis enhanced the synthesis of DNA and mitosis in cultured endothelial cells. The cultures treated with astragalus membranaceus, angelica sinensis, and the decoction in 200 μg/ml showed increased VEGF gene expression respectively as compared with negative control. Conclution: Astragalus membranaceus, angelica sinensis, and the decoction of them promoted proliferation of cultured HUVEC in vitro, increased the mRNA and expression of VEGF in the cultured HUVEC.
Key words: vascular endothelial growth factor; astragalus memb ranaceus; angelica sinensis; endothelial cells; proliferation
血管内皮细胞(EC)在血管新生中发挥重要作用[1]，将血管内皮细胞培养在适当的细胞外基质中，在各种促血管新生因子的作用下可以形成毛细血管样的网络结构和血管样结构[2]，而加入抑制血管新生的药物可以引起网络样结构或血管样结构的破坏。因此血管内皮细胞的培养已成为研究血管新生的发生、发展、影响因素及其调控机制等方面的细胞模型。
血管内皮细胞生长因子(VEGF)特异性作用于血管内皮细胞，可促血管新生。中医药关于活血化瘀、益气补血等药物的研究为中药促血管新生的研究提供了重要线索。其中黄芪与当归及其组方当归补血汤抗心肌缺血损伤及对血管内皮细胞的保护作用已有报道[3]。但黄芪与当归对血管新生及血管内皮细胞生长因子表达影响的研究目前尚无报道[4]。本研究以体外培养人脐静脉内皮细胞(HUVEC)为模型，研究黄芪与当归对HUVEC的生长周期和VEGF mRNA表达的影响。
1材料和方法
1.1主要仪器CO2培养箱(美国REVCO公司)，倒置相差显微镜及全自动照相系统(德国LEICA公司)，EPICS ELITE流式细胞仪(美国COULTER公司)，PTC200PCR仪(美国Watertown产品),SUNRISE酶标仪(奥地利TECAN公司)。
1.2细胞培养参考文献[5]的方法, 无菌收集新生儿脐带血，采用“酶灌注法”消化细胞，培养液为DMEM(加入10 %FBS、EGF 10 μg/L、青霉素 100 U/L、链霉素 100 mg/L)，于 37℃、5%CO2 培养箱中进行原代培养。待细胞长成单层后，用0.25%胰蛋白酶消化传代，培养条件同上。HUVEC经细胞形态学鉴定，免疫组化Ⅷ因子相关抗原检测证实为阳性，实验中取4代HUVEC进行实验。
1.3实验用中药的制备
1.3.1黄芪+当归复方水煎剂的制备称取蒙古黄芪80 g、当归40 g，置煎药锅内，加水浸泡2 h，文火煎煮1 h，滤出煎液，再加水文火煎煮，滤出煎液，合并煎液，浓缩至生药浓度为1 g/ml。用PBS稀释至40 mg/ml，经0.45 μm的微孔滤膜过滤除菌，分装封闭，置4℃保存。使用时用DMEM培养液稀释成终浓度分别为100、200、400 μg/ml，加入细胞培养瓶或培养板。
1.3.2黄芪和当归单味药水煎剂的制备分别称取黄芪、当归各80 g，同上操作，使用时用DMEM培养液稀释成终浓度分别为100、200、400 μg/ml，加入细胞培养瓶或培养板。
1.4MTT法检测黄芪与当归对细胞增殖的影响第4代HUVEC经消化、清洗，制成细胞悬液。经细胞记数为4×104/ml，将细胞悬液接种于96孔培养板内，每孔200 μl。常规培养3 d，显微镜下观察细胞呈鹅卵石样铺开排列，弃去培养液。实验分为黄芪组、当归组、黄芪+当归组及对照组。各组分别设100、200、400 μg/ml 3个剂量小组，按200 μl/孔加入含药培养液，每个剂量组设6个复孔，对照组只加正常培养液，继续常规培养24 h。弃去培养液，按MTT法测定各孔492 nm处的吸光度(OD值)。证实黄芪、当归及其组方各组从200 μg/ml浓度开始对HUVEC均有促增殖作用(P<0.01)，因此选用200 μg/ml为实验终浓度。
1.5黄芪与当归对HUVEC生长周期的影响[6] 将第4代HUVEC接种于50 ml的培养瓶，常规培养24 h。加无血清培养液继续培养24 h后，使细胞处于G0期。实验分组同上，各组药物浓度为200 μg/ml，每组5瓶细胞，吸去无血清培养液，加入含药全培养液，再培养24 h。常规消化，分别移入试管内，离心清洗细胞，经70%乙醇(4℃预冷)固定，加入0.5 ml RNAase工作液，37℃避光消化。加入50 μl 碘化丙啶(PI)工作液染色，上样，经流式细胞仪检测分析，每组5瓶细胞平行测定(n=5)。
1.6半定量RTPCR法检测HUVEC的VEGF mRNA水平表达[7,8]将第4代HUVEC接种于250 ml的培养瓶，待细胞融合生长后，实验分为黄芪组、当归组、黄芪+当归组及对照组，各组分别设200 μg/ml 和400 μg/ml两个剂量小组。各组分别加入含药培养液3 ml，对照组加入3 ml正常培养液，继续常规培养24 h。收集细胞，按照Trizol试剂说明的方法提取细胞总RNA。经反转录(2 μg RNA，4 μl反应体积)得到20 μl cDNA，直接PCR。VEGFPCR引物由上海博亚生物技术公司合成，内对照引物βactin(510 bp)：正义链：5′GAT TCC TAT GTG GGC GAC GAG 3′，反义链：5′CCA TCT CTT GCT CGA AGT CC 3′。VEGF引物：正义链：5′CCT GGT GGA CAT CTT CCA GGA GTA CC3′，反义链：5′GAA GCT CAT CTC TCC TAT GTG CTG GC3′经PAGE纯化。VEGF引物扩增产物为196 bp，该对引物跨越内含子，从而排除了基因组DNA的影响。经VEGFPCR(50 μl反应体系)，上样电泳，平行作一孔DNA Marker(3 μl)。紫外灯下观察DNA条带拍照片记录。电泳胶立即进行光密度扫描，以βactin扩增产物校正作相对量分析。
2结果
2.1Ⅷ因子相关抗原Ⅷ因子相关抗原是血管内皮细胞的特有抗原，用Ⅷ因子相关抗原的单克隆抗体SABC免疫组化染色法，检测培养的HUVEC Ⅷ因子相关抗原为阳性，在显微镜下可见HUVEC胞浆着色为棕黄色，细胞核不着色，细胞界限清楚，而背景无着色。证实原代和传代培养的细胞为血管内皮细胞。
2.2黄芪与当归对HUVEC生长周期的影响结果显示，正常培养的HUVEC周期中G0G1期、S期及G2M期细胞分布比例正常。黄芪组G0G1期细胞数明显减少(P<0.05)，S期细胞数明显增多(P<0.05)，提示黄芪(200 μg/ml)有促进内皮细胞DNA合成的作用。当归组G0G1期细胞数显著减少(P<0.01)，S期细胞数显著增多(P<0.01)，G2M期细胞数有增加趋势，但与对照组相比差异无统计学意义，提示当归(200 μg/ml)有明显促进内皮细胞DNA合成的作用。黄芪+当归组G0G1期细胞数明显减少(P<0.05)，S期和G2M期细胞数明显增多(P<0.05)，提示黄芪+当归可明显促进HUVEC的DNA合成及有丝分裂。说明黄芪与当归均可促进内皮细胞的增殖，见图1～4及表1。
表1黄芪与当归对HUVEC生长周期的影响[略]
图1-图4 略
2.3RTPCR结果分析PCR产物经2%琼脂糖凝胶电泳与DNA Marker比较，证实扩增的目的片段大小完全吻合。用图像采集分析系统进行灰度扫描，作扫描面积积分半定量分析，比较各组VEGF/βactin 灰度比值。结果显示，黄芪+当归(200 μg/ml)组是对照组的1.82倍,黄芪+当归(400 μg/ml)组是对照组的1.47倍,当归(200 μg/ml)组是对照组的1.88倍,当归(400 μg/ml)组是对照组的1.72倍,黄芪(200 μg/ml)组是对照组的1.51倍,黄芪(400 μg/ml)组是对照组的2.1倍。重复实验，结果反映一致(图5),说明黄芪与当归可促进体外培养HUVEC的VEGF mRNA表达。
图5VEGF 和βactin RTPCR产物电泳图 略
表 2黄芪与当归对HUVEC 的VEGF mRNA表达的影响[略]
3讨论
3.1血管内皮细胞目前已成为研究血管新生的理想细胞模型[9]。血管新生可利用的细胞类型主要有HUVEC、ECV304内皮细胞株、EA.hy926内皮细胞株及人微血管内皮细胞培养。人脐静脉内皮细胞培养具有来源充足、取材与操作方便及能获得较多细胞等优点。本实验分离的HUVEC经原代和传代培养后，细胞生长迅速，逐渐形成排列紧密、边界清楚、呈鹅卵石样铺开排列的单层细胞，传代后的HUVEC体积增大，胞浆丰富，可见双核及核分裂细胞，说明细胞生长旺盛。检测Ⅷ因子相关抗原为阳性，第3～5天是生长最旺盛时期，处于对数生长期。说明培养的HUVEC保持了良好的内皮细胞生物学状态。
3.2VEGF调控血管新生与药物干预促血管新生调节的关键是VEGF基因表达和蛋白合成释放的调节。通过药物的干预，促进血管内皮细胞VEGF的表达与释放，从而达到治疗性血管新生，这是血管新生研究的新趋势[10,11]。目前有通过基因转移技术使VEGF在治疗部位得以表达，促血管新生及其药物干预的研究，包括体外研究和体内研究两种途径，其中体外研究模型可分为内皮细胞培养和血管条培养，内皮细胞培养是研究VEGF及药物干预促血管新生的理想模型。本实验在细胞模型上使用黄芪与当归及其复方，终浓度在100~400 μg/ml范围内对体外培养的HUVEC有促生长作用,并使内皮细胞存活率保持在95%以上，促进VEGF的表达，说明黄芪与当归有利于血管新生内皮细胞的增殖及损伤后的修复生长。
3.3黄芪与当归对内皮细胞促增殖和细胞周期的作用黄芪和当归是临床常用的活血中药，两药配伍即可成为经典的当归补血汤中药，对黄芪与当归药的药理作用已有较多研究，朱瑾波等[12]研究证实黄芪具有促血管新生作用，这与黄芪在中医临床常用于治疗慢性皮肤溃疡和创口久不愈合有一定关系。本研究证实黄芪与当归有促血管内皮细胞增殖作用。目前，用血管内皮细胞培养模型研究黄芪与当归促血管新生的作用机制少见报道。本研究显示，黄芪和当归均促进内皮细胞DNA合成；黄芪+当归组G0G1期细胞数明显减少(P<0.05)，S期和G2M期细胞数明显增多(P<0.05)，说明黄芪与当归复方可明显促进体外培养HUVEC的DNA合成及有丝分裂。黄芪与当归复方促内皮细胞增殖作用可有利于血管新生过程、血管内皮的保护及损伤后的修复。
3.4黄芪与当归对内皮细胞VEGF表达的影响VEGF主要通过它的受体Flt1和Flk1/KDR调节血管新生。本实验通过RTPCR证实了黄芪与当归可促进体外培养HUVEC的VEGF mRNA表达，与黄芪和当归促内皮细胞增殖反应有一致性。由于中药具有多靶点作用的特点，本实验中黄芪与当归的促增殖作用与VEGF受体的变化及黄芪与当归促内皮细胞VEGF表达作用与HIF1的关系等作用机制需做进一步的研究探讨。
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1新疆医科大学病理生理学教研室，新疆乌鲁木齐830054; 2广州医学院内科学教研室，广东广州510182, 百拇医药(李悦山 张建龙 薛磊)