冬虫夏草等药用真菌液体发酵研究进展(3)
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2005年11月24日
2.3 提取利用代谢产物
药用真菌液体深层发酵物可以提取如多糖、多肽、生物碱、萜类化台物、甾醇、苷类、酚类、酶、核酸，氨基酸、维生素、Mn-SOD、具抗生素作用的化合物以及植物激素等生理活性物质。例如尚德静(1996)采用灵芝、金针菇、香菇和猴头菌深层发酵的方法.利用药用真菌在生长过程中分泌产生的纤维素醣、果胶酶、蛋白酶对花粉壁进行生化处理，最终使花粉破壁，破壁率达70% -80% 以上。
3 菌种的优化
为了提高液体深层发酵的水平，获得更多有效产物，除了探索最佳的培养条件外，菌种的优化也是一个关键。在选育优良菌种时，通常使用方法有：
3.1紫外诱变技术
以灰树花为例，用灰树花Gr 9801为出发菌株，采用紫外线连续诱变，经分离纯化、驯化等方法，以斜面生长速度和液体摇瓶发酵产多糖总量为监测指标，筛选出一株遗传上相对稳定的适应液体培养的灰树花菌株--GrUV 04，该菌株在综合PDA培养基上生长速度快，菌体丰满纯白。驯化后在液体培养基中发酵生长力强，生物量达1.97% ，发酵多糖总量达216mg/100 ml。分别较出发菌株提高129.1% 和75.6%。对灵芝原生质体进行了紫外诱变处理，经过粗筛和精筛，选出多糖含量明显高于原始菌株的新品种，经过10代的PDA培养基及摇瓶试验和多次3吨罐的中试试验，表明所得的诱变株确实在产量及多糖含量上超过原来菌株，从小试、中试的结果看该菌株的性状比较稳定。如罗立新等采用紫外线对灵芝菌进行了诱变处理，选育到一株高产菌株，其产菌体量和产胞外粗多糖量，分别比原菌株提高了21.3%和30.6%。
3.2 原生质体融合及基因工程技术
由于真菌的分子生物学研究开展较晚，尤其是大型药用真菌，目前人们对其的遗传背景和基因的表达调控尚不清，利用原生质体融合及基因工程等技术对大型药用真菌进行基因改变的研究还处于起步阶段。薛平海等对灰树花菌株原生质体制备及再生条件进行了研究，研究表明：液体摇瓶振荡培养7 d的菌丝，以0.6M的甘露醇作渗透压稳定剂，采用浓度为2 %的真菌溶壁酶，在pH5.5、30℃条件下酶解5h，原生质体制备率最高，可达6.6×10个/ml，并所得原生质体在两种不同的培养方式中均实现了再生。
4 发酵产物的分析测定
随着药用真菌液体深层发酵技术的发展，对发酵产物的分析测定方法也不断提高。
如：在利用薄层层析法进行灵芝有效成分的定性分析中，选用甲苯-乙酸乙酯～乙酸(12：14：0.5)为展开剂，以硫酸一甲醇(1：1)为显色剂，通过硅胶薄层层析法由灵芝发酵产物中分离得到三种四环三萜酸，并测定了这三种物质的紫外光谱。在云芝菌丝体提取物云芝糖肽中糖和蛋白质的含量及分子量测定中采用了快速、分辨率高和重现性好的高效液相凝胶渗透色谱法(HPGPC)。在对天然和发酵培养冬虫夏草中的腺苷、尿苷、鸟苷等3种核苷类成分的含量的测定中采用了高效毛细管电泳法。, 百拇医药
药用真菌液体深层发酵物可以提取如多糖、多肽、生物碱、萜类化台物、甾醇、苷类、酚类、酶、核酸，氨基酸、维生素、Mn-SOD、具抗生素作用的化合物以及植物激素等生理活性物质。例如尚德静(1996)采用灵芝、金针菇、香菇和猴头菌深层发酵的方法.利用药用真菌在生长过程中分泌产生的纤维素醣、果胶酶、蛋白酶对花粉壁进行生化处理，最终使花粉破壁，破壁率达70% -80% 以上。
3 菌种的优化
为了提高液体深层发酵的水平，获得更多有效产物，除了探索最佳的培养条件外，菌种的优化也是一个关键。在选育优良菌种时，通常使用方法有：
3.1紫外诱变技术
以灰树花为例，用灰树花Gr 9801为出发菌株，采用紫外线连续诱变，经分离纯化、驯化等方法，以斜面生长速度和液体摇瓶发酵产多糖总量为监测指标，筛选出一株遗传上相对稳定的适应液体培养的灰树花菌株--GrUV 04，该菌株在综合PDA培养基上生长速度快，菌体丰满纯白。驯化后在液体培养基中发酵生长力强，生物量达1.97% ，发酵多糖总量达216mg/100 ml。分别较出发菌株提高129.1% 和75.6%。对灵芝原生质体进行了紫外诱变处理，经过粗筛和精筛，选出多糖含量明显高于原始菌株的新品种，经过10代的PDA培养基及摇瓶试验和多次3吨罐的中试试验，表明所得的诱变株确实在产量及多糖含量上超过原来菌株，从小试、中试的结果看该菌株的性状比较稳定。如罗立新等采用紫外线对灵芝菌进行了诱变处理，选育到一株高产菌株，其产菌体量和产胞外粗多糖量，分别比原菌株提高了21.3%和30.6%。
3.2 原生质体融合及基因工程技术
由于真菌的分子生物学研究开展较晚，尤其是大型药用真菌，目前人们对其的遗传背景和基因的表达调控尚不清，利用原生质体融合及基因工程等技术对大型药用真菌进行基因改变的研究还处于起步阶段。薛平海等对灰树花菌株原生质体制备及再生条件进行了研究，研究表明：液体摇瓶振荡培养7 d的菌丝，以0.6M的甘露醇作渗透压稳定剂，采用浓度为2 %的真菌溶壁酶，在pH5.5、30℃条件下酶解5h，原生质体制备率最高，可达6.6×10个/ml，并所得原生质体在两种不同的培养方式中均实现了再生。
4 发酵产物的分析测定
随着药用真菌液体深层发酵技术的发展，对发酵产物的分析测定方法也不断提高。
如：在利用薄层层析法进行灵芝有效成分的定性分析中，选用甲苯-乙酸乙酯～乙酸(12：14：0.5)为展开剂，以硫酸一甲醇(1：1)为显色剂，通过硅胶薄层层析法由灵芝发酵产物中分离得到三种四环三萜酸，并测定了这三种物质的紫外光谱。在云芝菌丝体提取物云芝糖肽中糖和蛋白质的含量及分子量测定中采用了快速、分辨率高和重现性好的高效液相凝胶渗透色谱法(HPGPC)。在对天然和发酵培养冬虫夏草中的腺苷、尿苷、鸟苷等3种核苷类成分的含量的测定中采用了高效毛细管电泳法。, 百拇医药