血清中胆汁酸的高效液相色谱荧光测定及质谱鉴定
血清中胆汁酸的高效液相色谱荧光测定及质谱鉴定
石运伟
3 3
赵先恩 陈向明 张海峰 白 敏 程 艳 尤进茂
3
(曲阜师范大学化学科学学院,曲阜273165)
摘 要 在Hypersil C18色谱柱上,利用新型荧光试剂1, 22苯并23, 42二氢咔唑292乙基对甲苯磺酸酯(BDETS)
作柱前衍生化试剂,采用梯度洗脱对10种胆汁酸(BAs)荧光衍生物进行了优化分离。95℃下在二甲基亚砜
溶剂中以柠檬酸钾作催化剂,衍生反应30 min后获得稳定的荧光产物,衍生反应完全。激发和发射波长分别
为λex = 333 nm,λem = 390 nm。采用大气压化学电离源(APCI)正离子模式,实现了血清中胆汁酸的定性和定
量测定。线性回归系数均在0. 9996以上,线性范围宽,检出限为12. 94～21. 94 fmol。
关键词 高效液相色谱2质谱,荧光检测,柱前衍生,血清,胆汁酸
2004207226收稿; 2005201224接受
本文系国家自然科学基金资助项目(No. 20075016)
3 3 现工作于山东鲁南制药有限公司
1 引 言
胆汁酸是动物体内重要的代谢调节物质,其分子具有良好的界面活性,能使疏水分子在水中乳化便
于消化吸收,而且能防止胆石的形成,肝病患者的血液中胆汁酸含量会明显增加[ 1 ] 。但这类化合物在
紫外2可见光区无吸收也无荧光,用折光示差检测[ 2 ]或远紫外波长检测[ 3 ]灵敏度不高。近年来,包括化
学衍生在内的气相色谱/质谱法(GC /MS) [ 4, 5 ]和HPLC2MS( 2MS) [ 6～8 ]检测都有报道,与传统的检测方法
相比HPLC荧光检测具有很高的灵敏度,所用衍生试剂主要有香豆素类和磺酸酯类化合物,但香豆素
类[ 9～11 ]化合物对潮气及水不稳定; NOEPES磺酸酯[ 12 ] 、NE2OTf[ 13 ]和AE2OTf[ 14 ]对羧酸的衍生化都需在
碱性催化剂和冠醚相转移试剂的存在下,于苯或甲苯溶剂中完成,分离需预处理,费时费力且毒性大。
本实验采用新型荧光试剂1, 22苯并23, 42二氢咔唑292乙基对甲苯磺酸酯,在柠檬酸钾催化剂的存在下,于二甲基亚砜(DMSO)溶液中实现了10种共轭和非共轭胆汁酸的快速衍生化。采用梯度洗脱实现了
10种胆汁酸衍生物的完全基线分离,并进行了柱后在线质谱定性。对正常人血清中胆汁酸进行了准确
的测定,方法操作简便,灵敏度高。
2 实验部分
2. 1 仪器与试剂
1100型高效液相色谱2质谱联用仪(Agilent公司) ,配备四元梯度泵, 100位自动进样器,荧光检测
器,在线真空脱气机,大气压化学电离源(APC I) ; Hypersil C18色谱柱(4. 6 mm ×200 mm, 5μm,中国科学
院大连化学物理研究所) 。1, 22苯并23, 42二氢咔唑292乙基对甲苯磺酸酯(自制) ; 胆汁酸标准样品
(Sigma公司) ;无水乙腈(禹城化学试剂厂) ,用P2O5 干燥后蒸馏处理,二甲基亚砜经减压蒸馏后备用;
柠檬酸钾、酒石酸钠等均为分析纯,实验用水由Milli2Q超纯水系统制备。
2. 2 标准溶液的配制
准确称取定量胆汁酸标准品,用乙腈配成1. 0 ×10- 3 mol/L 的溶液。称取208. 5 mg的1, 22苯并2
3, 42二氢咔唑292乙基对甲苯磺酸酯(BDETS)用二甲基亚砜定容至10mL,浓度为5. 0 ×10- 2 mol/L。相
应低浓度的衍生试剂(5. 0 ×10- 4 mol/L)标准溶液用二甲基亚砜稀释,低浓度胆汁酸(5. 0 ×10- 5mol/L)
标准溶液用无水乙腈稀释而成。
2. 3 标准品的衍生过程
盛有500 mg柠檬酸钾催化剂的安培瓶中依次加入100 mL DMSO, 50μL混合胆汁酸溶液, 150μL
衍生试剂溶液,封口后于95℃恒温水浴下振荡反应30 min。取出放冷后加入300μL乙腈混合均匀,取
第33卷
2005年8月
分析化学( FENXIHUAXUE) 研究报告
Chinese Journal of Analytical Chemistry
第8期
1100～1104
上层溶液用乙腈水溶液(CH3 CN /H2O, 1∶1,V /V )稀释5倍直接进样分析。衍生反应概况见图1,胆汁酸
分子结构见图2。
图1 1, 22苯并23, 42二氢咔唑292乙基对甲苯磺酸酯衍生胆汁酸反应概况
Fig. 1 Derivatization scheme of 1, 22benzo23, 42dihydrocarbazole292ethyl2p2toluenesulfonate with
bile acids
图2 胆汁酸分子结构式
Fig. 2 Structural formula of bile acids
游离胆汁酸Free bile acids R R1 R2 X
非共轭型胆汁酸Un2conjugation bile acids
胆酸Cholic acid (CA) OH OH OH
脱氧胆酸Deoxycholic acid (DCA ) H H OH OH
鹅脱氧胆酸Chenodeoxycholic acid (CDCA) OH H H OH
熊脱氧胆酸Ursodeoxycholic acid (UDCA) H OH H OH
石胆酸Lithocholic acid (LCA) H H H OH
与甘氨酸共轭型Conjugation with glycine
甘氨胆酸Glycocholic acid (GCA) OH H OH NHCH2CO2H
甘氨脱氧胆酸Glycodeoxycholic acid (GDCA) H H OH NHCH2CO2H
甘氨鹅脱氧胆酸Glycochenodeoxycholic acid (GCDCA) OH H H NHCH2CO2H
甘氨熊脱氧胆酸Glycoursodeoxycholic acid (GUDCA) H OH H NHCH2CO2H
甘氨石胆酸Glycolithocholic acid (GLCA) H H H NHCH2CO2H
2. 4 色谱条件
色谱柱: Hypersil C18色谱柱( 4. 6 mm ×200 mm, 5 μm ) 。流动相A: 50%乙腈水溶液(含有
40 mmol/L的HCOONH4 , pH = 3. 5) ; B: 100%的乙腈。梯度洗脱程序为0%B 35 min线性梯度到70%
B,到40 min线性梯度到100%B, 100%B再运行15 min。流速为1. 0 mL /min,柱温30℃。荧光激发和
发射波长分别为:λex = 333 nm,λem = 390 nm。
2. 5 质谱条件
1100型高效液相色谱2质谱联用仪;大气压化学电离源(APCI) ,正离子模式,喷雾压力0. 42 MPa;
干燥气流量为5 L /min,干燥气温度350℃,气化温度450℃; 毛细管电压3500 V,电晕电流4000nA
( Pos) [ 15, 16 ] 。
3 结果与讨论
3. 1 衍生条件的优化
1, 22苯并23, 42二氢咔唑292乙基对甲苯磺酸酯与胆汁酸的衍生化随溶剂、催化剂、衍生温度及衍生
试剂用量的不同产率有显著差异。实验中选用一系列弱碱性催化剂(K2CO3、NaH2 PO4、K2 C2O4、NaCN、乙酸钠、柠檬酸钾、酒石酸钠、硼砂等)对衍生化产率进行了考察,以GDCA、GUDCA共轭胆汁酸和UD2
CA、CDCA非共轭胆汁酸衍生物为例作图3。碱性稍强(K2 CO3、硼砂、NaCN、NaH2 PO4 )会引起5种共轭
型胆汁酸酰氨键的水解,造成此5种胆汁酸衍生物荧光信号大幅度降低而水解,产生的相应5种非共轭
型胆汁酸所形成的衍生物荧光信号大幅度增加;碱性稍弱(乙酸钠、酒石酸钠、K2 C2O4 )会使催化效率降
低,明显影响衍生产率。最终选择碱性适中的柠檬酸钾作为衍生反应的催化剂,并对其用量从50～600
mg进行了考察,结果表明:用量在500 mg产率最大。
选取二甲基亚砜(DMSO) 、N,N2二甲基甲酰胺(DMF) 、四氢呋喃( THF) 、1, 42二氧六环、吡啶、22甲
基吡啶、乙腈及丙酮等作为衍生化溶剂,对衍生产率进行了考察。结果表明,在其它衍生条件相同的情
况下,DMSO具有最大衍生化产率。衍生产率和速率随温度的升高而增加, 95℃衍生反应30 min后产物
1 0 1 1 第8期石运伟等:血清中胆汁酸的高效液相色谱荧光测定及质谱鉴定
图3 催化剂及柠檬酸钾用量对共轭型及非共轭型胆汁酸衍生产率的影响
Fig. 3 Influence of potassium citrate catalyst on derivatization yields of conjugated and un2conjuga2
ted bile acids
A: 1. K2CO3 ; 2. 硼砂( borax) ; 3. NaCN ; 4. NaH2 PO4 ; 5. 柠檬酸钾( potassium citrate) ; 6. 乙酸钠
(NaAc) ; 7. 酒石酸钠( sodium tartrate) ; 8. K2C2O4。
信号强度基本稳定,升高温度会引起衍生试剂轻度分解而影响衍生产率,而且选取95℃进行衍生具有
良好的衍生速率, 30 min反应近乎完全。衍生试剂过量10到15倍促使衍生反应完全,由于试剂自身的
荧光猝灭,过量衍生试剂不会干扰分离,本实验用15倍的衍生试剂提高衍生产率。
3. 2 色谱分离及质谱检测
按上述优化条件,对10种胆汁酸进行衍生后,采用梯度洗脱在55 min内实现了完全基线分离,结
果见图4。利用上述质谱条件进行柱后在线鉴定, 以胆酸(CA)为例的质谱见图5 (分别为一级和二级
质谱) ,各组分一级质谱数据见表1。
3. 3 线性回归方程、检出限和测量精密度
注射量在600 pmol～36. 6 fmol范围内,依据峰面积和实际进样量进行线性回归,所得回归方程、相
关系数和各胆汁酸检出限见表1。线性相关系数在0. 9996～0. 9999之间。各胆汁酸衍生物检出限(按
照信噪比为3来计算, S /N = 3∶1)在12. 94～21. 94 fmol之间。
在相同洗脱条件下,对100 pmol胆汁酸衍生物进行平行6次分析,保留时间和峰面积的测量精密
度很高,结果见表2。
2 0 1 1 分析化学第33卷
表1 胆汁酸衍生物的线性回归方程、相关系数、检测限和一级质谱数据
Table 1 L inear regression equations, correlation coefficients, detection limits and mass spectral data of bile acid derivatives
胆汁酸
Bile acids Y =A +BX 线性相关系数
r
检出限
Detection limits
( fmol)
一级质谱
First step MS
(M + 1) +
GCA Y = 85. 53 + 36. 74 X 0. 9997 12. 94 711. 5
GUDCA Y = 43. 58 + 24. 63 X 0. 9999 16. 37 695. 5
GCDCA Y = 76. 00 + 36. 29 X 0. 9998 15. 73 695. 5
GDCA Y = 78. 20 + 38. 28 X 0. 9998 14. 49 695. 4
CA Y = 42. 28 + 29. 60 X 0. 9999 21. 94 654. 4
UDCA Y = 46. 62 + 30. 05 X 0. 9999 19. 65 638. 4
GLCA Y = 93. 78 + 40. 75 X 0. 9997 14. 52 679. 5
CDCA Y = 80. 55 + 29. 11 X 0. 9996 13. 22 638. 4
DCA Y = 70. 34 + 26. 01 X 0. 9996 13. 84 638. 3
LCA Y = 52. 79 + 28. 73 X 0. 9998 16. 91 622. 5
X: 进样量( injected amount/pmol) ; Y:峰面积(peak area) ;MS:质谱(mass spectum)
3. 4 实际样品分析
3. 4. 1 血清中胆汁酸的提取 向盛有2 mL血清
样品的离心试管中加入3 mL甲醇并振荡摇匀,然
后加入0. 5 g硫酸铵固体超声振荡,离心后取出有
机相用氮气吹干,剩余物用300 mL DMSO溶解后
加入6. 7 mL水。然后用经过4mL 甲醇和5mL水
冲洗的C18 Sep2Pak萃取柱过滤,再用5 mL水冲洗
萃取柱,然后用5 mL乙腈将胆汁酸洗脱,将洗脱液
挥发至干用300 mL DMSO溶解冷藏备用。
3. 4. 2 血清样品中胆汁酸的测定 按照2. 4实验
条件,实际样品的色谱分离见图6;各胆汁酸的测
定结果见表3。实际血清样品中GCA、GUDCA、表2 保留时间和峰面积的测量精密度( n = 6)
Table 2 Precision of area and retention time ( n = 6)
胆汁酸
Bile acids
峰面积相对标准偏差
RSD of peak area
(% )
保留时间相对标准偏差
RSD retention time
(% )
GCA 0. 629 0. 062
GUDCA 0. 641 0. 063
GCDCA 1. 526 0. 060
GDCA 0. 621 0. 058
CA 0. 461 0. 055
UDCA 0. 980 0. 052
GLCA 0. 652 0. 050
CDCA 2. 197 0. 030
DCA 3. 076 0. 029
LCA 0. 473 0. 037
GCDCA、CA、CDCA、DCA、LCA除采用保留值定性外同时进行了质谱确定; GDCA、UDCA、GLCA由于含
图6 血清样品中胆汁酸色谱分离图
Fig. 6 Chromatogram of bile acids from extracted serum
色谱条件见实验部分( chromatographic conditions as described in ex2
perimental section) 。
量底于检出限度未能进行定量。
表3 血清样品中胆汁酸的测定结果
Table 3 Results of bile acids from extracted serum
胆汁酸
Bile acids
血清样品
Serum samp le
(μmol/L)
鉴定Identification
保留值
Retention time
质谱
(MS)
GCA 0. 0038 Yes
GUDCA 0. 0308 Yes Yes
GCDCA 0. 1848 Yes Yes
GDCA - Yes No
CA 0. 0536 Yes Yes
UDCA - Yes No
CA - Yes No
CDCA 0. 2457 Yes Yes
DCA 0. 0344 Yes Yes
LCA 0. 1862 Yes Yes
- :未检出( unidentified)
3. 5 结论
胆汁酸测定方法的建立对于临床及生命科学都有重要意义。实验利用1, 22苯并23, 42二氢咔唑292
乙基对甲苯磺酸酯作为柱前衍生化试剂,对衍生化条件和色谱分离条件进行了优化,并施以柱后在线质
谱鉴定,建立了灵敏、快速测定血清中胆汁酸的方法。衍生试剂稳定、灵敏,能快速方便的与胆汁酸进行
3 0 1 1 第8期石运伟等:血清中胆汁酸的高效液相色谱荧光测定及质谱鉴定
衍生反应且衍生产率高、衍生产物稳定。此方法能够准确定量且具有线性范围宽、重现性好等优点。对
血清样品的测定结果与众多文献基本相符。结果表明:此分析测定方法的可行性好,能够为临床及生命
科学的研究提供可靠的数据参考。
References
1 Yuan Yisheng(袁倚盛主编). Analysis of ClinicalM edicine by Chrom atography (临床医药色谱分析). Nanjing (南京) :
Nanjing University Press (南京大学出版社) , 1994
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16 Friso S, Choi SW, Dolnikowski G G, Selhub J. Anal. Chem. , 2002, 74: 4526～4531
Determ ina tion of Bile Ac ids from Extracted Serum by
High Performance L iqu id Chroma tography2Ma ss
Spectrometry with Fluorescence Detection
Shi Yunwei, Zhao Xian′en, Chen Xiangming, Zhang Haifeng, BaiMin, Cheng Yan, You J inmao
3
(College of Chem istry Science, Qufu N orm al University, Qufu 273165)
Abstract On a reversed2phased Hypersil C18 column , 10 bile acids derivatives were separated using 1, 22
benzo23, 42dihydrocarbazole292ethyl2p2toluenesulfonate (BDETS) as p re2column derivatization reagent by high2
performance liquid chromatographywith fluorescence detection and mass spectrum identification in conjunction
with a gradient elution. Op timum derivatization, giving the corresponding sensitively fluorescent derivatives,was obtained by the reacting of bile acidswith BDETS at 95℃ for 30 min in the p resence ofmild basic catalyst
potassium citrate in dimethyl sulfoxide solvent. The fluorescence excitation and emission wavelengthswere set
atλex 333 andλem 390 nm, respectively. The identification of bile acids derivativeswas obtained on the basis
of atmospheric2p ressure chemical ionization source at positive model detection. Correlation coefficients for the
peak areasand bile acid derivative concentrations are > 0. 9996, and detection limits at signal2to2noise of 3∶1
are 12. 94～21. 94 fmol for the labeled bile acids. The established method is sensitive and rep roducible for the
determination of bile acids from real samp leswith satisfactory results.
Keywords High performance liquid chromatography, fluorescence detection, p re2column derivatization,serum, bile acids
(Received 26 July 2004; accep ted 24 January 2005)
4 0 1 1 分析化学第33卷, http://www.100md.com(石运伟 赵先恩 陈向明 张海峰 白 敏 程 艳 尤进茂)
石运伟
3 3
赵先恩 陈向明 张海峰 白 敏 程 艳 尤进茂
3
(曲阜师范大学化学科学学院,曲阜273165)
摘 要 在Hypersil C18色谱柱上,利用新型荧光试剂1, 22苯并23, 42二氢咔唑292乙基对甲苯磺酸酯(BDETS)
作柱前衍生化试剂,采用梯度洗脱对10种胆汁酸(BAs)荧光衍生物进行了优化分离。95℃下在二甲基亚砜
溶剂中以柠檬酸钾作催化剂,衍生反应30 min后获得稳定的荧光产物,衍生反应完全。激发和发射波长分别
为λex = 333 nm,λem = 390 nm。采用大气压化学电离源(APCI)正离子模式,实现了血清中胆汁酸的定性和定
量测定。线性回归系数均在0. 9996以上,线性范围宽,检出限为12. 94～21. 94 fmol。
关键词 高效液相色谱2质谱,荧光检测,柱前衍生,血清,胆汁酸
2004207226收稿; 2005201224接受
本文系国家自然科学基金资助项目(No. 20075016)
3 3 现工作于山东鲁南制药有限公司
1 引 言
胆汁酸是动物体内重要的代谢调节物质,其分子具有良好的界面活性,能使疏水分子在水中乳化便
于消化吸收,而且能防止胆石的形成,肝病患者的血液中胆汁酸含量会明显增加[ 1 ] 。但这类化合物在
紫外2可见光区无吸收也无荧光,用折光示差检测[ 2 ]或远紫外波长检测[ 3 ]灵敏度不高。近年来,包括化
学衍生在内的气相色谱/质谱法(GC /MS) [ 4, 5 ]和HPLC2MS( 2MS) [ 6～8 ]检测都有报道,与传统的检测方法
相比HPLC荧光检测具有很高的灵敏度,所用衍生试剂主要有香豆素类和磺酸酯类化合物,但香豆素
类[ 9～11 ]化合物对潮气及水不稳定; NOEPES磺酸酯[ 12 ] 、NE2OTf[ 13 ]和AE2OTf[ 14 ]对羧酸的衍生化都需在
碱性催化剂和冠醚相转移试剂的存在下,于苯或甲苯溶剂中完成,分离需预处理,费时费力且毒性大。
本实验采用新型荧光试剂1, 22苯并23, 42二氢咔唑292乙基对甲苯磺酸酯,在柠檬酸钾催化剂的存在下,于二甲基亚砜(DMSO)溶液中实现了10种共轭和非共轭胆汁酸的快速衍生化。采用梯度洗脱实现了
10种胆汁酸衍生物的完全基线分离,并进行了柱后在线质谱定性。对正常人血清中胆汁酸进行了准确
的测定,方法操作简便,灵敏度高。
2 实验部分
2. 1 仪器与试剂
1100型高效液相色谱2质谱联用仪(Agilent公司) ,配备四元梯度泵, 100位自动进样器,荧光检测
器,在线真空脱气机,大气压化学电离源(APC I) ; Hypersil C18色谱柱(4. 6 mm ×200 mm, 5μm,中国科学
院大连化学物理研究所) 。1, 22苯并23, 42二氢咔唑292乙基对甲苯磺酸酯(自制) ; 胆汁酸标准样品
(Sigma公司) ;无水乙腈(禹城化学试剂厂) ,用P2O5 干燥后蒸馏处理,二甲基亚砜经减压蒸馏后备用;
柠檬酸钾、酒石酸钠等均为分析纯,实验用水由Milli2Q超纯水系统制备。
2. 2 标准溶液的配制
准确称取定量胆汁酸标准品,用乙腈配成1. 0 ×10- 3 mol/L 的溶液。称取208. 5 mg的1, 22苯并2
3, 42二氢咔唑292乙基对甲苯磺酸酯(BDETS)用二甲基亚砜定容至10mL,浓度为5. 0 ×10- 2 mol/L。相
应低浓度的衍生试剂(5. 0 ×10- 4 mol/L)标准溶液用二甲基亚砜稀释,低浓度胆汁酸(5. 0 ×10- 5mol/L)
标准溶液用无水乙腈稀释而成。
2. 3 标准品的衍生过程
盛有500 mg柠檬酸钾催化剂的安培瓶中依次加入100 mL DMSO, 50μL混合胆汁酸溶液, 150μL
衍生试剂溶液,封口后于95℃恒温水浴下振荡反应30 min。取出放冷后加入300μL乙腈混合均匀,取
第33卷
2005年8月
分析化学( FENXIHUAXUE) 研究报告
Chinese Journal of Analytical Chemistry
第8期
1100～1104
上层溶液用乙腈水溶液(CH3 CN /H2O, 1∶1,V /V )稀释5倍直接进样分析。衍生反应概况见图1,胆汁酸
分子结构见图2。
图1 1, 22苯并23, 42二氢咔唑292乙基对甲苯磺酸酯衍生胆汁酸反应概况
Fig. 1 Derivatization scheme of 1, 22benzo23, 42dihydrocarbazole292ethyl2p2toluenesulfonate with
bile acids
图2 胆汁酸分子结构式
Fig. 2 Structural formula of bile acids
游离胆汁酸Free bile acids R R1 R2 X
非共轭型胆汁酸Un2conjugation bile acids
胆酸Cholic acid (CA) OH OH OH
脱氧胆酸Deoxycholic acid (DCA ) H H OH OH
鹅脱氧胆酸Chenodeoxycholic acid (CDCA) OH H H OH
熊脱氧胆酸Ursodeoxycholic acid (UDCA) H OH H OH
石胆酸Lithocholic acid (LCA) H H H OH
与甘氨酸共轭型Conjugation with glycine
甘氨胆酸Glycocholic acid (GCA) OH H OH NHCH2CO2H
甘氨脱氧胆酸Glycodeoxycholic acid (GDCA) H H OH NHCH2CO2H
甘氨鹅脱氧胆酸Glycochenodeoxycholic acid (GCDCA) OH H H NHCH2CO2H
甘氨熊脱氧胆酸Glycoursodeoxycholic acid (GUDCA) H OH H NHCH2CO2H
甘氨石胆酸Glycolithocholic acid (GLCA) H H H NHCH2CO2H
2. 4 色谱条件
色谱柱: Hypersil C18色谱柱( 4. 6 mm ×200 mm, 5 μm ) 。流动相A: 50%乙腈水溶液(含有
40 mmol/L的HCOONH4 , pH = 3. 5) ; B: 100%的乙腈。梯度洗脱程序为0%B 35 min线性梯度到70%
B,到40 min线性梯度到100%B, 100%B再运行15 min。流速为1. 0 mL /min,柱温30℃。荧光激发和
发射波长分别为:λex = 333 nm,λem = 390 nm。
2. 5 质谱条件
1100型高效液相色谱2质谱联用仪;大气压化学电离源(APCI) ,正离子模式,喷雾压力0. 42 MPa;
干燥气流量为5 L /min,干燥气温度350℃,气化温度450℃; 毛细管电压3500 V,电晕电流4000nA
( Pos) [ 15, 16 ] 。
3 结果与讨论
3. 1 衍生条件的优化
1, 22苯并23, 42二氢咔唑292乙基对甲苯磺酸酯与胆汁酸的衍生化随溶剂、催化剂、衍生温度及衍生
试剂用量的不同产率有显著差异。实验中选用一系列弱碱性催化剂(K2CO3、NaH2 PO4、K2 C2O4、NaCN、乙酸钠、柠檬酸钾、酒石酸钠、硼砂等)对衍生化产率进行了考察,以GDCA、GUDCA共轭胆汁酸和UD2
CA、CDCA非共轭胆汁酸衍生物为例作图3。碱性稍强(K2 CO3、硼砂、NaCN、NaH2 PO4 )会引起5种共轭
型胆汁酸酰氨键的水解,造成此5种胆汁酸衍生物荧光信号大幅度降低而水解,产生的相应5种非共轭
型胆汁酸所形成的衍生物荧光信号大幅度增加;碱性稍弱(乙酸钠、酒石酸钠、K2 C2O4 )会使催化效率降
低,明显影响衍生产率。最终选择碱性适中的柠檬酸钾作为衍生反应的催化剂,并对其用量从50～600
mg进行了考察,结果表明:用量在500 mg产率最大。
选取二甲基亚砜(DMSO) 、N,N2二甲基甲酰胺(DMF) 、四氢呋喃( THF) 、1, 42二氧六环、吡啶、22甲
基吡啶、乙腈及丙酮等作为衍生化溶剂,对衍生产率进行了考察。结果表明,在其它衍生条件相同的情
况下,DMSO具有最大衍生化产率。衍生产率和速率随温度的升高而增加, 95℃衍生反应30 min后产物
1 0 1 1 第8期石运伟等:血清中胆汁酸的高效液相色谱荧光测定及质谱鉴定
图3 催化剂及柠檬酸钾用量对共轭型及非共轭型胆汁酸衍生产率的影响
Fig. 3 Influence of potassium citrate catalyst on derivatization yields of conjugated and un2conjuga2
ted bile acids
A: 1. K2CO3 ; 2. 硼砂( borax) ; 3. NaCN ; 4. NaH2 PO4 ; 5. 柠檬酸钾( potassium citrate) ; 6. 乙酸钠
(NaAc) ; 7. 酒石酸钠( sodium tartrate) ; 8. K2C2O4。
信号强度基本稳定,升高温度会引起衍生试剂轻度分解而影响衍生产率,而且选取95℃进行衍生具有
良好的衍生速率, 30 min反应近乎完全。衍生试剂过量10到15倍促使衍生反应完全,由于试剂自身的
荧光猝灭,过量衍生试剂不会干扰分离,本实验用15倍的衍生试剂提高衍生产率。
3. 2 色谱分离及质谱检测
按上述优化条件,对10种胆汁酸进行衍生后,采用梯度洗脱在55 min内实现了完全基线分离,结
果见图4。利用上述质谱条件进行柱后在线鉴定, 以胆酸(CA)为例的质谱见图5 (分别为一级和二级
质谱) ,各组分一级质谱数据见表1。
3. 3 线性回归方程、检出限和测量精密度
注射量在600 pmol～36. 6 fmol范围内,依据峰面积和实际进样量进行线性回归,所得回归方程、相
关系数和各胆汁酸检出限见表1。线性相关系数在0. 9996～0. 9999之间。各胆汁酸衍生物检出限(按
照信噪比为3来计算, S /N = 3∶1)在12. 94～21. 94 fmol之间。
在相同洗脱条件下,对100 pmol胆汁酸衍生物进行平行6次分析,保留时间和峰面积的测量精密
度很高,结果见表2。
2 0 1 1 分析化学第33卷
表1 胆汁酸衍生物的线性回归方程、相关系数、检测限和一级质谱数据
Table 1 L inear regression equations, correlation coefficients, detection limits and mass spectral data of bile acid derivatives
胆汁酸
Bile acids Y =A +BX 线性相关系数
r
检出限
Detection limits
( fmol)
一级质谱
First step MS
(M + 1) +
GCA Y = 85. 53 + 36. 74 X 0. 9997 12. 94 711. 5
GUDCA Y = 43. 58 + 24. 63 X 0. 9999 16. 37 695. 5
GCDCA Y = 76. 00 + 36. 29 X 0. 9998 15. 73 695. 5
GDCA Y = 78. 20 + 38. 28 X 0. 9998 14. 49 695. 4
CA Y = 42. 28 + 29. 60 X 0. 9999 21. 94 654. 4
UDCA Y = 46. 62 + 30. 05 X 0. 9999 19. 65 638. 4
GLCA Y = 93. 78 + 40. 75 X 0. 9997 14. 52 679. 5
CDCA Y = 80. 55 + 29. 11 X 0. 9996 13. 22 638. 4
DCA Y = 70. 34 + 26. 01 X 0. 9996 13. 84 638. 3
LCA Y = 52. 79 + 28. 73 X 0. 9998 16. 91 622. 5
X: 进样量( injected amount/pmol) ; Y:峰面积(peak area) ;MS:质谱(mass spectum)
3. 4 实际样品分析
3. 4. 1 血清中胆汁酸的提取 向盛有2 mL血清
样品的离心试管中加入3 mL甲醇并振荡摇匀,然
后加入0. 5 g硫酸铵固体超声振荡,离心后取出有
机相用氮气吹干,剩余物用300 mL DMSO溶解后
加入6. 7 mL水。然后用经过4mL 甲醇和5mL水
冲洗的C18 Sep2Pak萃取柱过滤,再用5 mL水冲洗
萃取柱,然后用5 mL乙腈将胆汁酸洗脱,将洗脱液
挥发至干用300 mL DMSO溶解冷藏备用。
3. 4. 2 血清样品中胆汁酸的测定 按照2. 4实验
条件,实际样品的色谱分离见图6;各胆汁酸的测
定结果见表3。实际血清样品中GCA、GUDCA、表2 保留时间和峰面积的测量精密度( n = 6)
Table 2 Precision of area and retention time ( n = 6)
胆汁酸
Bile acids
峰面积相对标准偏差
RSD of peak area
(% )
保留时间相对标准偏差
RSD retention time
(% )
GCA 0. 629 0. 062
GUDCA 0. 641 0. 063
GCDCA 1. 526 0. 060
GDCA 0. 621 0. 058
CA 0. 461 0. 055
UDCA 0. 980 0. 052
GLCA 0. 652 0. 050
CDCA 2. 197 0. 030
DCA 3. 076 0. 029
LCA 0. 473 0. 037
GCDCA、CA、CDCA、DCA、LCA除采用保留值定性外同时进行了质谱确定; GDCA、UDCA、GLCA由于含
图6 血清样品中胆汁酸色谱分离图
Fig. 6 Chromatogram of bile acids from extracted serum
色谱条件见实验部分( chromatographic conditions as described in ex2
perimental section) 。
量底于检出限度未能进行定量。
表3 血清样品中胆汁酸的测定结果
Table 3 Results of bile acids from extracted serum
胆汁酸
Bile acids
血清样品
Serum samp le
(μmol/L)
鉴定Identification
保留值
Retention time
质谱
(MS)
GCA 0. 0038 Yes
GUDCA 0. 0308 Yes Yes
GCDCA 0. 1848 Yes Yes
GDCA - Yes No
CA 0. 0536 Yes Yes
UDCA - Yes No
CA - Yes No
CDCA 0. 2457 Yes Yes
DCA 0. 0344 Yes Yes
LCA 0. 1862 Yes Yes
- :未检出( unidentified)
3. 5 结论
胆汁酸测定方法的建立对于临床及生命科学都有重要意义。实验利用1, 22苯并23, 42二氢咔唑292
乙基对甲苯磺酸酯作为柱前衍生化试剂,对衍生化条件和色谱分离条件进行了优化,并施以柱后在线质
谱鉴定,建立了灵敏、快速测定血清中胆汁酸的方法。衍生试剂稳定、灵敏,能快速方便的与胆汁酸进行
3 0 1 1 第8期石运伟等:血清中胆汁酸的高效液相色谱荧光测定及质谱鉴定
衍生反应且衍生产率高、衍生产物稳定。此方法能够准确定量且具有线性范围宽、重现性好等优点。对
血清样品的测定结果与众多文献基本相符。结果表明:此分析测定方法的可行性好,能够为临床及生命
科学的研究提供可靠的数据参考。
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Determ ina tion of Bile Ac ids from Extracted Serum by
High Performance L iqu id Chroma tography2Ma ss
Spectrometry with Fluorescence Detection
Shi Yunwei, Zhao Xian′en, Chen Xiangming, Zhang Haifeng, BaiMin, Cheng Yan, You J inmao
3
(College of Chem istry Science, Qufu N orm al University, Qufu 273165)
Abstract On a reversed2phased Hypersil C18 column , 10 bile acids derivatives were separated using 1, 22
benzo23, 42dihydrocarbazole292ethyl2p2toluenesulfonate (BDETS) as p re2column derivatization reagent by high2
performance liquid chromatographywith fluorescence detection and mass spectrum identification in conjunction
with a gradient elution. Op timum derivatization, giving the corresponding sensitively fluorescent derivatives,was obtained by the reacting of bile acidswith BDETS at 95℃ for 30 min in the p resence ofmild basic catalyst
potassium citrate in dimethyl sulfoxide solvent. The fluorescence excitation and emission wavelengthswere set
atλex 333 andλem 390 nm, respectively. The identification of bile acids derivativeswas obtained on the basis
of atmospheric2p ressure chemical ionization source at positive model detection. Correlation coefficients for the
peak areasand bile acid derivative concentrations are > 0. 9996, and detection limits at signal2to2noise of 3∶1
are 12. 94～21. 94 fmol for the labeled bile acids. The established method is sensitive and rep roducible for the
determination of bile acids from real samp leswith satisfactory results.
Keywords High performance liquid chromatography, fluorescence detection, p re2column derivatization,serum, bile acids
(Received 26 July 2004; accep ted 24 January 2005)
4 0 1 1 分析化学第33卷, http://www.100md.com(石运伟 赵先恩 陈向明 张海峰 白 敏 程 艳 尤进茂)