脊髓损伤对大鼠骨细胞凋亡的影响
关键词: 脊髓损伤;骨质疏松;凋亡;骨细胞
摘 要:目的 探讨脊髓损伤(SCI)对骨细胞凋亡的影响及其在SCI后骨质疏松发病中的可能机制. 方法 20只3mo龄SD大鼠均分为SCI组与对照组.SCI组于T10 椎体处完全横断脊髓;对照组仅行椎板切除术，3wk后对股骨进行取材.应用原位凋亡法计数股骨髁部松质骨骨细胞的凋亡指数;对股骨髁部行透射电镜观察;采用双能X线骨密度仪对各组大鼠的股骨髁部骨密度(BMD)进行测定. 结果 SCI组BMD较对照组明显降低(P<0.05)，小梁骨中骨细胞凋亡比率显著上升(P<0.001)，透射电镜观察到SCI组骨细胞异染色质凝聚、边集等典型的细胞凋亡征象. 结论 骨细胞凋亡在SCI后骨质疏松发病中起着重要作用.
Osteocyte apoptosis in rats with spinal cord injury
LI Jing，WANG Quan-Ping，WANG Zhe，FAN Hong-Bin，TAO Hui-Ren
Institute of Orthopedics of Chinese PLA，Xijing Hospital，Fourth Military Medical University，Xi'an710033，China
Keywords:spinal cord injury;osteoporosis;apoptosis;os-teocyte
Abstract:AIM To investigate osteocyte apoptosis in the trabecular bone of rats with spinal cord injury(SCI)and its role in the pathogenesis of osteoporosis following SCI.METHODS Twenty12-week-old rats were randomly divid-ed into the SCI group and control group with10in each group.Rats in the experimental group underwent spinal cord transection at the tenth thoracic vertebrae.Rats in the con-trol group underwent a sham procedure.All animals were sacrificed at3weeks postoperatively.Dual-energy X-ray ab-sorptiometry was carried out to determine the bone mineral density(BMD)in distal femur and ultrastructural investiga-tion of trabecular bone in distal femur was performed by means of transmission electron microscopy.The apoptotic os-teocytes were detected by using terminal-deoxynucleotidyl mediated nick end labeling(TUNEL)technique.RESULTS BMD was lower in SCI group than that in control group(P<0.05);apoptotic index of osteocytes was significantly high-er in the SCI group than in the control group in trabecular bone(6.84%vs1.98%，P<0.001).Condensation and margination of heterochromatins，the typical features of apoptosis，were obviously seen in osteocytes in SCI group.CONCLUSION Rise in apoptotic rate of osteocytes follow-ing SCI indicates that apoptosis may play a part in the patho-genesis of osteoporosis after SCI.
0 引言
细胞凋亡是指有别于细胞坏死，由基因调控的细胞有序的死亡方式.机体大部分细胞是以此种方式完成新旧细胞更替和组织更新.构成组织的细胞异常凋亡可导致肿瘤、退行性变等许多疾病的发生.近年研究表明雌激素缺乏所致的骨质疏松的发病与骨细胞的异常凋亡有关[1，2] .我们通过动物实验探讨骨细胞凋亡在脊髓损伤(spinal cord injury，SCI)后骨质疏松发病过程中的可能作用.
1 材料和方法
1.1 材料
20只12wk龄雌性SD大鼠，购自本校实验动物中心，体质量(205±15)g，随机均分为2组.脊髓损伤模型组于T10 椎体处横断脊髓，对照组仅行椎板切除术.术后3wk处死动物取双侧股骨.将股骨髁部沿矢状正中位切开，一半脱钙固定后做石蜡包埋切片，另外一半用于透射电镜观察.原位细胞凋亡检测试剂盒为华美公司产品.双能X线骨密度仪为Lunar公司生产. 1.2 方法
1.2.1 凋亡细胞的检测
采用原位DNA片段末端标记(TUNEL法)法对凋亡细胞进行染色和记数，按试剂说明进行操作.基本原理为在TdT的介导下，使生物素化的dUTP标记至DNA断裂后的3'-OH末端，借助生物素与亲和素的特异性结合，使辣根过氧化物酶连至DNA断裂点，最后加入底物.通过DAB显色，可在显微镜下观察到细胞核中棕黄着色的凋亡细胞.每例切片观察6个100倍视野(向同一方向移动切片，不重复)，记数骨细胞以及凋亡细胞总数，以平均100个骨细胞中的凋亡细胞个数作为凋亡指数(apoptosis index，AI).
1.2.2 透射电镜观察
取右股骨干骺端大小为1mm×1mm×1mm的松质骨块，4℃条件下用25mL L-1 的戊二醛固定24h，脱钙后冲洗，10mL L-1 的四氧化锇后固定，乙醇逐级脱水，环氧树脂618定向包埋后做超薄切片，经醋酸双氧铀及柠檬酸铅双重染色后，在JEM-200透射电镜下观察.
1.2.3 骨密度测定
双能X线骨密度仪小动物软件对股骨远端(股骨髁至股骨髁上)进行骨密度(bone mineral density，BMD)的测定.
统计学处理:实验数据采用SPSS统计软件进行t检验.
2 结果
2.1 骨密度测定结果 SCI组股骨远端BMD降低，与对照组比较差异显著(P<0.05，Tab1).
表1 SCI大鼠骨密度及骨细胞凋亡指数(略)
2.2 原位凋亡检测
原位凋亡的阳性细胞染色呈棕黄色，凋亡细胞记数结果显示SCI组骨细胞AI增加，与对照组比较差异非常显著(P<0.001，Tab1).
2.3 透射电镜观察
SCI组小梁骨中除了正常的骨细胞外，还可以见到处于凋亡状态的骨细胞.可见骨细胞胞膜出芽鼓涨，细胞核内异染色质的浓聚，环形边集于细胞核膜下呈现出典型凋亡细胞的特征(Fig1(略)).另外还可以见到凋亡小体的形成(Fig2(略)).正常对照组骨细胞核内以异染色质为主，细胞质及细胞器较少，陷窝内絮状物质较均匀，四周嗜锇板层清楚，轮廓光整，多处于静止相以及成骨相(Fig3(略)).
3 讨论
细胞凋亡是指在一定生理或病理条件下由基因控制的细胞有序的死亡，其过程涉及精确的基因转录和蛋白质合成.一方面它是个体发育和机体维持内环境稳定，清除过多或者有害细胞所必需的一种生理反应，另外其作为一种病理机制参与许多疾病如肿瘤、畸形、退行性疾病的发生.
骨作为一种不断重建的组织其骨量很大程度上取决于构成该组织的活性细胞数量，骨细胞数量及活性对于骨量维持有重要意义.Tomkinson等[2] 发现去势大鼠骨细胞凋亡数量较假手术组显著增加，雌激素替代治疗则可显著降低骨细胞凋亡指数，表明雌激素可以抑制骨细胞凋亡和保持骨细胞活性，雌激素缺乏可通过促进骨细胞凋亡影响骨细胞网络活性，从而降低骨对应力载荷反应性使骨脆性增加.Jilka等[3] 的研究表明PTH间断性注射增加正常或由于成骨源性缺乏所致的骨质稀少的骨量是由于抑制骨细胞和成骨细胞的凋亡所致.由此可见，骨细胞正常生存周期对于骨量维持有重要意义，骨细胞过多凋亡参与骨质疏松的发病机制.
骨质疏松是SCI后重要的并发症之一.原位凋亡方法是用于定性定量检测凋亡细胞的一种方法，结合形态学的改变可以准确地对凋亡细胞进行检测.本研究发现SCI组大鼠股骨髁部BMD下降的同时，骨细胞凋亡率明显上升，与对照组比较差异非常显著(P<0.001).骨细胞凋亡发生一般在数分钟内完成，通常在电镜下很少可以观察到典型的细胞凋亡发生.我们应用电镜观察发现SCI组大鼠松质骨骨细胞多处于退变相，还有一些细胞呈现出典型凋亡改变，如细胞核异染色质凝聚边集于核膜之下以及细胞的鼓泡、出芽等征象，对比之下，对照组骨细胞多处于静止相以及成骨相，未见具有典型凋亡特征的骨细胞.以上结果说明骨细胞凋亡增加的程度与骨密度的降低有一定的相关.
骨质疏松发生与骨组织异常改建有关，应力对于骨改建的作用主要由成骨细胞和破骨细胞来完成.骨细胞以及位于骨组织表面的成骨、破骨细胞通过骨小管相互连接组成庞大的网络系统，骨细胞在感受骨组织应变，调节网络活性中起着重要作用.骨细胞利用网样结构通过细胞间信号如cAMP或细胞外的信号分子如PGE2 ，将信号传至骨表面，激活成骨细胞、破骨细胞进行骨改建[4，5] .此外，骨细胞还可以通过感受力学刺激，产生具有合成代谢功能的细胞因子如IGF-1等以旁分泌的方式作用位于骨表面的成骨细胞[5] .一旦骨细胞凋亡增加，一方面空骨陷窝通过扩 大的骨小管互相融合形成较大的空陷窝而致骨小梁的孔隙增多与扩大，导致骨量减少和力学性能下降;另一方面维持细胞网络结构的活性细胞数量减少，从而使骨组织对应力刺激的感受降低和整个网络活性低调，因而在破骨活性增强的同时无相应的成骨代谢增强而致骨吸收-形成脱偶联，最终导致骨吸收大于骨形成而发生骨质疏松.
总之，通过骨密度测定、透射电镜观察以及原位凋亡检测，我们发现脊髓损伤后大鼠骨细胞确实发生凋亡且凋亡数量明显增加并且与局部骨密度降低有明显相关.由此提示骨细胞凋亡在脊髓损伤后骨质疏松发病中起着一定作用.由于细胞凋亡的发生有赖于特定基因的转录与蛋白质合成，因而有加以调控的可能.因此，如何从基因水平阻止或者减少骨细胞凋亡发生将可能是对脊髓损伤后骨质疏松进行有效预防和治疗的途径之一.
参考文献:
[1]Tomkinson A，Gevers EF，Wit JM，Reeve J，Noble BS.The role of estrogen in the control of rat osteocyte apoptosis [J].J Bone Miner Res，1998;13:1243-250.
[2]Tomkinson A，Reeve J，Shaw RW，Noble BS.The death of os-teocytes via apoptosis accompanies estrogen withdrawal in hu-man bone [J].J Clin Endocrinol Metab，1997;82:3128-3135.
[3]Jilka RL，Weinstein RS，Bellido T，Roberson P，Parfitt AM，Manolagas SC.Increased bone formation by prevention of os-teoblast apoptosis with parathyroid hormone [J].J Clin Invest，1999;104:439-446.
[4]Burger EH，Veldhuijzen JP.Influence of mechnical factors on bone formation，resorption and growth in vitro [M].Boca Ra-ton:CRC Press，1993:37-56.
[5]Lean JM，Jagger CJ，Chambers TJ，Chow JM.Increased in-sulin-like growth factor I mRNA expression in rat osteocytes in response to mechanical stimulation [J].Am J Physiol，1995;268:318-327.
作者简介: 李 靖(1973-)，男(汉族)，陕西省榆林市人.医师，博士生 (导师王全平).Tel.(029)2554098 Email.123791LJ@sohu.com
(第四军医大学西京医院全军骨科研究所，陕西西安710033)
编辑 黄良田
收稿日期:2001-01-09, 百拇医药(李靖，王全平，王哲，范宏斌，陶惠人)
摘 要:目的 探讨脊髓损伤(SCI)对骨细胞凋亡的影响及其在SCI后骨质疏松发病中的可能机制. 方法 20只3mo龄SD大鼠均分为SCI组与对照组.SCI组于T10 椎体处完全横断脊髓;对照组仅行椎板切除术，3wk后对股骨进行取材.应用原位凋亡法计数股骨髁部松质骨骨细胞的凋亡指数;对股骨髁部行透射电镜观察;采用双能X线骨密度仪对各组大鼠的股骨髁部骨密度(BMD)进行测定. 结果 SCI组BMD较对照组明显降低(P<0.05)，小梁骨中骨细胞凋亡比率显著上升(P<0.001)，透射电镜观察到SCI组骨细胞异染色质凝聚、边集等典型的细胞凋亡征象. 结论 骨细胞凋亡在SCI后骨质疏松发病中起着重要作用.
Osteocyte apoptosis in rats with spinal cord injury
LI Jing，WANG Quan-Ping，WANG Zhe，FAN Hong-Bin，TAO Hui-Ren
Institute of Orthopedics of Chinese PLA，Xijing Hospital，Fourth Military Medical University，Xi'an710033，China
Keywords:spinal cord injury;osteoporosis;apoptosis;os-teocyte
Abstract:AIM To investigate osteocyte apoptosis in the trabecular bone of rats with spinal cord injury(SCI)and its role in the pathogenesis of osteoporosis following SCI.METHODS Twenty12-week-old rats were randomly divid-ed into the SCI group and control group with10in each group.Rats in the experimental group underwent spinal cord transection at the tenth thoracic vertebrae.Rats in the con-trol group underwent a sham procedure.All animals were sacrificed at3weeks postoperatively.Dual-energy X-ray ab-sorptiometry was carried out to determine the bone mineral density(BMD)in distal femur and ultrastructural investiga-tion of trabecular bone in distal femur was performed by means of transmission electron microscopy.The apoptotic os-teocytes were detected by using terminal-deoxynucleotidyl mediated nick end labeling(TUNEL)technique.RESULTS BMD was lower in SCI group than that in control group(P<0.05);apoptotic index of osteocytes was significantly high-er in the SCI group than in the control group in trabecular bone(6.84%vs1.98%，P<0.001).Condensation and margination of heterochromatins，the typical features of apoptosis，were obviously seen in osteocytes in SCI group.CONCLUSION Rise in apoptotic rate of osteocytes follow-ing SCI indicates that apoptosis may play a part in the patho-genesis of osteoporosis after SCI.
0 引言
细胞凋亡是指有别于细胞坏死，由基因调控的细胞有序的死亡方式.机体大部分细胞是以此种方式完成新旧细胞更替和组织更新.构成组织的细胞异常凋亡可导致肿瘤、退行性变等许多疾病的发生.近年研究表明雌激素缺乏所致的骨质疏松的发病与骨细胞的异常凋亡有关[1，2] .我们通过动物实验探讨骨细胞凋亡在脊髓损伤(spinal cord injury，SCI)后骨质疏松发病过程中的可能作用.
1 材料和方法
1.1 材料
20只12wk龄雌性SD大鼠，购自本校实验动物中心，体质量(205±15)g，随机均分为2组.脊髓损伤模型组于T10 椎体处横断脊髓，对照组仅行椎板切除术.术后3wk处死动物取双侧股骨.将股骨髁部沿矢状正中位切开，一半脱钙固定后做石蜡包埋切片，另外一半用于透射电镜观察.原位细胞凋亡检测试剂盒为华美公司产品.双能X线骨密度仪为Lunar公司生产. 1.2 方法
1.2.1 凋亡细胞的检测
采用原位DNA片段末端标记(TUNEL法)法对凋亡细胞进行染色和记数，按试剂说明进行操作.基本原理为在TdT的介导下，使生物素化的dUTP标记至DNA断裂后的3'-OH末端，借助生物素与亲和素的特异性结合，使辣根过氧化物酶连至DNA断裂点，最后加入底物.通过DAB显色，可在显微镜下观察到细胞核中棕黄着色的凋亡细胞.每例切片观察6个100倍视野(向同一方向移动切片，不重复)，记数骨细胞以及凋亡细胞总数，以平均100个骨细胞中的凋亡细胞个数作为凋亡指数(apoptosis index，AI).
1.2.2 透射电镜观察
取右股骨干骺端大小为1mm×1mm×1mm的松质骨块，4℃条件下用25mL L-1 的戊二醛固定24h，脱钙后冲洗，10mL L-1 的四氧化锇后固定，乙醇逐级脱水，环氧树脂618定向包埋后做超薄切片，经醋酸双氧铀及柠檬酸铅双重染色后，在JEM-200透射电镜下观察.
1.2.3 骨密度测定
双能X线骨密度仪小动物软件对股骨远端(股骨髁至股骨髁上)进行骨密度(bone mineral density，BMD)的测定.
统计学处理:实验数据采用SPSS统计软件进行t检验.
2 结果
2.1 骨密度测定结果 SCI组股骨远端BMD降低，与对照组比较差异显著(P<0.05，Tab1).
表1 SCI大鼠骨密度及骨细胞凋亡指数(略)
2.2 原位凋亡检测
原位凋亡的阳性细胞染色呈棕黄色，凋亡细胞记数结果显示SCI组骨细胞AI增加，与对照组比较差异非常显著(P<0.001，Tab1).
2.3 透射电镜观察
SCI组小梁骨中除了正常的骨细胞外，还可以见到处于凋亡状态的骨细胞.可见骨细胞胞膜出芽鼓涨，细胞核内异染色质的浓聚，环形边集于细胞核膜下呈现出典型凋亡细胞的特征(Fig1(略)).另外还可以见到凋亡小体的形成(Fig2(略)).正常对照组骨细胞核内以异染色质为主，细胞质及细胞器较少，陷窝内絮状物质较均匀，四周嗜锇板层清楚，轮廓光整，多处于静止相以及成骨相(Fig3(略)).
3 讨论
细胞凋亡是指在一定生理或病理条件下由基因控制的细胞有序的死亡，其过程涉及精确的基因转录和蛋白质合成.一方面它是个体发育和机体维持内环境稳定，清除过多或者有害细胞所必需的一种生理反应，另外其作为一种病理机制参与许多疾病如肿瘤、畸形、退行性疾病的发生.
骨作为一种不断重建的组织其骨量很大程度上取决于构成该组织的活性细胞数量，骨细胞数量及活性对于骨量维持有重要意义.Tomkinson等[2] 发现去势大鼠骨细胞凋亡数量较假手术组显著增加，雌激素替代治疗则可显著降低骨细胞凋亡指数，表明雌激素可以抑制骨细胞凋亡和保持骨细胞活性，雌激素缺乏可通过促进骨细胞凋亡影响骨细胞网络活性，从而降低骨对应力载荷反应性使骨脆性增加.Jilka等[3] 的研究表明PTH间断性注射增加正常或由于成骨源性缺乏所致的骨质稀少的骨量是由于抑制骨细胞和成骨细胞的凋亡所致.由此可见，骨细胞正常生存周期对于骨量维持有重要意义，骨细胞过多凋亡参与骨质疏松的发病机制.
骨质疏松是SCI后重要的并发症之一.原位凋亡方法是用于定性定量检测凋亡细胞的一种方法，结合形态学的改变可以准确地对凋亡细胞进行检测.本研究发现SCI组大鼠股骨髁部BMD下降的同时，骨细胞凋亡率明显上升，与对照组比较差异非常显著(P<0.001).骨细胞凋亡发生一般在数分钟内完成，通常在电镜下很少可以观察到典型的细胞凋亡发生.我们应用电镜观察发现SCI组大鼠松质骨骨细胞多处于退变相，还有一些细胞呈现出典型凋亡改变，如细胞核异染色质凝聚边集于核膜之下以及细胞的鼓泡、出芽等征象，对比之下，对照组骨细胞多处于静止相以及成骨相，未见具有典型凋亡特征的骨细胞.以上结果说明骨细胞凋亡增加的程度与骨密度的降低有一定的相关.
骨质疏松发生与骨组织异常改建有关，应力对于骨改建的作用主要由成骨细胞和破骨细胞来完成.骨细胞以及位于骨组织表面的成骨、破骨细胞通过骨小管相互连接组成庞大的网络系统，骨细胞在感受骨组织应变，调节网络活性中起着重要作用.骨细胞利用网样结构通过细胞间信号如cAMP或细胞外的信号分子如PGE2 ，将信号传至骨表面，激活成骨细胞、破骨细胞进行骨改建[4，5] .此外，骨细胞还可以通过感受力学刺激，产生具有合成代谢功能的细胞因子如IGF-1等以旁分泌的方式作用位于骨表面的成骨细胞[5] .一旦骨细胞凋亡增加，一方面空骨陷窝通过扩 大的骨小管互相融合形成较大的空陷窝而致骨小梁的孔隙增多与扩大，导致骨量减少和力学性能下降;另一方面维持细胞网络结构的活性细胞数量减少，从而使骨组织对应力刺激的感受降低和整个网络活性低调，因而在破骨活性增强的同时无相应的成骨代谢增强而致骨吸收-形成脱偶联，最终导致骨吸收大于骨形成而发生骨质疏松.
总之，通过骨密度测定、透射电镜观察以及原位凋亡检测，我们发现脊髓损伤后大鼠骨细胞确实发生凋亡且凋亡数量明显增加并且与局部骨密度降低有明显相关.由此提示骨细胞凋亡在脊髓损伤后骨质疏松发病中起着一定作用.由于细胞凋亡的发生有赖于特定基因的转录与蛋白质合成，因而有加以调控的可能.因此，如何从基因水平阻止或者减少骨细胞凋亡发生将可能是对脊髓损伤后骨质疏松进行有效预防和治疗的途径之一.
参考文献:
[1]Tomkinson A，Gevers EF，Wit JM，Reeve J，Noble BS.The role of estrogen in the control of rat osteocyte apoptosis [J].J Bone Miner Res，1998;13:1243-250.
[2]Tomkinson A，Reeve J，Shaw RW，Noble BS.The death of os-teocytes via apoptosis accompanies estrogen withdrawal in hu-man bone [J].J Clin Endocrinol Metab，1997;82:3128-3135.
[3]Jilka RL，Weinstein RS，Bellido T，Roberson P，Parfitt AM，Manolagas SC.Increased bone formation by prevention of os-teoblast apoptosis with parathyroid hormone [J].J Clin Invest，1999;104:439-446.
[4]Burger EH，Veldhuijzen JP.Influence of mechnical factors on bone formation，resorption and growth in vitro [M].Boca Ra-ton:CRC Press，1993:37-56.
[5]Lean JM，Jagger CJ，Chambers TJ，Chow JM.Increased in-sulin-like growth factor I mRNA expression in rat osteocytes in response to mechanical stimulation [J].Am J Physiol，1995;268:318-327.
作者简介: 李 靖(1973-)，男(汉族)，陕西省榆林市人.医师，博士生 (导师王全平).Tel.(029)2554098 Email.123791LJ@sohu.com
(第四军医大学西京医院全军骨科研究所，陕西西安710033)
编辑 黄良田
收稿日期:2001-01-09, 百拇医药(李靖，王全平，王哲，范宏斌，陶惠人)