活化抗原提呈细胞对人骨肉瘤PL┐11细胞凋亡后体外免疫原性的影响
关键词: H2 O2 ;单核细胞;凋亡;骨肉瘤
摘 要:目的 研究人骨肉瘤细胞PL-11被诱发凋亡后，体外活化的抗原提呈细胞(APC)对其免疫原性的影响. 方法 ①H2 O2 诱发PL-11凋亡的浓度和时间筛选，流式细胞仪分析.②正常献血者粗分白细胞悬液离心沉降法得人外周血单个核细胞，粘附法分离单核细胞并预激活，同时分离得混合淋巴细胞并预培养.激活单核细胞分别与凋亡细胞多次冻溶物(PL-11a)和未发生凋亡之PL-11的多次冻溶物(PL-11u)和淋巴细胞孵育7d(pl-11a组及pl-11u组)，另设单纯淋巴细胞与凋亡PL-11多次冻溶物培养组(对照组)和激活单核细胞与淋巴细胞共培养(MON组)组，计数法测量增殖.③各组培养的淋巴细胞进行体外杀伤实验(效靶比100∶1)，改良MTT(thiazolyl blue)法测量杀伤及抑制率. 结果 ①低于100nmol·L-1 H2 O 2 在7h之内均无明显诱导凋亡作用，于14h后均诱导凋亡，且存在量效差别，100nmol·L-1 处理36h最明显.②PL-11a组淋巴细胞体外增殖显著，PL-11u组仅有较弱的增殖作用，对照组和MON组均无明显增殖作用.③pl-11u组仅有较弱的淋巴细胞杀伤作用，pl-11a组则有明显的增强，而对照组及MON组均无作用. 结论 人骨肉瘤细胞在H2 O2 诱发凋亡后，如经活化APC吞噬，可显著提高其体外免疫原性而引出肿瘤杀伤效力，提示外周血中活化单核细胞处理凋亡骨肉瘤细胞将可能成为个体化的骨肿瘤疫苗方案.
Influence of activated antigen presenting cells on the immunogenicity of apoptotic human osteosarcoma cell line PL┐11
LU Chang-Wei，WANG Zhen，LI Li-Wen，PENG Lei
Institute of Orthopaedics of Chinese PLA，Xijing Hospital，Fourth Military Medical University，X'an710033，Chin
Keywords:H2 O 2 ;monocytes;apoptosis;osteosarcoma
Abstract:AIM To study the influence of actived antigen presenting cells(APC)on the in vitro immunogenicity of apoptotic human osteosarcoma PL-11.METHODS ①To select H2 O2 concentration and working time to induced apop-tosis，flow cyte meter(FCM)was implied to analyse②Pe-riphery blood mononuclear cells(PBMC)were seperated from rurally seperated white cells by density gradient cen-trifugation，and monocytes was seperated by adhesion and ac-tivated.The repeated freeze-thaw of apoptotic cells(PL-11a)and unapoptotic cells(PL-11u)were cultured with lympho-cytes and activated monocytes for7days(pl-11a group and pl-11u group)respectively.Lymphocytes with PL-11a(con-trol group)and lymphocytes with activated monoctyes(MON group)were parallelly cultured，and the proliferation of each group were counted.③Lymphocytes from each group were harvested to measure the killing ability in vitro by modified MTT(thiazolyl blue)method.RESULTS ①H2 O2 wasn't able to induce apoptosis at100nmol·L-1 concentration or lessor in7h，but could induce apoptosis after14h，especially the100nmol·L-1 after36h.②Lymphocytes of the PL-11a group increased significently，while that of the PL-11u group increased merely and the control group and MON group have no increase.③The pl-11u group showed a low cytotoxicy to osteosarcoma cells，and the pl-11a group had a significent in-crease(P<0.01).The control group and the MON group had no cytotoxity(P>0.05).CONCLUSION Induced apoptosis by H2 O2 ，human osteosarcoma cells could increase immunogenicity in vitro through the activated PBMC mono-cytes，this indicates that the activated monocytes phagocy-tosed repeated freeze-thaw of apoptotic human osteosarcoma will be a new approach for individual tumor-vaccine.
0 引言
随着现代肿瘤免疫学的发展，生物治疗已成为日益受人关注的第四种治疗常规.目前研究和应用简便而有效的免疫疫苗已经成为肿瘤免疫治疗学中的的研究热点.Herry等[1] 报道了活化抗原提呈细胞APC吞噬凋亡肿瘤细胞后可成为有效的肿瘤疫苗，并报道可以引出记忆性的CTL作用.现已证明凋亡细胞可以表达有效地为免疫系统识别的抗原[2] .本研究依据该原理分析如果将人骨肉瘤诱导凋亡并经活化的APC细胞处理，可提高肉瘤免疫原性并诱导出杀瘤能力.
1 材料和方法
1.1 材料
PL-11人骨肉瘤细胞系，西京医院全军骨科研究所自建.正常献血者粗分白细胞悬液，西京医院输血中心提供.PMA(phorbel12-myristate13-acetate)Sigma公司，rhIL-2PBH生物公司.单核细胞培养基(MC)含300mL·L-1 标准胎牛血清和IL-2及PMA培养基8mL/10mL;肌条件培养液[3] 2mL/10mL.淋巴细胞培养基(LC)含350mL·L-1 标准胎牛血清(FCS)和IL-2及PMA培养基6.0mL/10mL;肌条件培养液[3] 1.5mL/10mL;白细胞条件培养液[3] 2.5mL/10mL.日本Hitachi U2001分光光度计.
1.2 方法
1.2.1 H2 O2 凋亡浓度和时间的筛选
配置含100mL·L-1 FCS及各含10，50和100nmol·L-1 H2 O2 的RPMI1640完全培养基，处理PL-11分别为4，7和14h，高凋亡者继续处理24，36h，流式细胞仪 (FCM)测定细胞DNA含量，专用分析软件进行细胞周期和凋亡分析.
1.2.2 预处理
凋亡含量最高组以含0.2mL·L-1 EDTA之PBS离心洗涤，调节浓度为5×109 ·L-1 .取2mL反复冻溶(PL-11a)，同法未发生凋亡的H2 O2 处理组亦多次冻溶破碎，低温储存备用(PL-11u).取健康献血者粗分外周血白细胞悬液，利用淋巴细胞分离液以密度梯度离心法得人外周血单个核细胞(PBMC).粘附法分离单核细胞和淋巴细胞.单核细胞于MC中处理12h，分取加入PL-11a和PL-11u各0.5mL，孵育4h，同时分离得的淋巴细胞于LC中预培养16h.
1.2.3 混合培养
分别向与PL-11a和PL-11u共培养的单核细胞加入淋巴细胞，LC中培养，命名PL-11a和PL-11u组.另设单纯淋巴细胞与PL-11a液培养组(对照组)，单纯单核细胞与淋巴细胞培养组(MON组).各组均培养7d.取相同条件及方法，各组均另接种1×106 ，重复5组.在3，5和7d离心换液，计数5次取均值.
1.2.4 杀伤试验
预接种1×105 ·mL-1 PL-11细胞0.1mL/孔于96孔板，各组均加入1×107 ·mL-1 (LC重悬)淋巴细胞0.1mL/孔，效靶比100∶1，各组重复12孔.另留12孔不加淋巴细胞，做空白对照(Blank组).12h后PBS轻柔洗净各孔内淋巴细胞，共5次.MTT法显示各孔活细胞数目相对A值[4] ，计算杀伤抑制率(killing-suppressing rate，KSR)，各组均去除极大极小A值.KSR=(1-实验组A值/空白对照组A)×100%.
2 结果
2.1 H2 O2 诱导凋亡 含H2 O2 分别为10，50和100nmol·L-1 的RPMI1640完全培养基(150mL·L-1 FBS)于4，7h均无明显诱导凋亡作用，FCM提示未发生凋亡的PL-11细胞周期基本相似，DNA含量示G1峰前期无DNA链裂解的凋亡峰出现，G1/G2接近2∶1.而10，50和100nmol·L-1 者均可于14h后诱发凋亡(1.6%，2.3%和5.4%)，且100nmol者更为显著(5.4%)，100nmol者于24及36h诱导凋亡作用更加明显(10.2%和10.6%)，FCM图中G1峰前均出现明显超过随机变化的DNA链裂解细胞，使DNA含量测定计数图形变得失规则，G1峰前出现宽幅曲线抬高的特异性图形(Fig1).
2.2 形态观察
PBMC中单核细胞粘附法分离后在体外短时培养即被激活，形态上迅速变大，胞质清澈，边缘延展菲薄不清晰，形态大而铺展，如荷包蛋样(Fig2A).而未被激活的单核细胞生长形态比较多样，细胞多未明显铺展，胞质较少，胞质边缘较厚，折光性较好，无明显延展.部分似纤维样细胞并有细长突起(Fig2B).
、2.3 淋巴细胞体外增殖
激活单核细胞和凋亡细胞 共孵育组，淋巴细胞增殖最为显著(P<0.01)，而激活单核细胞和未凋亡细胞组有较弱的增殖(P<0.01)，单纯淋巴细胞组和单核细胞组组均无增殖，3d后细胞数量明显减少，以后则变化不大(Tab1). 2.4 体外杀伤实验 PL-11u组有较弱的杀伤作用(P<0.01)，而PL-11a杀伤作用明显提高(P<0.01)，MON组和对照组均杀伤作用(Tab2). 表1 各组淋巴细胞增殖计数结果(略)表2 杀伤实验各组吸光度(略)
3 讨论
实验中H2 O2 诱导凋亡存在一定的时效性和剂量效应，细胞凋亡的机制在于过氧化氢作用下细胞DNA链特征性断裂成片段，在DNA含量测定时可以发现均匀的梯度[2] .流式细胞仪为一种较理想的测量手段，可以特征性的发现G1期前的记数曲线抬高[5] .软件分析DNA含量图中G1峰前部分时，受设计限制对周期形态不规则者只分析有统计意义的DNA链裂解细胞其中的一部分，使凋亡峰测量值将低于实际水平，而对于无发生凋亡者则比较准确的判断出其未发生DNA链断裂，结果更为准确.
活化单核细胞吞噬凋亡细胞裂解物后，可于体外刺激淋巴细胞明显增殖，而吞噬未凋亡者则仅有较弱的增殖，余组均无诱发增殖的显著作用，说明本实验培养条件适中，无独立的非特异刺激增殖作用.凋亡细胞被APC吞噬后，激活的淋巴细胞杀伤作用明显提高9.18%(P<0.01)，而未发生凋亡者仅引发较弱的作用3.90%，其他组无杀伤作用，提示凋亡的PL-11细胞无法单独引发体外淋巴杀伤作用，激活的单核细胞起到中介凋亡细胞抗原的提呈作用，本身无独立刺激作用.但总体的杀伤效果并不显著，可能因为杀伤作用亦受HLA限制，一部分CTL特异型淋巴细胞毒性作用并未表现出来，造成杀伤作用较低.
Albert等[6] 认为只有DC树突状细胞才是提成凋亡细胞的有力提呈细胞.也存在过量凋亡细胞[7] 及延迟清除凋亡细胞[8] 可诱发DC成熟并提呈抗原的报道.但DC细胞培育费用昂贵.而Herry等研究证明激活单核细胞具备疫苗作用，提示一种较经济的新途径[1] .但目前对人骨肉瘤方面的研究仍比较欠缺.本实验在体外证明人骨肉瘤在诱发凋亡后，被活化的外周血单核巨嗜细胞吞噬可引出较强的体外免疫原性，提示活化APC细胞吞噬人骨肉瘤凋亡产物后可提高低免疫原性肿瘤的抗原性.尽管有外周血单核细胞引出成熟DC细胞[9] 和PMA诱发CD34+ 前体造血细胞DC转化[10] 的报道.但外周血中的活化单核/巨嗜细胞本身就是一种具备中度抗原提呈功能的APC细胞[11] ，实验中活化APC孵育后形态始终无典型树突状构型，培养条件也不支持DC转化[9，10] ，因而进一步支持PMBC中单核细胞可成为有效凋亡细胞抗原提成细胞的可能.
提高实用性和个体化是肿瘤疫苗突出的方向，DC细胞疫苗和基因疫苗均复杂操作，周期长且费用昂贵.单链抗体[12，13] 及巨嗜细胞融合瘤[14] 探讨新的免疫治疗手段，已开始引起重视.我们发现人骨肉瘤在诱发凋亡后外周血中的APC可提高弱免疫原性肿瘤的抗原性，对可能的临床实验进行有益的前期实验.实验中H2 O2 为无毒产物，生理条件下也可有产生并可自动清除，比较安全.PMA作为低毒致癌物质，实验中用量较低且多次洗涤可去处.在后续研究中改进条件，进一步探讨在类似本实验条件下，利用质脂体包裹IL-2和LC条件培养基中的刺激因子，人工改变局部的免疫微环境，辅以凋亡自体骨肉瘤和活化APC细胞，将可能成为有效的个体化肿瘤主动免疫治疗新思路.
参考文献:
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基金项目: 国家自然科学基金资助(39770749)
作者简介: 吕昌伟(1976-)，男(汉族)，辽宁省沈阳市人.硕士生(导师王 臻).Tel.(029)3375290 Email.lvcwei@sohu.com
(第四军医大学西京医院全军骨科研究所，陕西西安710033)
编辑 黄良田
收稿日期:2001-01-09, http://www.100md.com(吕昌伟，王臻，李立文，彭磊)
摘 要:目的 研究人骨肉瘤细胞PL-11被诱发凋亡后，体外活化的抗原提呈细胞(APC)对其免疫原性的影响. 方法 ①H2 O2 诱发PL-11凋亡的浓度和时间筛选，流式细胞仪分析.②正常献血者粗分白细胞悬液离心沉降法得人外周血单个核细胞，粘附法分离单核细胞并预激活，同时分离得混合淋巴细胞并预培养.激活单核细胞分别与凋亡细胞多次冻溶物(PL-11a)和未发生凋亡之PL-11的多次冻溶物(PL-11u)和淋巴细胞孵育7d(pl-11a组及pl-11u组)，另设单纯淋巴细胞与凋亡PL-11多次冻溶物培养组(对照组)和激活单核细胞与淋巴细胞共培养(MON组)组，计数法测量增殖.③各组培养的淋巴细胞进行体外杀伤实验(效靶比100∶1)，改良MTT(thiazolyl blue)法测量杀伤及抑制率. 结果 ①低于100nmol·L-1 H2 O 2 在7h之内均无明显诱导凋亡作用，于14h后均诱导凋亡，且存在量效差别，100nmol·L-1 处理36h最明显.②PL-11a组淋巴细胞体外增殖显著，PL-11u组仅有较弱的增殖作用，对照组和MON组均无明显增殖作用.③pl-11u组仅有较弱的淋巴细胞杀伤作用，pl-11a组则有明显的增强，而对照组及MON组均无作用. 结论 人骨肉瘤细胞在H2 O2 诱发凋亡后，如经活化APC吞噬，可显著提高其体外免疫原性而引出肿瘤杀伤效力，提示外周血中活化单核细胞处理凋亡骨肉瘤细胞将可能成为个体化的骨肿瘤疫苗方案.
Influence of activated antigen presenting cells on the immunogenicity of apoptotic human osteosarcoma cell line PL┐11
LU Chang-Wei，WANG Zhen，LI Li-Wen，PENG Lei
Institute of Orthopaedics of Chinese PLA，Xijing Hospital，Fourth Military Medical University，X'an710033，Chin
Keywords:H2 O 2 ;monocytes;apoptosis;osteosarcoma
Abstract:AIM To study the influence of actived antigen presenting cells(APC)on the in vitro immunogenicity of apoptotic human osteosarcoma PL-11.METHODS ①To select H2 O2 concentration and working time to induced apop-tosis，flow cyte meter(FCM)was implied to analyse②Pe-riphery blood mononuclear cells(PBMC)were seperated from rurally seperated white cells by density gradient cen-trifugation，and monocytes was seperated by adhesion and ac-tivated.The repeated freeze-thaw of apoptotic cells(PL-11a)and unapoptotic cells(PL-11u)were cultured with lympho-cytes and activated monocytes for7days(pl-11a group and pl-11u group)respectively.Lymphocytes with PL-11a(con-trol group)and lymphocytes with activated monoctyes(MON group)were parallelly cultured，and the proliferation of each group were counted.③Lymphocytes from each group were harvested to measure the killing ability in vitro by modified MTT(thiazolyl blue)method.RESULTS ①H2 O2 wasn't able to induce apoptosis at100nmol·L-1 concentration or lessor in7h，but could induce apoptosis after14h，especially the100nmol·L-1 after36h.②Lymphocytes of the PL-11a group increased significently，while that of the PL-11u group increased merely and the control group and MON group have no increase.③The pl-11u group showed a low cytotoxicy to osteosarcoma cells，and the pl-11a group had a significent in-crease(P<0.01).The control group and the MON group had no cytotoxity(P>0.05).CONCLUSION Induced apoptosis by H2 O2 ，human osteosarcoma cells could increase immunogenicity in vitro through the activated PBMC mono-cytes，this indicates that the activated monocytes phagocy-tosed repeated freeze-thaw of apoptotic human osteosarcoma will be a new approach for individual tumor-vaccine.
0 引言
随着现代肿瘤免疫学的发展，生物治疗已成为日益受人关注的第四种治疗常规.目前研究和应用简便而有效的免疫疫苗已经成为肿瘤免疫治疗学中的的研究热点.Herry等[1] 报道了活化抗原提呈细胞APC吞噬凋亡肿瘤细胞后可成为有效的肿瘤疫苗，并报道可以引出记忆性的CTL作用.现已证明凋亡细胞可以表达有效地为免疫系统识别的抗原[2] .本研究依据该原理分析如果将人骨肉瘤诱导凋亡并经活化的APC细胞处理，可提高肉瘤免疫原性并诱导出杀瘤能力.
1 材料和方法
1.1 材料
PL-11人骨肉瘤细胞系，西京医院全军骨科研究所自建.正常献血者粗分白细胞悬液，西京医院输血中心提供.PMA(phorbel12-myristate13-acetate)Sigma公司，rhIL-2PBH生物公司.单核细胞培养基(MC)含300mL·L-1 标准胎牛血清和IL-2及PMA培养基8mL/10mL;肌条件培养液[3] 2mL/10mL.淋巴细胞培养基(LC)含350mL·L-1 标准胎牛血清(FCS)和IL-2及PMA培养基6.0mL/10mL;肌条件培养液[3] 1.5mL/10mL;白细胞条件培养液[3] 2.5mL/10mL.日本Hitachi U2001分光光度计.
1.2 方法
1.2.1 H2 O2 凋亡浓度和时间的筛选
配置含100mL·L-1 FCS及各含10，50和100nmol·L-1 H2 O2 的RPMI1640完全培养基，处理PL-11分别为4，7和14h，高凋亡者继续处理24，36h，流式细胞仪 (FCM)测定细胞DNA含量，专用分析软件进行细胞周期和凋亡分析.
1.2.2 预处理
凋亡含量最高组以含0.2mL·L-1 EDTA之PBS离心洗涤，调节浓度为5×109 ·L-1 .取2mL反复冻溶(PL-11a)，同法未发生凋亡的H2 O2 处理组亦多次冻溶破碎，低温储存备用(PL-11u).取健康献血者粗分外周血白细胞悬液，利用淋巴细胞分离液以密度梯度离心法得人外周血单个核细胞(PBMC).粘附法分离单核细胞和淋巴细胞.单核细胞于MC中处理12h，分取加入PL-11a和PL-11u各0.5mL，孵育4h，同时分离得的淋巴细胞于LC中预培养16h.
1.2.3 混合培养
分别向与PL-11a和PL-11u共培养的单核细胞加入淋巴细胞，LC中培养，命名PL-11a和PL-11u组.另设单纯淋巴细胞与PL-11a液培养组(对照组)，单纯单核细胞与淋巴细胞培养组(MON组).各组均培养7d.取相同条件及方法，各组均另接种1×106 ，重复5组.在3，5和7d离心换液，计数5次取均值.
1.2.4 杀伤试验
预接种1×105 ·mL-1 PL-11细胞0.1mL/孔于96孔板，各组均加入1×107 ·mL-1 (LC重悬)淋巴细胞0.1mL/孔，效靶比100∶1，各组重复12孔.另留12孔不加淋巴细胞，做空白对照(Blank组).12h后PBS轻柔洗净各孔内淋巴细胞，共5次.MTT法显示各孔活细胞数目相对A值[4] ，计算杀伤抑制率(killing-suppressing rate，KSR)，各组均去除极大极小A值.KSR=(1-实验组A值/空白对照组A)×100%.
2 结果
2.1 H2 O2 诱导凋亡 含H2 O2 分别为10，50和100nmol·L-1 的RPMI1640完全培养基(150mL·L-1 FBS)于4，7h均无明显诱导凋亡作用，FCM提示未发生凋亡的PL-11细胞周期基本相似，DNA含量示G1峰前期无DNA链裂解的凋亡峰出现，G1/G2接近2∶1.而10，50和100nmol·L-1 者均可于14h后诱发凋亡(1.6%，2.3%和5.4%)，且100nmol者更为显著(5.4%)，100nmol者于24及36h诱导凋亡作用更加明显(10.2%和10.6%)，FCM图中G1峰前均出现明显超过随机变化的DNA链裂解细胞，使DNA含量测定计数图形变得失规则，G1峰前出现宽幅曲线抬高的特异性图形(Fig1).
2.2 形态观察
PBMC中单核细胞粘附法分离后在体外短时培养即被激活，形态上迅速变大，胞质清澈，边缘延展菲薄不清晰，形态大而铺展，如荷包蛋样(Fig2A).而未被激活的单核细胞生长形态比较多样，细胞多未明显铺展，胞质较少，胞质边缘较厚，折光性较好，无明显延展.部分似纤维样细胞并有细长突起(Fig2B).
、2.3 淋巴细胞体外增殖
激活单核细胞和凋亡细胞 共孵育组，淋巴细胞增殖最为显著(P<0.01)，而激活单核细胞和未凋亡细胞组有较弱的增殖(P<0.01)，单纯淋巴细胞组和单核细胞组组均无增殖，3d后细胞数量明显减少，以后则变化不大(Tab1). 2.4 体外杀伤实验 PL-11u组有较弱的杀伤作用(P<0.01)，而PL-11a杀伤作用明显提高(P<0.01)，MON组和对照组均杀伤作用(Tab2). 表1 各组淋巴细胞增殖计数结果(略)表2 杀伤实验各组吸光度(略)
3 讨论
实验中H2 O2 诱导凋亡存在一定的时效性和剂量效应，细胞凋亡的机制在于过氧化氢作用下细胞DNA链特征性断裂成片段，在DNA含量测定时可以发现均匀的梯度[2] .流式细胞仪为一种较理想的测量手段，可以特征性的发现G1期前的记数曲线抬高[5] .软件分析DNA含量图中G1峰前部分时，受设计限制对周期形态不规则者只分析有统计意义的DNA链裂解细胞其中的一部分，使凋亡峰测量值将低于实际水平，而对于无发生凋亡者则比较准确的判断出其未发生DNA链断裂，结果更为准确.
活化单核细胞吞噬凋亡细胞裂解物后，可于体外刺激淋巴细胞明显增殖，而吞噬未凋亡者则仅有较弱的增殖，余组均无诱发增殖的显著作用，说明本实验培养条件适中，无独立的非特异刺激增殖作用.凋亡细胞被APC吞噬后，激活的淋巴细胞杀伤作用明显提高9.18%(P<0.01)，而未发生凋亡者仅引发较弱的作用3.90%，其他组无杀伤作用，提示凋亡的PL-11细胞无法单独引发体外淋巴杀伤作用，激活的单核细胞起到中介凋亡细胞抗原的提呈作用，本身无独立刺激作用.但总体的杀伤效果并不显著，可能因为杀伤作用亦受HLA限制，一部分CTL特异型淋巴细胞毒性作用并未表现出来，造成杀伤作用较低.
Albert等[6] 认为只有DC树突状细胞才是提成凋亡细胞的有力提呈细胞.也存在过量凋亡细胞[7] 及延迟清除凋亡细胞[8] 可诱发DC成熟并提呈抗原的报道.但DC细胞培育费用昂贵.而Herry等研究证明激活单核细胞具备疫苗作用，提示一种较经济的新途径[1] .但目前对人骨肉瘤方面的研究仍比较欠缺.本实验在体外证明人骨肉瘤在诱发凋亡后，被活化的外周血单核巨嗜细胞吞噬可引出较强的体外免疫原性，提示活化APC细胞吞噬人骨肉瘤凋亡产物后可提高低免疫原性肿瘤的抗原性.尽管有外周血单核细胞引出成熟DC细胞[9] 和PMA诱发CD34+ 前体造血细胞DC转化[10] 的报道.但外周血中的活化单核/巨嗜细胞本身就是一种具备中度抗原提呈功能的APC细胞[11] ，实验中活化APC孵育后形态始终无典型树突状构型，培养条件也不支持DC转化[9，10] ，因而进一步支持PMBC中单核细胞可成为有效凋亡细胞抗原提成细胞的可能.
提高实用性和个体化是肿瘤疫苗突出的方向，DC细胞疫苗和基因疫苗均复杂操作，周期长且费用昂贵.单链抗体[12，13] 及巨嗜细胞融合瘤[14] 探讨新的免疫治疗手段，已开始引起重视.我们发现人骨肉瘤在诱发凋亡后外周血中的APC可提高弱免疫原性肿瘤的抗原性，对可能的临床实验进行有益的前期实验.实验中H2 O2 为无毒产物，生理条件下也可有产生并可自动清除，比较安全.PMA作为低毒致癌物质，实验中用量较低且多次洗涤可去处.在后续研究中改进条件，进一步探讨在类似本实验条件下，利用质脂体包裹IL-2和LC条件培养基中的刺激因子，人工改变局部的免疫微环境，辅以凋亡自体骨肉瘤和活化APC细胞，将可能成为有效的个体化肿瘤主动免疫治疗新思路.
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基金项目: 国家自然科学基金资助(39770749)
作者简介: 吕昌伟(1976-)，男(汉族)，辽宁省沈阳市人.硕士生(导师王 臻).Tel.(029)3375290 Email.lvcwei@sohu.com
(第四军医大学西京医院全军骨科研究所，陕西西安710033)
编辑 黄良田
收稿日期:2001-01-09, http://www.100md.com(吕昌伟，王臻，李立文，彭磊)