日本脑炎病毒糖蛋白模拟短肽的筛选和基因定位
关键词: 脑炎病毒，日本;抗体，单克隆;噬菌体;肽库;表位
摘 要:目的 寻找JEV mAb2F2识别的抗原表位，为JEV小分子多肽疫苗合理设计提供依据. 方法 链亲和素包被塑料平皿，加入生物素标记2F2与噬菌体随机15肽库，再洗脱，扩大培养进行三轮淘筛，经夹心ELISA、竞争ELISA鉴定后，挑取10个阳性克隆，DNA测序，与JEV E蛋白同源分析. 结果 筛选到的噬菌体能特异地与2F2结合，并且这种结合可被天然抗原所抑制.10个克隆的氨基酸序列相同:-HTPQWSP-SQYRPSLR-，同源分析在JEV E蛋白224～229aa得到一个同源性较高的序列:PXXSPS. 结论 PXXSPS可能为JEV E蛋白的一个模拟表位.
Mapping and identifing of mimetic oligo┐peptide of JEV glycoprotein from phage random peptide li-brary
REN Jun-Ping，MA Wen-Yu，YANG Qiao-Xin，XIAO Yi，Ding Tian-Bing，LI Zhi-Dong
Department of Microbiology，Faculty of Preclinical Medicine，Fourth Military Medical University，Xi'an710033，China
Keywords:encephalitis virus，Japanese;antibodies，mono-clonal;bacterio phages;peptide library;epitopes
Abstract:AIM To screen the epitope of Japanese encephali-tis virus(JEV)mAb2F2in order to assist in the design of the peptide vaccine against JEV.METHODS The plasmid dish with SV was coated，the biotinylated2F2and15-mer peptide library were added，and the binding phage was eluted and then amplified.After three rounds biopanning，the posi-tive clones were identificated by sandwich ELISA，competi-tion ELISA and DNA sequencing.Amino acid sequences of10positive clones were compared with the JEV E protein.RESULTS Short peptide displayed on phage specifically was
bound to2F2and the binding was inhibited by natural JEV Ag.Amino acid sequences of10positive clones were consen-sus:-HTPQWSPSQYRPSLR-.By homology analysis，one higher homologous sequences were found in JEV E protein224～229aa:PXXSPS.CONCLUSION PXXSPS might be a minotope of JEV E protein.
0 引言
日本脑炎病毒(Japanese encephalitis virus，JEV)引起的流行性乙型脑炎(乙脑)，是一种严重的急性中枢神经系统传染病，主要在东南亚等地区流行.采用疫苗进行预防接种是控制该病流行的有效措施.目前国内外使用的乙脑疫苗尚不理想，如出现不良反应和有毒力逆转的可能性，乙脑新型疫苗研制势在必行.但对JEV抗原表位认识的不足影响了乙脑新型疫苗的研制.噬菌体表面呈现技术(phage display)和随机肽库技术(random peptide library，RPL)提供了深入研究病毒抗原表位的可能[1] .JEV囊膜糖蛋白E是病毒表面主要的结构蛋白与诱导保护性免疫的主要成分[2] .本实验用高中和活性抗JEV E蛋白的鼠mAb2F2淘筛噬菌体随机15肽库，以期找出这株mAb识别的抗原表位，为JEV小分子多肽疫苗合理设计提供依据.
1 材料和方法
1.1 材料
1.1.1 X15(15肽库) 由Australia的Yip YL教授惠赠，随机多样性1.3×109 ，测序引物5'-CTGAA-GAGAGTCAAAAGC-3'，宿主菌K91kana.
1.1.2 链霉亲和素(SV)和生物素酯(NHS-biotin) 购自Sigma公司.
1.1.3 HRP-anti M13mAb 为Pharmacia产品.
1.1.4 噬菌体单链DNA提取试剂盒 为上海华舜公司产品.
1.1.5 抗原 纯化的JEV鼠脑抗原(JEV Ag)及正常鼠脑抗原为本室制备[3] .
1.2 方法
1.2.1 mAb的纯化和标记 抗JEV E蛋白的鼠mAb2F2为本室制备[4] ，具有种特异性及高中和活性，IgG2a类.常规方法制备单抗腹水，辛酸-硫酸铵法提取IgG，经DEAE-Sepharose FF离子交换柱纯化后标记生物素.
1.2.2 淘筛噬菌体随机肽库 SV包被35mm塑料平皿，BSA封闭后，TBST振洗6次，同时生物素标记mAb与肽库4℃反应过夜，加入平皿.室温轻摇10min，TBST振洗10次，加入甘氨酸-盐酸(pH2.2)洗脱液，室温轻摇10min，收集洗脱液，加1mol Tris-HCl(pH9.1)中和，测定洗脱物噬菌体滴度，计算投入产出比，扩增噬菌体并测滴度，取一半用于下一轮淘筛[5] .按上述方法淘筛三轮，各轮mAb用量分别为15μg，1.5μg，0.2μg.
1.2.3 夹心ELISA检测噬菌体 2F2(100mg L-1 )包被酶标板，BSA封闭后，加入第三轮淘筛扩增的噬菌体及阴性对照15肽库，1010 TU/孔，室温振摇1h，加HRP-anti M13mAb，室温振摇1h，OPD显色，测A490nm 值.包被时设无关mAb，分别为2H4，CHA9，A4，及无关蛋白BSA和SV，包被浓度均为100mg L-1 .
1.2.4 竞争ELISA检测噬菌体 2F2(100mg L-1 )包被酶标板，BSA封闭，不同浓度JEV Ag与第三轮淘筛扩增的噬菌体(1010 TU)混合物加入包被孔内，室温振摇1h，加HRP-anti M13mAb，室温振摇1h，OPD显色，测A
490nm 值.另外，阴性对照为不同浓度正常鼠脑抗原与第三轮淘筛扩增噬菌体(1010 TU)混合物，阳性对照为第三轮淘筛扩增的噬菌体(1010 TU).
1.2.5 挑选噬菌体阳性克隆及DNA序列测定 第三轮淘筛的洗脱物感染宿主菌，铺平板，随机挑取20个克隆，扩大培养并测滴度，用上述夹心ELISA方法检测20个克隆与2F2的结合特性.挑选10个阳性克隆，扩增收集上清提取单链DNA(按试剂盒说明操作)，自动测序.
1.2.6 同源分析 利用计算机软件DNA Club，将测序结果与JEV E蛋白进行同源分析.
2 结果
2.1 淘筛肽库 对三轮淘筛的投入产出比进行了比较(Tab1)，后两轮的投入产出比均高于前一轮，而第三轮高于第一轮约100倍，说明了富集效果良好.
2.2 夹心ELISA结果 第三轮筛选到的噬菌体与包被2F2反应的A490nm 值高于其与无关mAb及无关蛋白反应的A490nm 值2倍以上，而且远大于阴性对照15肽库与2F2反应的A490nm 值，另外无关mAb与筛选 到的噬菌体及15肽库反应的A490nm 均小于0.1，说明第三轮筛选到的噬菌体能够特异地与2F2结合(Fig1).
表1 每一轮淘筛投入产出比 略
图1 略
2.3 竞争ELISA结果 根据A490nm 值，计算竞争抑制百分率，绘制竞争曲线(Fig2).竞争抑制百分率=(阳性孔A值-被抑制孔A值)/阳性孔A值×100%.从Fig2可以看出，正常鼠脑抗原对筛选到的噬菌体与2F2的结合几乎无竞争抑制作用，而JEV Ag对二者的结合有竞争抑制作用，竞争抑制率高达86%.
图2 略
2.4 噬菌体阳性克隆测序结果与分析 10个阳性噬菌体克隆展示外源肽的序列完全一致:-HTPQWSP-SQYRPSLR-.将此氨基酸序列与JEV E蛋白序列进行同源性分析，在E蛋白224-229aa有一个同源性较高的序列PXXSPS(Fig3).
图3 略
3 讨论
RPL技术自1985年建立以来，在研究分子间相互识别，如抗原-抗体、配体-受体、酶-底物等诸多领域已显示出独特的优势.蛋白质抗原表位(epitope)分析是研究抗原分子的结构和功能、抗原-抗体反应的识别机制的基础.在医学研究中，可为亚单位疫苗或多肽疫苗研制、药物筛选以及特异血清学诊断方法的建立提供重要的线索和依据.用mAb淘筛噬菌体随机肽库，已成功地分析了多种蛋白质的抗原表位[6] .本实验室的杨乔欣等[7] 用单纯疱疹病毒Ⅰ型(HSV-Ⅰ)mAb从噬菌体随机12肽库中筛选到的模拟短肽，经鉴定表现出良好的抗原性，可能为HSV-Ⅰ糖蛋白gC的一个模拟表位.白雪帆等[8，9] 应用RPL技术研究汉坦病毒核蛋白抗原表位，确定了与mAb反应的最小抗原多肽.本研究中夹心ELISA和竞争ELISA结果说明了经过三轮亲和淘筛得到的噬菌体能够特异地与mAb2F2单抗结合，并且这种结合可被天然抗原所抑制，竞争抑制率高达86%.由此推测筛选到的噬菌体递呈了能与mAb2F2决定簇互补区(CDR)相结合的短肽，短肽上可能具有mAb2F2识别的表位.
早期利用RPL技术所进行的表位研究，主要是分析蛋白质的线性表位.但是新近的研究表明，噬菌体表达的线性多肽也可以模拟大分子抗原空间依赖性表位，引起特异性的强免疫反应，尽管二者的氨基酸顺序可能完全不同，这就是所谓的模拟表位[10] .我们淘筛到的噬菌体短肽具有和mAb2F2特异结合的功能，但并不和JEV E蛋白完全同源，并且以往的研究表明2F2很可能是一个抗空间表位的抗体，因此同源分析得到的序列PXXSPS可能是JEV E蛋白的一个模拟表位.
JEV囊膜糖蛋白E具有多种生物学特性，与病毒的致病性和组织亲嗜性密切相关.E蛋白含有B细胞和T辅助细胞的表位.Mason等[2] 的研究表明，JEV中和表位大多集中在E蛋白空间结构复杂的区域，即短至95个氨基酸(303～396aa)的肽段.Strias-tava等11] 的研究说明在E蛋白末端的1/3区域存在着线性的表位.而Seif等[12] 的研究进一步定位出在E蛋白373～399aa这一只有27个氨基酸的区域存在着线性中和表位.上述研究结果虽然初步定位了E蛋白的一些抗原表位，但由于研究技术的限制，均未能准确地测定出表位的大小和组成.
对本实验结果进行深入研究可以从分子水平上加深对JEV E蛋白中和表位的认识，从而为JEV小 分子多肽疫苗的合理设计提供策略.另外，本实验中ELISA结果显示了筛选到的噬菌体短肽具有较好的抗原特异性，为设计以小分子多肽替代JEV Ag作为诊断试剂提供了有益的线索.
参考文献:
[1]Smith GP，Petrenko VA.Phage display [J].Chem Rev，1997;97(2):391-410.
[2]Mason PW，Dalrymple JM，Gentry MK，Mccown JM，Hoke CH，Burke DS，Fournier MJ，Mason TL.Molecular characteri-zation of a neutralizing domain of the Japanese encephalitis virus structrual glycoprotein [J].J Gen Virol，1989;70(8):2037-2049.
[3]Ma WY，Yu BY，Jiang SC.The research of concentrating and purifing the Japanese encephalitis virus from infected mouse brain [J].Di-si Junyi Daxue Xuebao(J Fourth Mil Med Univ)，1984;5(4):251-254.
[4]Zhang MJ，Wang MX，Jiang SZ，Xiu ZZ，Ma WY.Preparation and characterization of the monoclonal antibodies against Japanese encephalitis virus [J].Acta Virol，1992;36(6):533-540.
[5]Parmley SF，Smith GP.Antibody-selectable filamentous fd phage vectors:Affinity purification of target genes [J].Gene，1988;73(2):305-318.
[6]Du Y，Wang HT.The application of phage display peptide li-brary in protein epitope analysis [review][J].Guowai Yixue Mianyixue Fence(Foreign Med Sci Immunol)，1998;21(2):103-107.
[7]Yang QX，Ma WY，YY.The study of memitic oligo-peptide of HSV giycoprotein screening from phage random peptide library [J].Xibao Yu Fenzi Mianyixue Zazhi(J Cell Mol Immunol)，2000;16(6):464-466.
[8]Bai XF，Huang CX，Wang Y，Pan L，Yang WS.The recogni-tion and mapping of epitopes of Hantaan virus nucleocapsid pro-tein N-terminal by phage peptide library [J].Di-si Junyi Daxue Xuebao(J Fourth Mil Med Univ)，1998;19(6):709-710.
[9]Bai XF，Zhang Y，Wang Y，Pan L，Fack F，EKF Bautz.Fine mapping of epitopes of Hantaan virus nucleocapsid protein by peptide scanning [J].Di-si Junyi Daxue Xuebao(J Fourth Mil Med Univ)，2000;21(7):850-852.
[10]Oldenburg KR，Loganathan D，Goldstein IJ，Schultz PG，Gal-lop MA.Peptide Ligands for a sugar-binding protein isolated fome a random peptide library [J].Proc Natl Acad Sci USA，1992;89(12):5393-5397.
[11]Striastava AK，Morita K，Matsuo S，Tanaka M，Igarashi A.Japanese encephalitis virus fusion protein expressed in Es-cherichia coli cdnfers protective immunity in mice [J].Microbiol Immunol，1991;35(10):863-870.
[12]Seif SA，Morita K，Matsuo S，Hasebe F，Igarashi A.Finer mapping of neutralizing epitope(s)on the C-terminal of Japanese encephalitis virus E-protein expressed in recombinant Escherichia coli system [J ].Vaccine，1995;13(16):1515-1521.
编辑 甄志强
第四军医大学基础部微生物学教研室，陕西西安710033
基金项目: 全军医药卫生科研基金资助项目(98M102)
作者简介: 任君萍(1972-)，女(汉族)，陕西省扶风县人.硕士(导师马文煜).Tel.(029)3374526, 百拇医药(任君萍 马文煜 杨乔欣 肖毅 丁天兵 黎志东)
摘 要:目的 寻找JEV mAb2F2识别的抗原表位，为JEV小分子多肽疫苗合理设计提供依据. 方法 链亲和素包被塑料平皿，加入生物素标记2F2与噬菌体随机15肽库，再洗脱，扩大培养进行三轮淘筛，经夹心ELISA、竞争ELISA鉴定后，挑取10个阳性克隆，DNA测序，与JEV E蛋白同源分析. 结果 筛选到的噬菌体能特异地与2F2结合，并且这种结合可被天然抗原所抑制.10个克隆的氨基酸序列相同:-HTPQWSP-SQYRPSLR-，同源分析在JEV E蛋白224～229aa得到一个同源性较高的序列:PXXSPS. 结论 PXXSPS可能为JEV E蛋白的一个模拟表位.
Mapping and identifing of mimetic oligo┐peptide of JEV glycoprotein from phage random peptide li-brary
REN Jun-Ping，MA Wen-Yu，YANG Qiao-Xin，XIAO Yi，Ding Tian-Bing，LI Zhi-Dong
Department of Microbiology，Faculty of Preclinical Medicine，Fourth Military Medical University，Xi'an710033，China
Keywords:encephalitis virus，Japanese;antibodies，mono-clonal;bacterio phages;peptide library;epitopes
Abstract:AIM To screen the epitope of Japanese encephali-tis virus(JEV)mAb2F2in order to assist in the design of the peptide vaccine against JEV.METHODS The plasmid dish with SV was coated，the biotinylated2F2and15-mer peptide library were added，and the binding phage was eluted and then amplified.After three rounds biopanning，the posi-tive clones were identificated by sandwich ELISA，competi-tion ELISA and DNA sequencing.Amino acid sequences of10positive clones were compared with the JEV E protein.RESULTS Short peptide displayed on phage specifically was
bound to2F2and the binding was inhibited by natural JEV Ag.Amino acid sequences of10positive clones were consen-sus:-HTPQWSPSQYRPSLR-.By homology analysis，one higher homologous sequences were found in JEV E protein224～229aa:PXXSPS.CONCLUSION PXXSPS might be a minotope of JEV E protein.
0 引言
日本脑炎病毒(Japanese encephalitis virus，JEV)引起的流行性乙型脑炎(乙脑)，是一种严重的急性中枢神经系统传染病，主要在东南亚等地区流行.采用疫苗进行预防接种是控制该病流行的有效措施.目前国内外使用的乙脑疫苗尚不理想，如出现不良反应和有毒力逆转的可能性，乙脑新型疫苗研制势在必行.但对JEV抗原表位认识的不足影响了乙脑新型疫苗的研制.噬菌体表面呈现技术(phage display)和随机肽库技术(random peptide library，RPL)提供了深入研究病毒抗原表位的可能[1] .JEV囊膜糖蛋白E是病毒表面主要的结构蛋白与诱导保护性免疫的主要成分[2] .本实验用高中和活性抗JEV E蛋白的鼠mAb2F2淘筛噬菌体随机15肽库，以期找出这株mAb识别的抗原表位，为JEV小分子多肽疫苗合理设计提供依据.
1 材料和方法
1.1 材料
1.1.1 X15(15肽库) 由Australia的Yip YL教授惠赠，随机多样性1.3×109 ，测序引物5'-CTGAA-GAGAGTCAAAAGC-3'，宿主菌K91kana.
1.1.2 链霉亲和素(SV)和生物素酯(NHS-biotin) 购自Sigma公司.
1.1.3 HRP-anti M13mAb 为Pharmacia产品.
1.1.4 噬菌体单链DNA提取试剂盒 为上海华舜公司产品.
1.1.5 抗原 纯化的JEV鼠脑抗原(JEV Ag)及正常鼠脑抗原为本室制备[3] .
1.2 方法
1.2.1 mAb的纯化和标记 抗JEV E蛋白的鼠mAb2F2为本室制备[4] ，具有种特异性及高中和活性，IgG2a类.常规方法制备单抗腹水，辛酸-硫酸铵法提取IgG，经DEAE-Sepharose FF离子交换柱纯化后标记生物素.
1.2.2 淘筛噬菌体随机肽库 SV包被35mm塑料平皿，BSA封闭后，TBST振洗6次，同时生物素标记mAb与肽库4℃反应过夜，加入平皿.室温轻摇10min，TBST振洗10次，加入甘氨酸-盐酸(pH2.2)洗脱液，室温轻摇10min，收集洗脱液，加1mol Tris-HCl(pH9.1)中和，测定洗脱物噬菌体滴度，计算投入产出比，扩增噬菌体并测滴度，取一半用于下一轮淘筛[5] .按上述方法淘筛三轮，各轮mAb用量分别为15μg，1.5μg，0.2μg.
1.2.3 夹心ELISA检测噬菌体 2F2(100mg L-1 )包被酶标板，BSA封闭后，加入第三轮淘筛扩增的噬菌体及阴性对照15肽库，1010 TU/孔，室温振摇1h，加HRP-anti M13mAb，室温振摇1h，OPD显色，测A490nm 值.包被时设无关mAb，分别为2H4，CHA9，A4，及无关蛋白BSA和SV，包被浓度均为100mg L-1 .
1.2.4 竞争ELISA检测噬菌体 2F2(100mg L-1 )包被酶标板，BSA封闭，不同浓度JEV Ag与第三轮淘筛扩增的噬菌体(1010 TU)混合物加入包被孔内，室温振摇1h，加HRP-anti M13mAb，室温振摇1h，OPD显色，测A
490nm 值.另外，阴性对照为不同浓度正常鼠脑抗原与第三轮淘筛扩增噬菌体(1010 TU)混合物，阳性对照为第三轮淘筛扩增的噬菌体(1010 TU).
1.2.5 挑选噬菌体阳性克隆及DNA序列测定 第三轮淘筛的洗脱物感染宿主菌，铺平板，随机挑取20个克隆，扩大培养并测滴度，用上述夹心ELISA方法检测20个克隆与2F2的结合特性.挑选10个阳性克隆，扩增收集上清提取单链DNA(按试剂盒说明操作)，自动测序.
1.2.6 同源分析 利用计算机软件DNA Club，将测序结果与JEV E蛋白进行同源分析.
2 结果
2.1 淘筛肽库 对三轮淘筛的投入产出比进行了比较(Tab1)，后两轮的投入产出比均高于前一轮，而第三轮高于第一轮约100倍，说明了富集效果良好.
2.2 夹心ELISA结果 第三轮筛选到的噬菌体与包被2F2反应的A490nm 值高于其与无关mAb及无关蛋白反应的A490nm 值2倍以上，而且远大于阴性对照15肽库与2F2反应的A490nm 值，另外无关mAb与筛选 到的噬菌体及15肽库反应的A490nm 均小于0.1，说明第三轮筛选到的噬菌体能够特异地与2F2结合(Fig1).
表1 每一轮淘筛投入产出比 略
图1 略
2.3 竞争ELISA结果 根据A490nm 值，计算竞争抑制百分率，绘制竞争曲线(Fig2).竞争抑制百分率=(阳性孔A值-被抑制孔A值)/阳性孔A值×100%.从Fig2可以看出，正常鼠脑抗原对筛选到的噬菌体与2F2的结合几乎无竞争抑制作用，而JEV Ag对二者的结合有竞争抑制作用，竞争抑制率高达86%.
图2 略
2.4 噬菌体阳性克隆测序结果与分析 10个阳性噬菌体克隆展示外源肽的序列完全一致:-HTPQWSP-SQYRPSLR-.将此氨基酸序列与JEV E蛋白序列进行同源性分析，在E蛋白224-229aa有一个同源性较高的序列PXXSPS(Fig3).
图3 略
3 讨论
RPL技术自1985年建立以来，在研究分子间相互识别，如抗原-抗体、配体-受体、酶-底物等诸多领域已显示出独特的优势.蛋白质抗原表位(epitope)分析是研究抗原分子的结构和功能、抗原-抗体反应的识别机制的基础.在医学研究中，可为亚单位疫苗或多肽疫苗研制、药物筛选以及特异血清学诊断方法的建立提供重要的线索和依据.用mAb淘筛噬菌体随机肽库，已成功地分析了多种蛋白质的抗原表位[6] .本实验室的杨乔欣等[7] 用单纯疱疹病毒Ⅰ型(HSV-Ⅰ)mAb从噬菌体随机12肽库中筛选到的模拟短肽，经鉴定表现出良好的抗原性，可能为HSV-Ⅰ糖蛋白gC的一个模拟表位.白雪帆等[8，9] 应用RPL技术研究汉坦病毒核蛋白抗原表位，确定了与mAb反应的最小抗原多肽.本研究中夹心ELISA和竞争ELISA结果说明了经过三轮亲和淘筛得到的噬菌体能够特异地与mAb2F2单抗结合，并且这种结合可被天然抗原所抑制，竞争抑制率高达86%.由此推测筛选到的噬菌体递呈了能与mAb2F2决定簇互补区(CDR)相结合的短肽，短肽上可能具有mAb2F2识别的表位.
早期利用RPL技术所进行的表位研究，主要是分析蛋白质的线性表位.但是新近的研究表明，噬菌体表达的线性多肽也可以模拟大分子抗原空间依赖性表位，引起特异性的强免疫反应，尽管二者的氨基酸顺序可能完全不同，这就是所谓的模拟表位[10] .我们淘筛到的噬菌体短肽具有和mAb2F2特异结合的功能，但并不和JEV E蛋白完全同源，并且以往的研究表明2F2很可能是一个抗空间表位的抗体，因此同源分析得到的序列PXXSPS可能是JEV E蛋白的一个模拟表位.
JEV囊膜糖蛋白E具有多种生物学特性，与病毒的致病性和组织亲嗜性密切相关.E蛋白含有B细胞和T辅助细胞的表位.Mason等[2] 的研究表明，JEV中和表位大多集中在E蛋白空间结构复杂的区域，即短至95个氨基酸(303～396aa)的肽段.Strias-tava等11] 的研究说明在E蛋白末端的1/3区域存在着线性的表位.而Seif等[12] 的研究进一步定位出在E蛋白373～399aa这一只有27个氨基酸的区域存在着线性中和表位.上述研究结果虽然初步定位了E蛋白的一些抗原表位，但由于研究技术的限制，均未能准确地测定出表位的大小和组成.
对本实验结果进行深入研究可以从分子水平上加深对JEV E蛋白中和表位的认识，从而为JEV小 分子多肽疫苗的合理设计提供策略.另外，本实验中ELISA结果显示了筛选到的噬菌体短肽具有较好的抗原特异性，为设计以小分子多肽替代JEV Ag作为诊断试剂提供了有益的线索.
参考文献:
[1]Smith GP，Petrenko VA.Phage display [J].Chem Rev，1997;97(2):391-410.
[2]Mason PW，Dalrymple JM，Gentry MK，Mccown JM，Hoke CH，Burke DS，Fournier MJ，Mason TL.Molecular characteri-zation of a neutralizing domain of the Japanese encephalitis virus structrual glycoprotein [J].J Gen Virol，1989;70(8):2037-2049.
[3]Ma WY，Yu BY，Jiang SC.The research of concentrating and purifing the Japanese encephalitis virus from infected mouse brain [J].Di-si Junyi Daxue Xuebao(J Fourth Mil Med Univ)，1984;5(4):251-254.
[4]Zhang MJ，Wang MX，Jiang SZ，Xiu ZZ，Ma WY.Preparation and characterization of the monoclonal antibodies against Japanese encephalitis virus [J].Acta Virol，1992;36(6):533-540.
[5]Parmley SF，Smith GP.Antibody-selectable filamentous fd phage vectors:Affinity purification of target genes [J].Gene，1988;73(2):305-318.
[6]Du Y，Wang HT.The application of phage display peptide li-brary in protein epitope analysis [review][J].Guowai Yixue Mianyixue Fence(Foreign Med Sci Immunol)，1998;21(2):103-107.
[7]Yang QX，Ma WY，YY.The study of memitic oligo-peptide of HSV giycoprotein screening from phage random peptide library [J].Xibao Yu Fenzi Mianyixue Zazhi(J Cell Mol Immunol)，2000;16(6):464-466.
[8]Bai XF，Huang CX，Wang Y，Pan L，Yang WS.The recogni-tion and mapping of epitopes of Hantaan virus nucleocapsid pro-tein N-terminal by phage peptide library [J].Di-si Junyi Daxue Xuebao(J Fourth Mil Med Univ)，1998;19(6):709-710.
[9]Bai XF，Zhang Y，Wang Y，Pan L，Fack F，EKF Bautz.Fine mapping of epitopes of Hantaan virus nucleocapsid protein by peptide scanning [J].Di-si Junyi Daxue Xuebao(J Fourth Mil Med Univ)，2000;21(7):850-852.
[10]Oldenburg KR，Loganathan D，Goldstein IJ，Schultz PG，Gal-lop MA.Peptide Ligands for a sugar-binding protein isolated fome a random peptide library [J].Proc Natl Acad Sci USA，1992;89(12):5393-5397.
[11]Striastava AK，Morita K，Matsuo S，Tanaka M，Igarashi A.Japanese encephalitis virus fusion protein expressed in Es-cherichia coli cdnfers protective immunity in mice [J].Microbiol Immunol，1991;35(10):863-870.
[12]Seif SA，Morita K，Matsuo S，Hasebe F，Igarashi A.Finer mapping of neutralizing epitope(s)on the C-terminal of Japanese encephalitis virus E-protein expressed in recombinant Escherichia coli system [J ].Vaccine，1995;13(16):1515-1521.
编辑 甄志强
第四军医大学基础部微生物学教研室，陕西西安710033
基金项目: 全军医药卫生科研基金资助项目(98M102)
作者简介: 任君萍(1972-)，女(汉族)，陕西省扶风县人.硕士(导师马文煜).Tel.(029)3374526, 百拇医药(任君萍 马文煜 杨乔欣 肖毅 丁天兵 黎志东)