糖肽大环抗生素作选择试剂的高效液相色谱和毛细管电泳的手性识别机理
第32 卷
2004 年7 月
分析化学(FENXI HUAXUE) 评述与进展
Chinese Journal of Analytical Chemistry
第7 期
964～968
评述与进展
糖肽大环抗生素作选择试剂的高效液相色谱和
毛细管电泳的手性识别机理
惠方民
(Laboratoire Environnement and Chimie Analytique , Ecole Supérieur de Physique et
de Chime Industrielles de la Ville de Paris , France)
陈永雷 陈兴国 胡之德3
(兰州大学化学化工学院,兰州730000)
摘 要 万古霉素(vancomycin) 、替考拉宁( teicoplanin) 和瑞斯西丁素A ( ristocetin A) 等大环抗生素是在
HPLC 和CE 中成功使用的新手性选择试剂。这3 种选择试剂的对映识别机理与其分子结构密切相关。本文
报道了替考拉宁中糖部分在氨基酸和非氨基酸分离中的作用,万古霉素和替考拉宁中糖苷配基上的最基本
结合位点的确定,以及pH 值、温度等实验条件和有机改性剂的性质等对保留值和识别机理的影响的研究成
果,综述了它们在对映体分离中的应用。
关键词 万古霉素, 替考拉宁, 瑞斯西丁素A , 氨基酸, 选择试剂结构改变,评述
2002212214 收稿;2003204202 接受
1 引 言
万古霉素、替考拉宁和瑞斯西丁素A 是近年来高效液相色谱(HPLC) 和毛细管电泳(CE) 中具有良
好应用前景的手性选择试剂1 。自1994 年Armst rong 等首次介绍了这些手性选择试剂以来,在CE 分
离对映体的研究中它们的应用比其它任何种类手性添加剂都广泛。目前已有约500 种外消旋体通过电
泳得到了分离,其中包括大多数N2键合的氨基酸、抗肿瘤物质、乳酸、除草剂、灭鼠剂及许多非类固醇抗
炎物质以及各种各样有重要药效的物质。据报道除草剂22(32氯苯氧基) 丙酸是用瑞斯西丁素A 作为手
性选择试剂通过CE 进行对映体分离效果最好的物质之一(Rs > 22) 2 ,3 。这些糖肽大环抗生素作为手
性选择试剂已被成功的用于HPLC 和CE 分离中,其原因是: (1) 这些物质具有多个能够形成氢键的基
团(如羟基和胺基) 立体中心、芳烃残基和一些疏水裂缝或腔,因而提供了手性识别所需要的相似作用类
型; (2) 在波长大于250 nm 区域背景吸收很低,可以直接使用紫外检测器进行检测; (3) 既具有疏水基
团,又具有亲水基团,易溶于缓冲溶液,微溶于有机溶剂。此外,它们不仅在装柱过程和CE 缓冲溶液中
具有足够的稳定性,而且几乎不特殊的HPLC 共价键合化学物质相互作用。
尽管这些大环抗生素已用于很多种物质的分离,但是它们的识别机理尚未被阐明。弄清楚这些选
择试剂的手性识别作用在什么位置发生及其作用程度,不仅可为正确预测色谱和电泳条件、可分离物质
的类型、对映体分离的数量级及洗脱顺序等提供有价值的信息,还可以为寻找或设计新的具有高分离能
力的手性选择试剂提供一定的理论指导。为此,本文综述了与此有关的主要研究工作。
2 糖肽大环抗生素的结构和物化性质
2. 1 糖肽大环抗生素的结构
糖肽大环抗生素万古霉素、替考拉宁和瑞斯西丁素A 都含有一个以缩氨酸为核心的复合氨基酸及相
连的石炭酸根,一个或多个中性糖残基和一个或多个氨基糖,在糖苷配基部分都有一个胺基,其他可离子
化部分都含有酚基,熔融大环的糖苷配基有一个半刚性的“篮子”结构。它们结构上的不同之处是万古霉
素有3 个大环、18 个立体选择中心,替考拉宁有4 个大环、23 个立体选择中心,瑞斯西丁素A 有4 个大环、38 个立体选择中心。万古霉素和替考拉宁中的糖苷配基包含2 个氯代芳香环,而瑞斯西丁素A 的相似部
分却没有被氯取代。万古霉素和瑞斯西丁素A 都包含一个氨基糖,但是替考拉宁有2 个氨基糖,而且它们
中的氮都是乙酰化的。此外,万古霉素和替考拉宁中的糖苷配基都含有1 个羧基,而瑞斯西丁素A 的相应
基团是酯化了的。这些结构上的不同为改变手性分离过程中的选择性提供了一种途径。
2. 2 糖肽大环抗生素的物化性质
这些物质在小于250 nm 的紫外区有很强的吸收,但在300 nm 以上其吸收明显降低。尽管如此,在以这些糖肽抗生素作为手性选择试剂的分离体系中,由于它们在缓冲溶液中的浓度通常很低(0. 5～5
mmol/ L) ,仍可用紫外检测器进行检测。大环糖肽抗生素可溶于水和酸性缓冲溶液,微溶于中性溶
液3 ,4 。在通常CE 分离条件下这些选择试剂都有随时间延长而分解的趋势。分解通常会导致迁移时
间增长、基线噪音增加和光学异构体分离效率降低。实验表明,万古霉素是最不稳定的,pH 5～7 溶液
中在4 ℃时6～7 天就会变质。室温下万古霉素、替考拉宁和瑞斯西丁素A 分别只能保存2～3 天、3～4
天和6～7 天。在相同的pH 范围替考拉宁溶液稍稳定些。瑞斯西丁素A 的水溶液是大环抗生素中稳
定性最好的,采取一定的措施至少可使用4 个星期4 。由此可见,随着结构中糖类残基数目的增多,其
稳定性增强。糖肽抗生素溶液通常在4 ℃冷藏保存。当温度大于35 ℃、pH 值小于4 或大于7 时,其稳
定性会急剧下降。然而,这些试剂与硅胶共价键合作为HPLC 的手性固定相(CSP) 使用时是很稳定的。
3 HPLC 中的分子相互作用和保留行为
3. 1 分子间的相互作用
对于HPLC 而言,这3 个大环抗生素都是多模式的手性固定相(CSPs) ,它们不仅可用于正相模式
和反相模式,还可以用于极性有机相(它可以是与乙腈相溶的有极性的弱氢键溶剂,还可能含有少量甲
醇、冰醋酸和三乙胺) 5 ～7 。反相模式中所有被溶解的物质对于这3 种大环抗生素来说是阴离子或者中
性的,所以Ekbord 等认为在反相模式中分子间发生的相互作用主要是带负电的分析物功能团与糖肽手
性固定相中自由胺基间的电荷或静电相互作用,以及分析物与固定相上疏水基团的配合作用(毫无疑问
包含氢键和空间效应) 。虽然π2π相互作用是可能的,但是在反相模式的极性溶液中并不明显,然而在
以非极性有机溶剂为主的正相模式中π2π相互作用和氢键作用却非常显著。相反,正相模式中并不存
在反相模式中十分重要的疏水作用。大多数在极性有机相模式中分离的物质都包含1 个或多个自由胺
或胺基、羟基、苯环或者萘环、苯(甲) 酰基、羧基或酯基等,所有这些基团使得分析物和手性固定相之间
有可能存在氢键作用或空间效应。因此极性有机相模式中的主要相互作用是氢键、π2π相互作用和空
间效应,在某种程度上静电相互作用也可能存在。实际上,在反相模式中可以溶解的很多物质在正相和
极性有机相中不能溶解,反之亦然。也就是说除了极少数物质之外在每种模式中可以溶解的物质是完
全不同的,这表明每种情形下的手性识别机理是不同的。
3. 2 有机改性剂性质的影响
Amst rong 等6 分别考察了在反相模式中以替考拉宁为柱分离52甲基252苯乙内酰脲,甲醇和乙腈
作为有机改性剂时其浓度对保留值和对映体选择性的影响。正如预期的那样,用100 %的缓冲洗脱时
保留值最大,保留值随有机改性剂浓度的增大而降低,但是等量的乙腈比甲醇使保留值的降低程度更
大。在较高有机改性剂浓度( > 80 %) 下,分析物的保留行为有明显的区别。对于乙腈,当浓度从80 %
增加到100 %时保留值也随之增加,但甲醇并不存在这种情况。高浓度乙腈存在时保留值的增加主要
是因为分析物与手性固定相之间的氢键作用增强。对于含有竞争性形成氢键基团的纯有机改性剂如甲
醇并不存在这种情况。这种现象已在以万古霉素和瑞斯西丁素A 为手性固定相的分离中得到证
实5 ～7 。
3. 3 pH值对替考拉宁柱的影响
Amst rong 等6 还考察了在反相模式中pH 值对6 种不同溶质在替考拉宁柱上的保留值、对映体选
5 6 9 第7 期惠方民等:糖肽大环抗生素作选择试剂的高效液相色谱和毛细管电泳的手性识别机理
择性和分离度的影响。结果表明,对于含有自由羧基如苦杏仁酸和N2甲酸基2苯基丙氨酸等物质,当流
动相的pH 值从7 降低到4. 1 时保留值明显增加,这是因为质子化的中性物质与固定相有更强的结合。
而52甲基252苯乙内酰脲等非离子分析物的保留时间随着pH 值降低的变化不明显5 ,这是由于替考拉
宁手性固定相有一个长的末端疏水基团,它与待分析物分子之间的相互作用主要是疏水配合作用。此
外值得注意的是,在该文作者所考察的各种条件下,pH 值在3. 6～4. 1 范围内k′、α和Rs 值不连续,这
可能是因为替考拉宁手性固定相被质子化。很有趣的是对映体选择性最好时的pH 值(pH = 7) 与分离
度最大时的pH 值(pH = 4. 1) 并不一致。这种表面矛盾现象的发生是因为pH 值也会影响分离效率。
3. 4 温度的影响
Amst rong 等5 进一步考察了在反相模式中用万古霉素手性固定相分离谷丙酰胺、52甲基25 苯乙内
酰脲和N2氨基甲酰2D , L2苯胺时温度对保留时间、选择性和分离度的影响。结果表明,它们的保留时
间、选择性和分离度均随温度的降低而增加。该现象说明,在低温下分析物与选择试剂之间的相互作用
增强了;由于温度降低所导致的选择性的提高不能完全抵消由物质转移减少引起的分离效率的损失。
4 用作HPLC 手性选择试剂时分离氨基酸的识别机理
在高效液相色谱和毛细管电泳中可以被这3 种糖肽抗生素分辨的大多数手性化合物都至少包含一
个酸性基团5 ～9 ,因此可以认为抗生素中糖苷配基上质子化的胺NH+
3 可能是一个最基本的相互作
用位置。但是对某些分析物如氨基酸而言,糖苷配基上的羧基COO 有可能是另一个相互作用位
置。在pH3. 5～7. 5 范围内,万古霉素、替考拉宁和大多数氨基酸以两性离子的形式存在,所以有可能
存在两种静电作用:抗生素的铵基与氨基酸的羧基作用,或氨基酸的铵基与抗生素中的羧基作用。因为
静电作用是溶液中存在的最强相互作用之一,所以这两种作用可以同时发生。为了估计键的可能连接
情况,人们设计了替考拉宁和苯胺的球状分子模型10 。由该模型可知,铵基和替考拉宁中糖苷配基上
的羧基之间距离远大于苯胺中两个相对应基团之间的距离, 对于一般的氨基酸来说同时发生两种静电
作用是不可能的。换句话说,只有替考拉宁糖苷配基上的一个带电基团是与分析物发生静电作用的位
置。由于羧基处于两个体积大的糖残基之间,毫无疑问这个位置应该是糖苷配基上铵基所处的位置,因
为这个位置比羧基更容易接近。该结论已经由大量非氨基酸如吲哚232乳酸(是色氨酸上NH2 被
OH 取代的产物) 和32(32吲哚) 酪酸(不含氨基) 11 的基线分离得到证实。另一种评价糖肽抗生素
中NH2 和COOH 的相互作用活性的方法是保留氨基酸分析物(如色氨酸) 中的NH2 ,使
COOH 酯化或消去,这会生成色氨酸甲酯和α2甲基2色胺。色氨酸可在以替考拉宁为柱、EtOH/ H2O
(50/ 50 , V / V ) 为流动相的体系中达到基线分离,而色氨酸甲酯和α2甲基2色胺却不能被分离11 。这个
结果再次说明糖肽抗生素中NH+
3 与分析物中COO 之间的静电作用是手性识别中最基本的
相互作用。值得注意的是在此球状模型中环都是扭曲的且彼此相关,形成了一个“C”形的糖苷配基。
5 替考拉宁中糖部分在高效液相色谱手性识别中的作用
研究发现,独立的糖单元具有抗生作用12 ,这可能因为与这3 种糖肽抗生素相连的糖单元本身就
是手性的。Berthod 等13 通过除去替考拉宁分子中3 个糖单元而形成糖苷配基的方法对替考拉宁分子
进行了修饰并被分离提纯。用相同的方法分别制备了具有完整的替考拉宁分子和仅有“篮子”的糖苷配
基的两种手性固定相,并用一系列具有各种功能的外消旋化合物对两种手性固定相的对映体识别能力
进行了评价。结果显示对一般的α2氨基酸如二羟苯丙氨酸(DOPA) 而言,糖苷配基手性固定相的对映
体选择系数α值比天然替考拉宁手性固定相高2～3 倍。这表明糖单元降低了手性固定相对氨基酸对
映体的识别能力。同时也说明,替考拉宁上的“篮子”糖苷配基只对氨基酸的识别起作用。相反,对非氨
基酸如42羟基苦杏仁酸而言,糖苷配基手性固定相的对映体选择系数α值比天然替考拉宁手性固定相
低2～3 倍。对某些化合物,如22氨基环己胺酸和氧化苯乙烯,只有替考拉宁手性固定相可提高对映体
分辨能力。换句话说,这些化合物需要糖部分才能进行对映体分辨。从上述实验结果可见,糖单元对非
氨基化合物的对映体分离过程是有益的。对手性分离,至少有以下3 种因素影响替考拉宁分子上糖单
6 6 9 分析化学第32 卷
元的手性识别能力: (1) 糖单元占据了“篮子”的内部空间,限制了其它分子的进入及键合; (2) 阻塞了糖
苷配基上可能的作用位点,在这里两个糖单元通过酚羟基相连,第3 个糖单元通过醇基相连; (3) 提供了
竞争的作用点,这3 个糖单元本身是手性的而且还有羟基、醚基和氨基。
6 万古霉素中第二个胺基在毛细管电泳手性识别中的作用
如上所述,分析物的羧基与抗生素中的糖苷配基上的铵基之间的静电结合是非常重要的。为了证
实这一手性识别机理,Nair 等14 对用铜2万古霉素晶体作为毛细管电泳中的手性选择试剂进行了评价
并利用X2射线对其晶体结构进行了分析。结果表明,Cu2 + 万古霉素中N2甲基亮氨酸上的第2 个胺相
配合。但是,分子中二糖一边的伯胺并未与Cu2 + 配合,从而可以自由地与手性分析物作用。因此这个
化合物是一个很理想的用于提供反应机理信息的模型,它可以确定万古霉素上哪一个氨基是最基本的
作用点。实验发现,在毛细管电泳中天然的万古霉素可以对一些化合物进行很好的分离,而这个配合选
择试剂在同一系列化合物手性分离中的选择性会明显的降低或者根本无法进行。所以毫无疑问万古霉
素中“篮子”糖苷配基上的仲胺是在对酸性或离子分析物的手性识别中最基本的作用点。相反糖苷配基
上的羧基在手性识别中所起的作用不很明显。在瑞斯西丁素A 中,由于相对应的羧基是酯化的,因此
它具有最宽的选择范围和最短的迁移时间。另外,值得注意的是最近有关替考拉宁在液相色谱手性分
离中的应用研究表明,羧基对一些氨基酸的分离没有影响或者有负面影响。
7 糖肽大环抗生素在手性拆分中的应用
除上述介绍外, 糖肽大环抗生素在手性拆分中有较广泛的应用。如万古霉素在毛细管电
泳2 , 4 , 8 , 15 ～19 、薄层色谱20 及超临界流体色谱21 的手性分离中均取得了良好的选择性。瑞斯西丁素
A 在毛细管电泳的手性分离中也得到了很好的应用2 ～4 , 15 , 19 ,有120 多种物质被分离,其中包括N2键
合氨基酸、抗炎药物、非甾体类化合物和大量的含羧酸的生物类物质3 。替考拉宁在高效液相色谱对
映体分离中也得到了较为广泛的应用,其中包括奥狄生对映异构体22 、D , L212二甲胺基萘252磺酸2氨
基酸23 、β2取代和α2取代氨基酸24 、尿中( R) 2和( S ) 胺酰心安25 、麦角碱对映体26 、环状和2甲基2苯
丙氨酸和苯丙氨酰胺27 、芳氧基苯氧丙酸28 、DL2多巴胺和DL2O2甲基多巴胺29 、二肽30 、N2t2氧羰
基氨基酸30 等。此外,替考拉宁也已用于毛细管电泳28 ,30 和超临界和亚临界流体色谱31 中的手性分
离。
8 结论和展望
为了进一步认识糖肽大环抗生素的用途和寻找更多、更好的手性选择试剂,必须深入研究手性识别机
理。除了X射线结构分析和光电子能谱方法外,核磁共振和红外等也是在分子水平上研究手性识别机理
的强有力工具32 。前者可以测定配位数、配合常数和配合物结构随配合诱导效应变化的平均时间,后者
用作手性识别过程中检测氢耦合情况。圆二色散可以用来测定由于选择性键合所导致的构象变化。分子
模型计算方法可对特定对映体的可分离性、洗脱顺序和相对选择性进行预测33 ,34 。除进一步推广这类试
剂在手性分离中的应用外,还应深入开展新糖肽大环抗生素的合成、性能评价和应用研究。
References
1 Vespalec R , Bocek P. Chem. Rev . , 2000 , 100 : 3715～3753
2 Armstrong D W , Nair U B. Elect rophoresis , 1997 , 18 : 2331～2342
3 Armstrong D W , Gasper M P , Rundlett K L. J . Chromatogr. A , 1995 , 689 : 285～304
4 Gasper M P , Berthod A , Nair U B , Armstrong D W. A nal . Chem. , 1996 , 68 : 2501～2514
5 Armstrong D W , Tang Y, Chen S , Zhou Y, Bagwill C , Chen J R. A nal . Chem. , 1994 , 66 : 1473～1484
6 Armstrong D W , Liu Y, Ekborg2Ott K H. Chi rality , 1995 , 7 : 474～497
7 Ekborg2Ott K H , Liu Y, Armstrong D W. Chi rality , 1998 , 10 : 434～483
8 Armstrong D W , Rundlett K L , Chen J R E. Chi rality , 1994 , 6 : 496～509
9 Rundlett K L , Gasper M P , Zhou E Y, Armstrong D W. Chi rality , 1996 , 8 : 88～107
10 Berthod A , Liu Y, Bagwill C. J . Chromatogr. A , 1996 , 731 : 123～137
11 Hui F , Ekborg2Ott K H , Armstrong D W. J . Chromatogr. A , 2001 , 906 : 91～103
7 6 9 第7 期惠方民等:糖肽大环抗生素作选择试剂的高效液相色谱和毛细管电泳的手性识别机理
12 Ge M , Zhong C , Onoshi H R , Kohler J , Silver L L , Kerns R. Sciences , 1999 , 284 : 507～511
13 Berthod A , Chen X , Kullman J P , Armstrong D W. A nal . Chem. , 2000 , 72 :1767～1780
14 Nair U B , Chang S S , Armstrong D W , Rawjee Y Y, Eggleston D S , Mcardle J V. Chi rality , 1996 , 8 : 590～595
15 Hui F , Cande M. A nalusis , 1999 , 2 : 27
16 Amstrong D W , Kinmber L R. J . L iq. Chromatogr. , 1995 , 18 : 3659～3674
17 Srensson L A , Karisson K2E , Jorger V. Chi rality , 1998 , 10 : 273～280
18 Vespale C R , Corstjen S H , Billiet H A H. A nal . Chem. , 1995 , 67 : 3223～3228
19 Sharp V S , Risley D S , Huff B E. J . L iq. Chromatogr. Rel . Technol . , 1997 , 20 : 887～898
20 Armstrong D W , Zhou Y W. J . L iq. Chromatogr. , 1994 , 17 (8) : 1695～1707
21 Alain B , Vsha N B , Armstrong D W. Talanta , 1996 , 43 : 1767～1782
22 Hrobonova K, lehotay J , Cizmarik J , Armstrong D W. J . Pharm. Biomed. A nalysis , 2002 , 30 : 875～880
23 Courderot C M , Perrin F X , Guillaume Y C , Truong T T , Millet J , Thomassin M , Chaumont J P , Nicod L. A nal .
Chim. Acta , 2002 , 457 :149～155
24 Schlauch M , Kos O , Frahm A W. J . Pharm. Biomed. A nalysis , 2002 , 27 : 409～419
25 Lamprecht G, Kraushofer T , Stoschitzky K, Lindner W. J . Chromatogr. B , 2000 , 740 : 219～226
26 Tesarova E , Zaruba K, Flieger M. J . Chromatogr. A , 1999 , 844 : 137～147
27 Peter A , Olajos E , Casimir R , Tourwe D , Broxterman Q B , Kaptein B , Armstrong D W. J . Chromatogr. A , 2000 ,871 : 105～113
28 He J , Cheung A P , Struble E , Wang E , Liu P. J . Pharm. Biomed. A nalysis , 2000 , 22 : 583～595
29 Wu G, Furlanut M , Il Farmaco ,1999 , 54 : 188～190
30 Tesarova E , Bosakova Z , Zuskova I. J . Chromatogr. A , 2000 , 879 :147～156
31 Liu Y, Berthod A , Mitchell C R , Xiao T L , Zhang B , Armstrong D W. J . Chromatogr. A , 2002 , 978 : 185～204
32 Maier N M , Franco P , Lindner W. J . Chromatogr. A , 2001 , 906 : 3～33
33 Lipkowitz K B. J . Chromatogr. A , 1994 , 666 : 493～503
34 Lipkowitz K B. J . Chromatogr. A , 1995 , 694 : 15～37
High Performance Liquid Chromatography and Capillary Electrophoresis
Chiral Recognition Mechanisms Using Glycopeptide
Macrocycl ic Antibiotics as Selectors
Hui Fangmin
( L aboratoi re Envi ronnement and Chimie A nalytique , Ecole S upérieur de Physique et
de Chime Indust rielles de la V ille de Paris , France)
Chen Yonglei , Chen Xingguo , Hu Zhide
3
( College of Chemist ry and Chemical Engineering , L anz hou University , L anz hou 730000)
Abstract Macrocyclic antibiotics such as vancomycin , teicoplanin and ristocetin A are the newest and suc2
cessful class of chiral selectors in high performance liquid chromatography and capillary elect rophoresis. The
enantiorecognition mechanisms of these selectors are closely related to their molecular st ructure. Thus , the
role of the carbohydrate moieties of teicoplanin is discussed in regarding to amino or non amino acids separa2
tion. A primary docking interaction site is clearly identified on the aglycon portion of vancomycin and te2
icoplanin. Some experimental parameters such as pH , temperature and the nature of organic modifiers
which affect retention and recognition mechanism are also considered. Their recent application in enan2
tioresolutions is reviewed.
Keywords Vancomycin , teicoplanin , ristocetin A , amino acids , selectors st ructure modification , review
(Received 14 December 2002 ; accepted 2 April 2003)
8 6 9 分析化学第32 卷, 百拇医药(惠方民 陈永雷 陈兴国 胡之德)
2004 年7 月
分析化学(FENXI HUAXUE) 评述与进展
Chinese Journal of Analytical Chemistry
第7 期
964～968
评述与进展
糖肽大环抗生素作选择试剂的高效液相色谱和
毛细管电泳的手性识别机理
惠方民
(Laboratoire Environnement and Chimie Analytique , Ecole Supérieur de Physique et
de Chime Industrielles de la Ville de Paris , France)
陈永雷 陈兴国 胡之德3
(兰州大学化学化工学院,兰州730000)
摘 要 万古霉素(vancomycin) 、替考拉宁( teicoplanin) 和瑞斯西丁素A ( ristocetin A) 等大环抗生素是在
HPLC 和CE 中成功使用的新手性选择试剂。这3 种选择试剂的对映识别机理与其分子结构密切相关。本文
报道了替考拉宁中糖部分在氨基酸和非氨基酸分离中的作用,万古霉素和替考拉宁中糖苷配基上的最基本
结合位点的确定,以及pH 值、温度等实验条件和有机改性剂的性质等对保留值和识别机理的影响的研究成
果,综述了它们在对映体分离中的应用。
关键词 万古霉素, 替考拉宁, 瑞斯西丁素A , 氨基酸, 选择试剂结构改变,评述
2002212214 收稿;2003204202 接受
1 引 言
万古霉素、替考拉宁和瑞斯西丁素A 是近年来高效液相色谱(HPLC) 和毛细管电泳(CE) 中具有良
好应用前景的手性选择试剂1 。自1994 年Armst rong 等首次介绍了这些手性选择试剂以来,在CE 分
离对映体的研究中它们的应用比其它任何种类手性添加剂都广泛。目前已有约500 种外消旋体通过电
泳得到了分离,其中包括大多数N2键合的氨基酸、抗肿瘤物质、乳酸、除草剂、灭鼠剂及许多非类固醇抗
炎物质以及各种各样有重要药效的物质。据报道除草剂22(32氯苯氧基) 丙酸是用瑞斯西丁素A 作为手
性选择试剂通过CE 进行对映体分离效果最好的物质之一(Rs > 22) 2 ,3 。这些糖肽大环抗生素作为手
性选择试剂已被成功的用于HPLC 和CE 分离中,其原因是: (1) 这些物质具有多个能够形成氢键的基
团(如羟基和胺基) 立体中心、芳烃残基和一些疏水裂缝或腔,因而提供了手性识别所需要的相似作用类
型; (2) 在波长大于250 nm 区域背景吸收很低,可以直接使用紫外检测器进行检测; (3) 既具有疏水基
团,又具有亲水基团,易溶于缓冲溶液,微溶于有机溶剂。此外,它们不仅在装柱过程和CE 缓冲溶液中
具有足够的稳定性,而且几乎不特殊的HPLC 共价键合化学物质相互作用。
尽管这些大环抗生素已用于很多种物质的分离,但是它们的识别机理尚未被阐明。弄清楚这些选
择试剂的手性识别作用在什么位置发生及其作用程度,不仅可为正确预测色谱和电泳条件、可分离物质
的类型、对映体分离的数量级及洗脱顺序等提供有价值的信息,还可以为寻找或设计新的具有高分离能
力的手性选择试剂提供一定的理论指导。为此,本文综述了与此有关的主要研究工作。
2 糖肽大环抗生素的结构和物化性质
2. 1 糖肽大环抗生素的结构
糖肽大环抗生素万古霉素、替考拉宁和瑞斯西丁素A 都含有一个以缩氨酸为核心的复合氨基酸及相
连的石炭酸根,一个或多个中性糖残基和一个或多个氨基糖,在糖苷配基部分都有一个胺基,其他可离子
化部分都含有酚基,熔融大环的糖苷配基有一个半刚性的“篮子”结构。它们结构上的不同之处是万古霉
素有3 个大环、18 个立体选择中心,替考拉宁有4 个大环、23 个立体选择中心,瑞斯西丁素A 有4 个大环、38 个立体选择中心。万古霉素和替考拉宁中的糖苷配基包含2 个氯代芳香环,而瑞斯西丁素A 的相似部
分却没有被氯取代。万古霉素和瑞斯西丁素A 都包含一个氨基糖,但是替考拉宁有2 个氨基糖,而且它们
中的氮都是乙酰化的。此外,万古霉素和替考拉宁中的糖苷配基都含有1 个羧基,而瑞斯西丁素A 的相应
基团是酯化了的。这些结构上的不同为改变手性分离过程中的选择性提供了一种途径。
2. 2 糖肽大环抗生素的物化性质
这些物质在小于250 nm 的紫外区有很强的吸收,但在300 nm 以上其吸收明显降低。尽管如此,在以这些糖肽抗生素作为手性选择试剂的分离体系中,由于它们在缓冲溶液中的浓度通常很低(0. 5～5
mmol/ L) ,仍可用紫外检测器进行检测。大环糖肽抗生素可溶于水和酸性缓冲溶液,微溶于中性溶
液3 ,4 。在通常CE 分离条件下这些选择试剂都有随时间延长而分解的趋势。分解通常会导致迁移时
间增长、基线噪音增加和光学异构体分离效率降低。实验表明,万古霉素是最不稳定的,pH 5～7 溶液
中在4 ℃时6～7 天就会变质。室温下万古霉素、替考拉宁和瑞斯西丁素A 分别只能保存2～3 天、3～4
天和6～7 天。在相同的pH 范围替考拉宁溶液稍稳定些。瑞斯西丁素A 的水溶液是大环抗生素中稳
定性最好的,采取一定的措施至少可使用4 个星期4 。由此可见,随着结构中糖类残基数目的增多,其
稳定性增强。糖肽抗生素溶液通常在4 ℃冷藏保存。当温度大于35 ℃、pH 值小于4 或大于7 时,其稳
定性会急剧下降。然而,这些试剂与硅胶共价键合作为HPLC 的手性固定相(CSP) 使用时是很稳定的。
3 HPLC 中的分子相互作用和保留行为
3. 1 分子间的相互作用
对于HPLC 而言,这3 个大环抗生素都是多模式的手性固定相(CSPs) ,它们不仅可用于正相模式
和反相模式,还可以用于极性有机相(它可以是与乙腈相溶的有极性的弱氢键溶剂,还可能含有少量甲
醇、冰醋酸和三乙胺) 5 ～7 。反相模式中所有被溶解的物质对于这3 种大环抗生素来说是阴离子或者中
性的,所以Ekbord 等认为在反相模式中分子间发生的相互作用主要是带负电的分析物功能团与糖肽手
性固定相中自由胺基间的电荷或静电相互作用,以及分析物与固定相上疏水基团的配合作用(毫无疑问
包含氢键和空间效应) 。虽然π2π相互作用是可能的,但是在反相模式的极性溶液中并不明显,然而在
以非极性有机溶剂为主的正相模式中π2π相互作用和氢键作用却非常显著。相反,正相模式中并不存
在反相模式中十分重要的疏水作用。大多数在极性有机相模式中分离的物质都包含1 个或多个自由胺
或胺基、羟基、苯环或者萘环、苯(甲) 酰基、羧基或酯基等,所有这些基团使得分析物和手性固定相之间
有可能存在氢键作用或空间效应。因此极性有机相模式中的主要相互作用是氢键、π2π相互作用和空
间效应,在某种程度上静电相互作用也可能存在。实际上,在反相模式中可以溶解的很多物质在正相和
极性有机相中不能溶解,反之亦然。也就是说除了极少数物质之外在每种模式中可以溶解的物质是完
全不同的,这表明每种情形下的手性识别机理是不同的。
3. 2 有机改性剂性质的影响
Amst rong 等6 分别考察了在反相模式中以替考拉宁为柱分离52甲基252苯乙内酰脲,甲醇和乙腈
作为有机改性剂时其浓度对保留值和对映体选择性的影响。正如预期的那样,用100 %的缓冲洗脱时
保留值最大,保留值随有机改性剂浓度的增大而降低,但是等量的乙腈比甲醇使保留值的降低程度更
大。在较高有机改性剂浓度( > 80 %) 下,分析物的保留行为有明显的区别。对于乙腈,当浓度从80 %
增加到100 %时保留值也随之增加,但甲醇并不存在这种情况。高浓度乙腈存在时保留值的增加主要
是因为分析物与手性固定相之间的氢键作用增强。对于含有竞争性形成氢键基团的纯有机改性剂如甲
醇并不存在这种情况。这种现象已在以万古霉素和瑞斯西丁素A 为手性固定相的分离中得到证
实5 ～7 。
3. 3 pH值对替考拉宁柱的影响
Amst rong 等6 还考察了在反相模式中pH 值对6 种不同溶质在替考拉宁柱上的保留值、对映体选
5 6 9 第7 期惠方民等:糖肽大环抗生素作选择试剂的高效液相色谱和毛细管电泳的手性识别机理
择性和分离度的影响。结果表明,对于含有自由羧基如苦杏仁酸和N2甲酸基2苯基丙氨酸等物质,当流
动相的pH 值从7 降低到4. 1 时保留值明显增加,这是因为质子化的中性物质与固定相有更强的结合。
而52甲基252苯乙内酰脲等非离子分析物的保留时间随着pH 值降低的变化不明显5 ,这是由于替考拉
宁手性固定相有一个长的末端疏水基团,它与待分析物分子之间的相互作用主要是疏水配合作用。此
外值得注意的是,在该文作者所考察的各种条件下,pH 值在3. 6～4. 1 范围内k′、α和Rs 值不连续,这
可能是因为替考拉宁手性固定相被质子化。很有趣的是对映体选择性最好时的pH 值(pH = 7) 与分离
度最大时的pH 值(pH = 4. 1) 并不一致。这种表面矛盾现象的发生是因为pH 值也会影响分离效率。
3. 4 温度的影响
Amst rong 等5 进一步考察了在反相模式中用万古霉素手性固定相分离谷丙酰胺、52甲基25 苯乙内
酰脲和N2氨基甲酰2D , L2苯胺时温度对保留时间、选择性和分离度的影响。结果表明,它们的保留时
间、选择性和分离度均随温度的降低而增加。该现象说明,在低温下分析物与选择试剂之间的相互作用
增强了;由于温度降低所导致的选择性的提高不能完全抵消由物质转移减少引起的分离效率的损失。
4 用作HPLC 手性选择试剂时分离氨基酸的识别机理
在高效液相色谱和毛细管电泳中可以被这3 种糖肽抗生素分辨的大多数手性化合物都至少包含一
个酸性基团5 ～9 ,因此可以认为抗生素中糖苷配基上质子化的胺NH+
3 可能是一个最基本的相互作
用位置。但是对某些分析物如氨基酸而言,糖苷配基上的羧基COO 有可能是另一个相互作用位
置。在pH3. 5～7. 5 范围内,万古霉素、替考拉宁和大多数氨基酸以两性离子的形式存在,所以有可能
存在两种静电作用:抗生素的铵基与氨基酸的羧基作用,或氨基酸的铵基与抗生素中的羧基作用。因为
静电作用是溶液中存在的最强相互作用之一,所以这两种作用可以同时发生。为了估计键的可能连接
情况,人们设计了替考拉宁和苯胺的球状分子模型10 。由该模型可知,铵基和替考拉宁中糖苷配基上
的羧基之间距离远大于苯胺中两个相对应基团之间的距离, 对于一般的氨基酸来说同时发生两种静电
作用是不可能的。换句话说,只有替考拉宁糖苷配基上的一个带电基团是与分析物发生静电作用的位
置。由于羧基处于两个体积大的糖残基之间,毫无疑问这个位置应该是糖苷配基上铵基所处的位置,因
为这个位置比羧基更容易接近。该结论已经由大量非氨基酸如吲哚232乳酸(是色氨酸上NH2 被
OH 取代的产物) 和32(32吲哚) 酪酸(不含氨基) 11 的基线分离得到证实。另一种评价糖肽抗生素
中NH2 和COOH 的相互作用活性的方法是保留氨基酸分析物(如色氨酸) 中的NH2 ,使
COOH 酯化或消去,这会生成色氨酸甲酯和α2甲基2色胺。色氨酸可在以替考拉宁为柱、EtOH/ H2O
(50/ 50 , V / V ) 为流动相的体系中达到基线分离,而色氨酸甲酯和α2甲基2色胺却不能被分离11 。这个
结果再次说明糖肽抗生素中NH+
3 与分析物中COO 之间的静电作用是手性识别中最基本的
相互作用。值得注意的是在此球状模型中环都是扭曲的且彼此相关,形成了一个“C”形的糖苷配基。
5 替考拉宁中糖部分在高效液相色谱手性识别中的作用
研究发现,独立的糖单元具有抗生作用12 ,这可能因为与这3 种糖肽抗生素相连的糖单元本身就
是手性的。Berthod 等13 通过除去替考拉宁分子中3 个糖单元而形成糖苷配基的方法对替考拉宁分子
进行了修饰并被分离提纯。用相同的方法分别制备了具有完整的替考拉宁分子和仅有“篮子”的糖苷配
基的两种手性固定相,并用一系列具有各种功能的外消旋化合物对两种手性固定相的对映体识别能力
进行了评价。结果显示对一般的α2氨基酸如二羟苯丙氨酸(DOPA) 而言,糖苷配基手性固定相的对映
体选择系数α值比天然替考拉宁手性固定相高2～3 倍。这表明糖单元降低了手性固定相对氨基酸对
映体的识别能力。同时也说明,替考拉宁上的“篮子”糖苷配基只对氨基酸的识别起作用。相反,对非氨
基酸如42羟基苦杏仁酸而言,糖苷配基手性固定相的对映体选择系数α值比天然替考拉宁手性固定相
低2～3 倍。对某些化合物,如22氨基环己胺酸和氧化苯乙烯,只有替考拉宁手性固定相可提高对映体
分辨能力。换句话说,这些化合物需要糖部分才能进行对映体分辨。从上述实验结果可见,糖单元对非
氨基化合物的对映体分离过程是有益的。对手性分离,至少有以下3 种因素影响替考拉宁分子上糖单
6 6 9 分析化学第32 卷
元的手性识别能力: (1) 糖单元占据了“篮子”的内部空间,限制了其它分子的进入及键合; (2) 阻塞了糖
苷配基上可能的作用位点,在这里两个糖单元通过酚羟基相连,第3 个糖单元通过醇基相连; (3) 提供了
竞争的作用点,这3 个糖单元本身是手性的而且还有羟基、醚基和氨基。
6 万古霉素中第二个胺基在毛细管电泳手性识别中的作用
如上所述,分析物的羧基与抗生素中的糖苷配基上的铵基之间的静电结合是非常重要的。为了证
实这一手性识别机理,Nair 等14 对用铜2万古霉素晶体作为毛细管电泳中的手性选择试剂进行了评价
并利用X2射线对其晶体结构进行了分析。结果表明,Cu2 + 万古霉素中N2甲基亮氨酸上的第2 个胺相
配合。但是,分子中二糖一边的伯胺并未与Cu2 + 配合,从而可以自由地与手性分析物作用。因此这个
化合物是一个很理想的用于提供反应机理信息的模型,它可以确定万古霉素上哪一个氨基是最基本的
作用点。实验发现,在毛细管电泳中天然的万古霉素可以对一些化合物进行很好的分离,而这个配合选
择试剂在同一系列化合物手性分离中的选择性会明显的降低或者根本无法进行。所以毫无疑问万古霉
素中“篮子”糖苷配基上的仲胺是在对酸性或离子分析物的手性识别中最基本的作用点。相反糖苷配基
上的羧基在手性识别中所起的作用不很明显。在瑞斯西丁素A 中,由于相对应的羧基是酯化的,因此
它具有最宽的选择范围和最短的迁移时间。另外,值得注意的是最近有关替考拉宁在液相色谱手性分
离中的应用研究表明,羧基对一些氨基酸的分离没有影响或者有负面影响。
7 糖肽大环抗生素在手性拆分中的应用
除上述介绍外, 糖肽大环抗生素在手性拆分中有较广泛的应用。如万古霉素在毛细管电
泳2 , 4 , 8 , 15 ～19 、薄层色谱20 及超临界流体色谱21 的手性分离中均取得了良好的选择性。瑞斯西丁素
A 在毛细管电泳的手性分离中也得到了很好的应用2 ～4 , 15 , 19 ,有120 多种物质被分离,其中包括N2键
合氨基酸、抗炎药物、非甾体类化合物和大量的含羧酸的生物类物质3 。替考拉宁在高效液相色谱对
映体分离中也得到了较为广泛的应用,其中包括奥狄生对映异构体22 、D , L212二甲胺基萘252磺酸2氨
基酸23 、β2取代和α2取代氨基酸24 、尿中( R) 2和( S ) 胺酰心安25 、麦角碱对映体26 、环状和2甲基2苯
丙氨酸和苯丙氨酰胺27 、芳氧基苯氧丙酸28 、DL2多巴胺和DL2O2甲基多巴胺29 、二肽30 、N2t2氧羰
基氨基酸30 等。此外,替考拉宁也已用于毛细管电泳28 ,30 和超临界和亚临界流体色谱31 中的手性分
离。
8 结论和展望
为了进一步认识糖肽大环抗生素的用途和寻找更多、更好的手性选择试剂,必须深入研究手性识别机
理。除了X射线结构分析和光电子能谱方法外,核磁共振和红外等也是在分子水平上研究手性识别机理
的强有力工具32 。前者可以测定配位数、配合常数和配合物结构随配合诱导效应变化的平均时间,后者
用作手性识别过程中检测氢耦合情况。圆二色散可以用来测定由于选择性键合所导致的构象变化。分子
模型计算方法可对特定对映体的可分离性、洗脱顺序和相对选择性进行预测33 ,34 。除进一步推广这类试
剂在手性分离中的应用外,还应深入开展新糖肽大环抗生素的合成、性能评价和应用研究。
References
1 Vespalec R , Bocek P. Chem. Rev . , 2000 , 100 : 3715～3753
2 Armstrong D W , Nair U B. Elect rophoresis , 1997 , 18 : 2331～2342
3 Armstrong D W , Gasper M P , Rundlett K L. J . Chromatogr. A , 1995 , 689 : 285～304
4 Gasper M P , Berthod A , Nair U B , Armstrong D W. A nal . Chem. , 1996 , 68 : 2501～2514
5 Armstrong D W , Tang Y, Chen S , Zhou Y, Bagwill C , Chen J R. A nal . Chem. , 1994 , 66 : 1473～1484
6 Armstrong D W , Liu Y, Ekborg2Ott K H. Chi rality , 1995 , 7 : 474～497
7 Ekborg2Ott K H , Liu Y, Armstrong D W. Chi rality , 1998 , 10 : 434～483
8 Armstrong D W , Rundlett K L , Chen J R E. Chi rality , 1994 , 6 : 496～509
9 Rundlett K L , Gasper M P , Zhou E Y, Armstrong D W. Chi rality , 1996 , 8 : 88～107
10 Berthod A , Liu Y, Bagwill C. J . Chromatogr. A , 1996 , 731 : 123～137
11 Hui F , Ekborg2Ott K H , Armstrong D W. J . Chromatogr. A , 2001 , 906 : 91～103
7 6 9 第7 期惠方民等:糖肽大环抗生素作选择试剂的高效液相色谱和毛细管电泳的手性识别机理
12 Ge M , Zhong C , Onoshi H R , Kohler J , Silver L L , Kerns R. Sciences , 1999 , 284 : 507～511
13 Berthod A , Chen X , Kullman J P , Armstrong D W. A nal . Chem. , 2000 , 72 :1767～1780
14 Nair U B , Chang S S , Armstrong D W , Rawjee Y Y, Eggleston D S , Mcardle J V. Chi rality , 1996 , 8 : 590～595
15 Hui F , Cande M. A nalusis , 1999 , 2 : 27
16 Amstrong D W , Kinmber L R. J . L iq. Chromatogr. , 1995 , 18 : 3659～3674
17 Srensson L A , Karisson K2E , Jorger V. Chi rality , 1998 , 10 : 273～280
18 Vespale C R , Corstjen S H , Billiet H A H. A nal . Chem. , 1995 , 67 : 3223～3228
19 Sharp V S , Risley D S , Huff B E. J . L iq. Chromatogr. Rel . Technol . , 1997 , 20 : 887～898
20 Armstrong D W , Zhou Y W. J . L iq. Chromatogr. , 1994 , 17 (8) : 1695～1707
21 Alain B , Vsha N B , Armstrong D W. Talanta , 1996 , 43 : 1767～1782
22 Hrobonova K, lehotay J , Cizmarik J , Armstrong D W. J . Pharm. Biomed. A nalysis , 2002 , 30 : 875～880
23 Courderot C M , Perrin F X , Guillaume Y C , Truong T T , Millet J , Thomassin M , Chaumont J P , Nicod L. A nal .
Chim. Acta , 2002 , 457 :149～155
24 Schlauch M , Kos O , Frahm A W. J . Pharm. Biomed. A nalysis , 2002 , 27 : 409～419
25 Lamprecht G, Kraushofer T , Stoschitzky K, Lindner W. J . Chromatogr. B , 2000 , 740 : 219～226
26 Tesarova E , Zaruba K, Flieger M. J . Chromatogr. A , 1999 , 844 : 137～147
27 Peter A , Olajos E , Casimir R , Tourwe D , Broxterman Q B , Kaptein B , Armstrong D W. J . Chromatogr. A , 2000 ,871 : 105～113
28 He J , Cheung A P , Struble E , Wang E , Liu P. J . Pharm. Biomed. A nalysis , 2000 , 22 : 583～595
29 Wu G, Furlanut M , Il Farmaco ,1999 , 54 : 188～190
30 Tesarova E , Bosakova Z , Zuskova I. J . Chromatogr. A , 2000 , 879 :147～156
31 Liu Y, Berthod A , Mitchell C R , Xiao T L , Zhang B , Armstrong D W. J . Chromatogr. A , 2002 , 978 : 185～204
32 Maier N M , Franco P , Lindner W. J . Chromatogr. A , 2001 , 906 : 3～33
33 Lipkowitz K B. J . Chromatogr. A , 1994 , 666 : 493～503
34 Lipkowitz K B. J . Chromatogr. A , 1995 , 694 : 15～37
High Performance Liquid Chromatography and Capillary Electrophoresis
Chiral Recognition Mechanisms Using Glycopeptide
Macrocycl ic Antibiotics as Selectors
Hui Fangmin
( L aboratoi re Envi ronnement and Chimie A nalytique , Ecole S upérieur de Physique et
de Chime Indust rielles de la V ille de Paris , France)
Chen Yonglei , Chen Xingguo , Hu Zhide
3
( College of Chemist ry and Chemical Engineering , L anz hou University , L anz hou 730000)
Abstract Macrocyclic antibiotics such as vancomycin , teicoplanin and ristocetin A are the newest and suc2
cessful class of chiral selectors in high performance liquid chromatography and capillary elect rophoresis. The
enantiorecognition mechanisms of these selectors are closely related to their molecular st ructure. Thus , the
role of the carbohydrate moieties of teicoplanin is discussed in regarding to amino or non amino acids separa2
tion. A primary docking interaction site is clearly identified on the aglycon portion of vancomycin and te2
icoplanin. Some experimental parameters such as pH , temperature and the nature of organic modifiers
which affect retention and recognition mechanism are also considered. Their recent application in enan2
tioresolutions is reviewed.
Keywords Vancomycin , teicoplanin , ristocetin A , amino acids , selectors st ructure modification , review
(Received 14 December 2002 ; accepted 2 April 2003)
8 6 9 分析化学第32 卷, 百拇医药(惠方民 陈永雷 陈兴国 胡之德)