促甲状腺激素化学发光免疫分析的研究
第32 卷
2004 年7 月
分析化学(FENXI HUAXUE) 研究报告
Chinese Journal of Analytical Chemistry
第7 期
893～896
促甲状腺激素化学发光免疫分析的研究
尹东光
3 1 贺佑丰2 刘一兵2 沈德存2 韩世泉2
官国英2 罗志福2 钟儒刚1
1 (北京工业大学生命科学与生物工程学院,北京100022) 2 (中国原子能科学研究院同位素研究所,北京102413)
摘 要 抗原、抗体间可发生特异性免疫反应,将发光物质标记在抗体上,经免疫反应和化学发光反应,测量
光信号可对待测抗原进行定性、定量分析。本实验以吖啶酯DMAE·NHS 标记TSH 单克隆抗体,建立了TSH
化学发光免疫分析方法。该方法分析灵敏度为0. 01 mIU/ L , 批内相对标准偏差为4. 29 %～6171 % ,批间相
对标准偏差为4. 36 %～ 8. 14 %;平均回收率为98 %。与TSH IRMA 法的相关方程为Y = 0. 02 + 0. 92 X ,相
关系数为0. 993 ;与Ciba Corning TSH CL IA 测量值的相关方程为Y = - 0. 16 + 0. 92 X , 相关系数为0. 986 。
关键词 促甲状腺激素, 化学发光免疫分析, 2′,6′2二甲基2 4′2 (N2琥珀酰亚胺氧羰基) 苯基2102甲基2吖啶292
甲酸酯甲氧基硫酸盐
2003207222 收稿;2004202223 接受
1 引 言
促甲状腺激素(thyroid2stimulating hormone ,TSH) 是一种由垂体前叶分泌的糖蛋白激素,它的主要
生理作用是调节甲状腺激素的合成与分泌,血液中甲状腺激素水平与脑垂体分泌TSH 的量之间有负反
馈抑制关系。血清TSH 水平是临床上作为评估甲状腺功能的一项重要指标,采用灵敏度高的TSH 免
疫分析法对区别甲亢、甲状腺癌与甲状腺功能正常具有重要意义。
化学发光免疫分析(CL IA) 是一种灵敏的免疫分析方法,已得到了广泛的应用1 ～10 。近年来开展
了CL IA 技术的研究工作,合成了化学发光物质———吖啶酯DMAE·NHS 2 ′,6′2二甲基24′2(N2琥珀酰
亚胺氧羰基) 苯基2102甲基2吖啶292甲酸酯甲氧基硫酸盐, 并将其标记TSH 单克隆抗体,建立了TSH
CL IA 方法, 该方法具有较高的分析灵敏度。
2 实验部分
2. 1 试剂
DMAE·NHS 2 ′,6′2二甲基24′2(N2琥珀酰亚胺氧羰基) 苯基2102甲基2吖啶292甲酸酯甲氧基硫酸
盐, 本实验室参照文献11 的方法并作适当改进后合成;96 微孔板(丹麦NuNc 公司) ;两株配对的抗
TSH 单克隆抗体(McAb) ,一株抗TSH McAb(代号04Ab) (芬兰Medix 公司) ; 另一株抗TSH McAb(代
号02Ab) (北京协和医科大学) ; TSH 抗原(美国Sigma 公司) ; TSH 免疫放射分析( IRMA) 试剂盒(中国
原子能科学研究院同位素研究所) ;Sephadex G250 (瑞典Pharmacia 公司) ;二甲基甲酰胺(DMF) (Acros
公司) ;牛血清白蛋白(BSA) 、Tween220 和TritonX2100 (华美生物医学工程公司) ; NaN3 (德国Merck 公
司) 。标记缓冲溶液: 0. 1 mol/ L Na2CO3
2NaHCO3 , pH 10. 1 ; 纯化缓冲溶液:0. 1 mol/ L 磷酸盐缓冲溶
液(PB) , pH 6. 3 ,含0. 9 % NaCl ; 分析缓冲溶液:0. 05 mol/ L PB , pH 7. 0 ,含0. 9 % NaCl , 0. 5 % BSA ,0105 % NaN3 , 0. 1 % Tween220 , 0. 05 %正常鼠血清(NMS) ; 洗涤缓冲溶液: 0. 01 mol/ L PB , pH 7. 4 ,含019 % NaCl 0. 05 % Tween220 ; 包被缓冲溶液:0. 05 mol/ L Na2CO3
2NaHCO3 , pH 9. 5 ; 封闭缓冲溶
液:0105 mol/ L PB , pH 7. 4 , 含0. 9 % NaCl , 1 %BSA , 0. 04 % NaN3 。
2. 2 仪器
Victor 1420 多标记数器(芬兰Wallac 公司) ;紫外2可见分光光度计(美国Varian 公司) ; Shimaelzu
LC26A 高压液相色谱仪(日本日立公司) ;12902003 Delfia 微孔板振荡器(芬兰Wallac 公司) 。
2. 3 实验方法
2. 3. 1 DMAE·NHS 标记04Ab 将100μL 1 g/ L 的04Ab 预先在标记缓冲溶液中透析过夜。称取一
定量的DMAE·NHS ,溶于无水DMF 中, 配成浓度为6. 5 mmol/ L 的DMAE·NHS 的DMF 溶液。将经透
析过后的04Ab 置于2 mL 棕色小玻璃瓶中,加入7. 5μL 6. 5 mmol/ L DMAE·NHS DMF 溶液,室温下搅拌
反应1 h 后,加入100μL 10 g/ L 赖氨酸反应15 min , 使标记反应终止。标记物DMAE·NHS204Ab 与游离
DMAE·NHS 通过Sephadex G250 柱(1 cm ×25 cm) 分离,用纯化缓冲溶液平衡并淋洗柱子,分离过程中用色
谱仪监测蛋白峰,分别测量流出液的化学发光强度CPS 值(每秒光子计数) 和280 nm 处吸光度值,取发光
强度高且吸光度大的部分,加入1 %BSA 后分装冰冻保存。
2. 3. 2 TSH标准的配制 正常小牛血清在57 ℃下灭活0. 5 h ,经IRMA 测量其TSH 浓度与IRMA 试剂盒
的零血清相同,以此作为“零”标准血清。将不同量的TSH 加入经灭活后的正常小牛血清中,得一系列TSH
浓度的血清。以TSH IRMA 试剂盒标定血清的TSH浓度。配制好的TSH标准分装冰冻保存。
2. 3. 3 固相抗体的制备 将02Ab 用包被缓冲溶液稀释成6 mg/ L , 取96 微孔板,每孔加入200 μL
6 mg/ L 02Ab , 4 ℃放置过夜,甩弃溶液后,用洗涤缓冲溶液洗板2 次,每孔加入封闭缓冲溶液250μL ,室温封闭2 h ,甩弃封闭液, 4 ℃密封保存。
2. 3. 4 血清TSH CLIA DMAE·NHS204Ab 用分析缓冲溶液稀释成浓度为88 μg/ L ,向包被有02Ab
的微孔板中,每孔加入100μL 标准品或样品,100μL DMAE·NHS204Ab 稀释液,室温下振荡5 h 后,每
次每孔加入200μL 洗涤缓冲溶液洗板6 次,在发光计上测量各孔的CPS , 在双对数座标纸上以CPS 对
TSH 浓度作图,根据标准曲线求出待测物的浓度。
3 结果与讨论
3. 1 02Ab 包被浓度对TSH CLIA的影响
温育时间为5 h , DMAE·NHS204Ab 的量为8. 8 ng/ 孔, 改变02Ab 的包被浓度,做每种包被浓度下
图1 02Ab 包被浓度对TSH CL IA 的影响
Fig. 1 Effect of coating concentration of 02antibody (02Ab) on
the thyroid2stimulating hormone ( TSH) chemiluminescent im2
munoassay ( TSH CL IA)
1. 信噪比与02Ab 包被浓度的关系曲线( signal2to2noise2ratio vs coating
concentration of 02Ab) ; 2. cps 与02Ab 包被浓度的关系曲线( counts/
second (cps) vs coating concentration of 02Ab) 。
的TSH CL IA , 观察测得的各标准点的CPS
以及信噪比( S / N , TSH 浓度为0. 25 mIU/ L
的标准点与零标准点的CPS 之比) 随02Ab 包
被浓度的变化。图1 为测得的G标准点( TSH
浓度为75 mIU/ L) 的CPS 及信噪比与02Ab
的包被浓度的关系。由图1 可知,G 标准点的
CPS 值随02Ab 的包被浓度的增加而增大,但
当02Ab 包被浓度达到6 mg/ L 后,CPS 出现
平台,其它标准点的情况与此相似,且信噪比
在02Ab 的包被浓度为3 mg/ L 时已大于4. 0 ,因此,选择TSH CL IA 的02Ab 的包被浓度为
6μg/ L 。
3. 2 DMAE·NHS204Ab 的量对TSH CLIA 的
影响
取包被有02Ab 的微孔板,温育时间为5
h , 改变加入反应体系中标记物DMAE·NHS2
04Ab 的量,分别做不同量DMAE·NHS204Ab 的TSH CL IA , 如图2 所示。G 标准点的CPS 随DMAE·
NHS204Ab 的量的增加而增大,但当DMAE·NHS204Ab 的量达到8. 8 ng (以04Ab 的量为计算标准) 后,CPS 出现平台。且信噪比(S/ N) 在DMAE·NHS204Ab 的量大于0. 88 ng 小于35. 2 ng 时,都能达到4. 0
以上。因此,选择TSH CL IA 每微孔加入DMAE·NHS204Ab 的量为8. 8 ng。
3. 3 温育时间对TSH CLIA的影响
DMAE·NHS204Ab 的量为8. 8 ng , 改变温育时间,分别做不同温育时间的TSH CL IA。由图3 可
4 9 8 分析化学第32 卷
图2 DMAE·NHS - 04Ab 的量对TSH CL IA 的影响
Fig. 2 Effect of 2′, 6′2dimethy242( N2succinimidy2
loxycarbony l ) phenyl2102methyl2acridinium292carboxylate
methosulfate (DMAE·NHS)204antibody on the TSH CL IA
1. 信噪比与DMAE·NHS204Ab 的量的关系曲线(signal to noise ratio
vs DMAE·NHS204Ab) ; 2. cps 与DMAE·NHS204Ab 的量的关系曲
线(cps vs DMAE·NHS204Ab) 。
知,G 标准点的CPS 值随温育时间的增加而增
大;但当温育时间达到5 h 后,CPS 出现平台,则
在所固定的反应条件下,免疫反应达到平衡的时
间为5 h , 温育时间3 h 以上能达到较高的信噪
比。据此,选择TSH CL IA 的温育时间为5 h 。
3. 4 一步法与两步法TSH CLIA比较
一步法如2. 3. 4 所述。二步法:取包被02Ab
的微孔板,每孔加入100μL 标准及样品,室温下
振荡3. 5 h , 洗板4 次,加入100 μL 浓度为88
μg/ L 的DMAE·NHS204Ab 稀释液,室温下振荡
1. 5 h , 洗板6 次,在发光计上测量各孔的CPS。
结果表明,对应TSH 浓度为75 mIU/ L ,一步法和
两步法的CPS 分别为165948 和123516 。且一步
法的信噪比也较两步法高,分别为4. 56 和2. 67 ,因此,选择TSH CL IA 一步法。
3. 5 两种温育方式的TSH CLIA比较
图3 温育时间对TSH CL IA 的影响
Fig. 3 Effect of incubation time on the TSH CL IA
1. 信噪比与温育时间的关系曲线( signal to noise ratio vs incubation
time) ; 2. cps 值与温育时间的关系曲线( cps vs incubation time) 。
一种温育方式为室温振荡5 h , 另一种为
37 ℃烘箱温育5 h ,不振荡。实验结果表明, 前者
的CPS 值较后者大,对应TSH 浓度为75 mIU/
L ,两者的CPS 分别为188028 和105666 。且前者
的信噪比也较后者高,分别为4. 86 和3. 87 。以
微孔包被抗体的免疫反应,抗原抗体反应在微孔
表面进行,反应速度主要决定于抗原、抗体扩散至
微孔表面的速度。在静止状态下,这种扩散速度
由抗原、抗体的浓度及其由微孔中央至微孔表面
的浓度梯度决定。而振荡能加快溶液与固相表面
的相对运动,加快试剂扩散至微孔表面的速度,进
而能加快免疫反应速度。
3. 6 TSH CLIA方法学评价
3. 6. 1 标准曲线和检出限 在0. 25～75 mIU/
L 的TSH 浓度范围内, TSH CL IA 的TSH 浓度
与特异化学发光强度(CPS) 呈现良好的线性关系,线性相关系数为0. 9998 , 信噪比( S / N ) 为4. 86 。与
75 mIU/ L TSH 标准相对应的CPS 约为160000 。测量20 个零标准的CPS ,求出标准偏差,以2 倍标准
偏差计算,得该方法的TSH 检出限为0. 01 mIU/ L ,该方法的检出限较放射免疫分析法(RIA 法, 对
TSH 的检出限为0. 1 mIU/ L) 和免疫放射分析法( IRMA 法,对TSH 的检出限为0. 04 mIU/ L) 都要低。
3. 6. 2 精密度 以低(2. 08 mIU/ L) 、中(9. 72 mIU/ L) 和高(19. 35 mIU/ L) 3 种TSH浓度的重复测量,批
内( n = 10) RSD 分别为5. 74 %、4. 29 %和6. 71 %;批间( n = 10) RSD 分别为5. 24 %、4. 36 %和8. 14 %。
3. 6. 3 标准加入的回收率 在已知TSH 浓度的血清中,加入3 种不同浓度的TSH 标准血清(0. 6 、2. 7
和75 mIU/ L) ,测定回收率分别为109. 5 %、91. 8 %和92. 7 %。
3. 6. 4 健全性 将TSH 浓度为2. 01 和21. 4 mIU/ L 的2 份血清,用标准零血清分别按1/ 2 、1/ 4 、1/ 8 、1/ 16和1/ 32 稀释,测量各稀释浓度的TSH 浓度,TSH 的测量值与稀释倍数之间呈良好的线性关系, 线
性相关系数分别为0. 992 和0. 999 , 相关方程分别为Y = 0. 066 + 2. 08 X , Y = 0. 14 + 22. 1 X 。
3. 6. 5 与TSH IRMA的相关性 以本实验的TSH CL IA 方法和中国原子能科学研究院同位素研究所
的TSH IRMA 法分别测量65 例临床血清(35 例正常人血清, 20 例甲亢病人和10 例甲低病人) 的TSH
5 9 8 第7 期尹东光等:促甲状腺激素化学发光免疫分析的研究
浓度, (见图4) 。两种方法的测量值相关性良好,相关方程为Y = 0. 02 + 0. 92 X ,相关系数为0. 993 。
3. 6. 6 与Ciba Corning TSH CLIA 测量值的相关性 以本方法对56 例临床血清(17 例正常人血清,30
例甲低病人和9 例甲亢病人的血清, 北京301 医院提供,附Ciba Corning 公司CL IA 的测量值) 进行测
量,见图5 。测量结果与Ciba Corning TSH CL IA 测量值相关良好,相关方程为Y = - 0. 16 + 0192 X ,相关系数为0. 986 。
References
1 Loranelle L S , Timothy A N. J . Biolumin. Chemilumin. , 1998 , 13 :85～90
2 Baret A , Fert V. J . Biolumin. Chemilumin. , 1989 , 4 :149～153
3 Zia R , Frank M. L uminescence , 2000 , 15 :239～244
4 Marta S C , Antonia E , Virtudes C. Clin. Chem. , 1999 , 45 :1944～1953
5 Gary F B , Haresh P S , John H K, Leland J , Kamin R A. Clin. Chem. , 1991 , 37 :1534～1539
6 Daniel R D. Nature , 1995 , 377 :758～760
7 Peter W , Darcy L , Dennis M , Katby H. Clim. Chem. , 1996 , 42 :1575～1578
8 Takashi L , Masatoshi Y, Koichi S , Yoshihiro S , Yukil S. J . Biolumin. Chemilumin. , 1995 , 10 :219～227
9 lain B ,Vincent F , Joel A. A nalytical Biochemist ry , 1990 , 187 :20～26
10 Aldo R , Simoni P , Mirasoli M , Baraldini M. A nal . Bio. Chem. , 2002 , 372 :751～758
11 Law S J , Chang S C S , Palmacci S A. U. S . Patent , 745181 ,1988
Chemiluminescent Immunoassay for Thyroid2stimulating Hormone
Yin Dongguang
3 1 , He Youfeng2 , Liu Yibing2 , Shen Decun2 , Han Shiquan2 , Guan Guoying2 , Luo Zhifu2 , Zhong Rugang1
1 ( Department of L if e Sciences and Bioengineering , Beijing University of Technology , Beijing 100022 )
2 ( Isotopic Department of China Institute of A tomic Energy P. O. Box 275 (39) , Beijing 102413 )
Abstract Chemiluminescent immunoassay for thyroid2stimulating hormone ( TSH) was established. The
assay involves sandwich type model with two monoclonal antibodies of TSH , one was coated onto 96 wells
plate and the other labeled with 2′,6′2dimethyl24′2(N2succinimidyloxycarbonyl) phenyl2102methyl2acridini2
um292carboxylate methosulfate (DMAE·NHS) . The detection limit of the method is 0. 01 mIU/ L. In2
t rassay relative standard deviation is 4. 3～6. 7 %. Interassay relative standard deviation is 4. 4 %～ 811 %
with average recovery of 98 %. Correlation coefficient and regression equation of the assay with TSH
immunoradionmet ric are 0. 993 and Y = 0. 02 + 0. 92 X , respectively.
Keywords Thyroid2stimulating hormone , chemiluminescent immunoassay , 2′,6′2dimethyl24′2 (N2succin2
imidyloxycar2bonyl) phenyl2102methyl2acridinium292carboxylate methosulfate
(Received 22 J uly 2003 ; accepted 23 February 2004)
6 9 8 分析化学第32 卷, 百拇医药(尹东光1 贺佑丰2 刘一兵2 沈德存2 韩世泉2)
2004 年7 月
分析化学(FENXI HUAXUE) 研究报告
Chinese Journal of Analytical Chemistry
第7 期
893～896
促甲状腺激素化学发光免疫分析的研究
尹东光
3 1 贺佑丰2 刘一兵2 沈德存2 韩世泉2
官国英2 罗志福2 钟儒刚1
1 (北京工业大学生命科学与生物工程学院,北京100022) 2 (中国原子能科学研究院同位素研究所,北京102413)
摘 要 抗原、抗体间可发生特异性免疫反应,将发光物质标记在抗体上,经免疫反应和化学发光反应,测量
光信号可对待测抗原进行定性、定量分析。本实验以吖啶酯DMAE·NHS 标记TSH 单克隆抗体,建立了TSH
化学发光免疫分析方法。该方法分析灵敏度为0. 01 mIU/ L , 批内相对标准偏差为4. 29 %～6171 % ,批间相
对标准偏差为4. 36 %～ 8. 14 %;平均回收率为98 %。与TSH IRMA 法的相关方程为Y = 0. 02 + 0. 92 X ,相
关系数为0. 993 ;与Ciba Corning TSH CL IA 测量值的相关方程为Y = - 0. 16 + 0. 92 X , 相关系数为0. 986 。
关键词 促甲状腺激素, 化学发光免疫分析, 2′,6′2二甲基2 4′2 (N2琥珀酰亚胺氧羰基) 苯基2102甲基2吖啶292
甲酸酯甲氧基硫酸盐
2003207222 收稿;2004202223 接受
1 引 言
促甲状腺激素(thyroid2stimulating hormone ,TSH) 是一种由垂体前叶分泌的糖蛋白激素,它的主要
生理作用是调节甲状腺激素的合成与分泌,血液中甲状腺激素水平与脑垂体分泌TSH 的量之间有负反
馈抑制关系。血清TSH 水平是临床上作为评估甲状腺功能的一项重要指标,采用灵敏度高的TSH 免
疫分析法对区别甲亢、甲状腺癌与甲状腺功能正常具有重要意义。
化学发光免疫分析(CL IA) 是一种灵敏的免疫分析方法,已得到了广泛的应用1 ～10 。近年来开展
了CL IA 技术的研究工作,合成了化学发光物质———吖啶酯DMAE·NHS 2 ′,6′2二甲基24′2(N2琥珀酰
亚胺氧羰基) 苯基2102甲基2吖啶292甲酸酯甲氧基硫酸盐, 并将其标记TSH 单克隆抗体,建立了TSH
CL IA 方法, 该方法具有较高的分析灵敏度。
2 实验部分
2. 1 试剂
DMAE·NHS 2 ′,6′2二甲基24′2(N2琥珀酰亚胺氧羰基) 苯基2102甲基2吖啶292甲酸酯甲氧基硫酸
盐, 本实验室参照文献11 的方法并作适当改进后合成;96 微孔板(丹麦NuNc 公司) ;两株配对的抗
TSH 单克隆抗体(McAb) ,一株抗TSH McAb(代号04Ab) (芬兰Medix 公司) ; 另一株抗TSH McAb(代
号02Ab) (北京协和医科大学) ; TSH 抗原(美国Sigma 公司) ; TSH 免疫放射分析( IRMA) 试剂盒(中国
原子能科学研究院同位素研究所) ;Sephadex G250 (瑞典Pharmacia 公司) ;二甲基甲酰胺(DMF) (Acros
公司) ;牛血清白蛋白(BSA) 、Tween220 和TritonX2100 (华美生物医学工程公司) ; NaN3 (德国Merck 公
司) 。标记缓冲溶液: 0. 1 mol/ L Na2CO3
2NaHCO3 , pH 10. 1 ; 纯化缓冲溶液:0. 1 mol/ L 磷酸盐缓冲溶
液(PB) , pH 6. 3 ,含0. 9 % NaCl ; 分析缓冲溶液:0. 05 mol/ L PB , pH 7. 0 ,含0. 9 % NaCl , 0. 5 % BSA ,0105 % NaN3 , 0. 1 % Tween220 , 0. 05 %正常鼠血清(NMS) ; 洗涤缓冲溶液: 0. 01 mol/ L PB , pH 7. 4 ,含019 % NaCl 0. 05 % Tween220 ; 包被缓冲溶液:0. 05 mol/ L Na2CO3
2NaHCO3 , pH 9. 5 ; 封闭缓冲溶
液:0105 mol/ L PB , pH 7. 4 , 含0. 9 % NaCl , 1 %BSA , 0. 04 % NaN3 。
2. 2 仪器
Victor 1420 多标记数器(芬兰Wallac 公司) ;紫外2可见分光光度计(美国Varian 公司) ; Shimaelzu
LC26A 高压液相色谱仪(日本日立公司) ;12902003 Delfia 微孔板振荡器(芬兰Wallac 公司) 。
2. 3 实验方法
2. 3. 1 DMAE·NHS 标记04Ab 将100μL 1 g/ L 的04Ab 预先在标记缓冲溶液中透析过夜。称取一
定量的DMAE·NHS ,溶于无水DMF 中, 配成浓度为6. 5 mmol/ L 的DMAE·NHS 的DMF 溶液。将经透
析过后的04Ab 置于2 mL 棕色小玻璃瓶中,加入7. 5μL 6. 5 mmol/ L DMAE·NHS DMF 溶液,室温下搅拌
反应1 h 后,加入100μL 10 g/ L 赖氨酸反应15 min , 使标记反应终止。标记物DMAE·NHS204Ab 与游离
DMAE·NHS 通过Sephadex G250 柱(1 cm ×25 cm) 分离,用纯化缓冲溶液平衡并淋洗柱子,分离过程中用色
谱仪监测蛋白峰,分别测量流出液的化学发光强度CPS 值(每秒光子计数) 和280 nm 处吸光度值,取发光
强度高且吸光度大的部分,加入1 %BSA 后分装冰冻保存。
2. 3. 2 TSH标准的配制 正常小牛血清在57 ℃下灭活0. 5 h ,经IRMA 测量其TSH 浓度与IRMA 试剂盒
的零血清相同,以此作为“零”标准血清。将不同量的TSH 加入经灭活后的正常小牛血清中,得一系列TSH
浓度的血清。以TSH IRMA 试剂盒标定血清的TSH浓度。配制好的TSH标准分装冰冻保存。
2. 3. 3 固相抗体的制备 将02Ab 用包被缓冲溶液稀释成6 mg/ L , 取96 微孔板,每孔加入200 μL
6 mg/ L 02Ab , 4 ℃放置过夜,甩弃溶液后,用洗涤缓冲溶液洗板2 次,每孔加入封闭缓冲溶液250μL ,室温封闭2 h ,甩弃封闭液, 4 ℃密封保存。
2. 3. 4 血清TSH CLIA DMAE·NHS204Ab 用分析缓冲溶液稀释成浓度为88 μg/ L ,向包被有02Ab
的微孔板中,每孔加入100μL 标准品或样品,100μL DMAE·NHS204Ab 稀释液,室温下振荡5 h 后,每
次每孔加入200μL 洗涤缓冲溶液洗板6 次,在发光计上测量各孔的CPS , 在双对数座标纸上以CPS 对
TSH 浓度作图,根据标准曲线求出待测物的浓度。
3 结果与讨论
3. 1 02Ab 包被浓度对TSH CLIA的影响
温育时间为5 h , DMAE·NHS204Ab 的量为8. 8 ng/ 孔, 改变02Ab 的包被浓度,做每种包被浓度下
图1 02Ab 包被浓度对TSH CL IA 的影响
Fig. 1 Effect of coating concentration of 02antibody (02Ab) on
the thyroid2stimulating hormone ( TSH) chemiluminescent im2
munoassay ( TSH CL IA)
1. 信噪比与02Ab 包被浓度的关系曲线( signal2to2noise2ratio vs coating
concentration of 02Ab) ; 2. cps 与02Ab 包被浓度的关系曲线( counts/
second (cps) vs coating concentration of 02Ab) 。
的TSH CL IA , 观察测得的各标准点的CPS
以及信噪比( S / N , TSH 浓度为0. 25 mIU/ L
的标准点与零标准点的CPS 之比) 随02Ab 包
被浓度的变化。图1 为测得的G标准点( TSH
浓度为75 mIU/ L) 的CPS 及信噪比与02Ab
的包被浓度的关系。由图1 可知,G 标准点的
CPS 值随02Ab 的包被浓度的增加而增大,但
当02Ab 包被浓度达到6 mg/ L 后,CPS 出现
平台,其它标准点的情况与此相似,且信噪比
在02Ab 的包被浓度为3 mg/ L 时已大于4. 0 ,因此,选择TSH CL IA 的02Ab 的包被浓度为
6μg/ L 。
3. 2 DMAE·NHS204Ab 的量对TSH CLIA 的
影响
取包被有02Ab 的微孔板,温育时间为5
h , 改变加入反应体系中标记物DMAE·NHS2
04Ab 的量,分别做不同量DMAE·NHS204Ab 的TSH CL IA , 如图2 所示。G 标准点的CPS 随DMAE·
NHS204Ab 的量的增加而增大,但当DMAE·NHS204Ab 的量达到8. 8 ng (以04Ab 的量为计算标准) 后,CPS 出现平台。且信噪比(S/ N) 在DMAE·NHS204Ab 的量大于0. 88 ng 小于35. 2 ng 时,都能达到4. 0
以上。因此,选择TSH CL IA 每微孔加入DMAE·NHS204Ab 的量为8. 8 ng。
3. 3 温育时间对TSH CLIA的影响
DMAE·NHS204Ab 的量为8. 8 ng , 改变温育时间,分别做不同温育时间的TSH CL IA。由图3 可
4 9 8 分析化学第32 卷
图2 DMAE·NHS - 04Ab 的量对TSH CL IA 的影响
Fig. 2 Effect of 2′, 6′2dimethy242( N2succinimidy2
loxycarbony l ) phenyl2102methyl2acridinium292carboxylate
methosulfate (DMAE·NHS)204antibody on the TSH CL IA
1. 信噪比与DMAE·NHS204Ab 的量的关系曲线(signal to noise ratio
vs DMAE·NHS204Ab) ; 2. cps 与DMAE·NHS204Ab 的量的关系曲
线(cps vs DMAE·NHS204Ab) 。
知,G 标准点的CPS 值随温育时间的增加而增
大;但当温育时间达到5 h 后,CPS 出现平台,则
在所固定的反应条件下,免疫反应达到平衡的时
间为5 h , 温育时间3 h 以上能达到较高的信噪
比。据此,选择TSH CL IA 的温育时间为5 h 。
3. 4 一步法与两步法TSH CLIA比较
一步法如2. 3. 4 所述。二步法:取包被02Ab
的微孔板,每孔加入100μL 标准及样品,室温下
振荡3. 5 h , 洗板4 次,加入100 μL 浓度为88
μg/ L 的DMAE·NHS204Ab 稀释液,室温下振荡
1. 5 h , 洗板6 次,在发光计上测量各孔的CPS。
结果表明,对应TSH 浓度为75 mIU/ L ,一步法和
两步法的CPS 分别为165948 和123516 。且一步
法的信噪比也较两步法高,分别为4. 56 和2. 67 ,因此,选择TSH CL IA 一步法。
3. 5 两种温育方式的TSH CLIA比较
图3 温育时间对TSH CL IA 的影响
Fig. 3 Effect of incubation time on the TSH CL IA
1. 信噪比与温育时间的关系曲线( signal to noise ratio vs incubation
time) ; 2. cps 值与温育时间的关系曲线( cps vs incubation time) 。
一种温育方式为室温振荡5 h , 另一种为
37 ℃烘箱温育5 h ,不振荡。实验结果表明, 前者
的CPS 值较后者大,对应TSH 浓度为75 mIU/
L ,两者的CPS 分别为188028 和105666 。且前者
的信噪比也较后者高,分别为4. 86 和3. 87 。以
微孔包被抗体的免疫反应,抗原抗体反应在微孔
表面进行,反应速度主要决定于抗原、抗体扩散至
微孔表面的速度。在静止状态下,这种扩散速度
由抗原、抗体的浓度及其由微孔中央至微孔表面
的浓度梯度决定。而振荡能加快溶液与固相表面
的相对运动,加快试剂扩散至微孔表面的速度,进
而能加快免疫反应速度。
3. 6 TSH CLIA方法学评价
3. 6. 1 标准曲线和检出限 在0. 25～75 mIU/
L 的TSH 浓度范围内, TSH CL IA 的TSH 浓度
与特异化学发光强度(CPS) 呈现良好的线性关系,线性相关系数为0. 9998 , 信噪比( S / N ) 为4. 86 。与
75 mIU/ L TSH 标准相对应的CPS 约为160000 。测量20 个零标准的CPS ,求出标准偏差,以2 倍标准
偏差计算,得该方法的TSH 检出限为0. 01 mIU/ L ,该方法的检出限较放射免疫分析法(RIA 法, 对
TSH 的检出限为0. 1 mIU/ L) 和免疫放射分析法( IRMA 法,对TSH 的检出限为0. 04 mIU/ L) 都要低。
3. 6. 2 精密度 以低(2. 08 mIU/ L) 、中(9. 72 mIU/ L) 和高(19. 35 mIU/ L) 3 种TSH浓度的重复测量,批
内( n = 10) RSD 分别为5. 74 %、4. 29 %和6. 71 %;批间( n = 10) RSD 分别为5. 24 %、4. 36 %和8. 14 %。
3. 6. 3 标准加入的回收率 在已知TSH 浓度的血清中,加入3 种不同浓度的TSH 标准血清(0. 6 、2. 7
和75 mIU/ L) ,测定回收率分别为109. 5 %、91. 8 %和92. 7 %。
3. 6. 4 健全性 将TSH 浓度为2. 01 和21. 4 mIU/ L 的2 份血清,用标准零血清分别按1/ 2 、1/ 4 、1/ 8 、1/ 16和1/ 32 稀释,测量各稀释浓度的TSH 浓度,TSH 的测量值与稀释倍数之间呈良好的线性关系, 线
性相关系数分别为0. 992 和0. 999 , 相关方程分别为Y = 0. 066 + 2. 08 X , Y = 0. 14 + 22. 1 X 。
3. 6. 5 与TSH IRMA的相关性 以本实验的TSH CL IA 方法和中国原子能科学研究院同位素研究所
的TSH IRMA 法分别测量65 例临床血清(35 例正常人血清, 20 例甲亢病人和10 例甲低病人) 的TSH
5 9 8 第7 期尹东光等:促甲状腺激素化学发光免疫分析的研究
浓度, (见图4) 。两种方法的测量值相关性良好,相关方程为Y = 0. 02 + 0. 92 X ,相关系数为0. 993 。
3. 6. 6 与Ciba Corning TSH CLIA 测量值的相关性 以本方法对56 例临床血清(17 例正常人血清,30
例甲低病人和9 例甲亢病人的血清, 北京301 医院提供,附Ciba Corning 公司CL IA 的测量值) 进行测
量,见图5 。测量结果与Ciba Corning TSH CL IA 测量值相关良好,相关方程为Y = - 0. 16 + 0192 X ,相关系数为0. 986 。
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Chemiluminescent Immunoassay for Thyroid2stimulating Hormone
Yin Dongguang
3 1 , He Youfeng2 , Liu Yibing2 , Shen Decun2 , Han Shiquan2 , Guan Guoying2 , Luo Zhifu2 , Zhong Rugang1
1 ( Department of L if e Sciences and Bioengineering , Beijing University of Technology , Beijing 100022 )
2 ( Isotopic Department of China Institute of A tomic Energy P. O. Box 275 (39) , Beijing 102413 )
Abstract Chemiluminescent immunoassay for thyroid2stimulating hormone ( TSH) was established. The
assay involves sandwich type model with two monoclonal antibodies of TSH , one was coated onto 96 wells
plate and the other labeled with 2′,6′2dimethyl24′2(N2succinimidyloxycarbonyl) phenyl2102methyl2acridini2
um292carboxylate methosulfate (DMAE·NHS) . The detection limit of the method is 0. 01 mIU/ L. In2
t rassay relative standard deviation is 4. 3～6. 7 %. Interassay relative standard deviation is 4. 4 %～ 811 %
with average recovery of 98 %. Correlation coefficient and regression equation of the assay with TSH
immunoradionmet ric are 0. 993 and Y = 0. 02 + 0. 92 X , respectively.
Keywords Thyroid2stimulating hormone , chemiluminescent immunoassay , 2′,6′2dimethyl24′2 (N2succin2
imidyloxycar2bonyl) phenyl2102methyl2acridinium292carboxylate methosulfate
(Received 22 J uly 2003 ; accepted 23 February 2004)
6 9 8 分析化学第32 卷, 百拇医药(尹东光1 贺佑丰2 刘一兵2 沈德存2 韩世泉2)