抗肝癌单链双功能抗体基因逆转录病毒表达载体的构建及包装
关键词: 肝癌;单链双功能抗体;逆转录病毒表达载体;包装细胞;基因转染
0 引言
人类基因治疗技术的迅速发展使越来越多针对先天性和获得性疾病的基因治疗方案进入临床试验，同时，逆转录病毒作为介导基因转染的载体也是目前基础和临床应用研究中最广泛使用的基因转移方法[1] .迄今所掌握的研究资料表明，接受逆转录病毒介导基因治疗的患者中尚未发现因病毒感染导致的不良反应.因此，我们选择改造的缺陷型逆转录病毒载体pLXSN，将分泌型抗肝癌单链双功能抗体基因(sFv-TNF-α)克隆至该载体，进行病毒包装并筛选具有高滴度感染性重组病毒产生细胞系的研究.
1 材料和方法
1.1 材料 分泌型抗肝癌单链双功能抗体质粒pEGFP-sFv-TNF-α由本实验室构建.逆转录病毒表达载体pLXSN，大肠杆菌HB101由廖文俊博士惠赠.包装细胞PA317和NIH Swiss小鼠成纤维细胞NIH3T3购自中国科学院细胞库.磷酸钙转染试剂盒和DNA纯化试剂盒购自Promega公司.限制性内切酶、T4 DNA连接酶、DMEM、G418购自Gibco公司.PCR引物由上海生物工程公司合成.
1.2 抗肝癌单链双功能抗体逆转录病毒表达载体的构建 分别用XhoⅠ及SacⅡ单酶切pLXSN载体及pEGFP-sFv-TNF-α质粒，Klenow酶补平粘末端，分别用EcoRⅠ单酶切，回收平、粘末端的线性化pLXSN载体及1260bp的sFv-TNF-α片段.将sFv-TNF-α片段与线性化pLXSN载体片段平-粘端连接，其产物为pLXSN-sFv-TNF-α(简称PST).转化HB101感受态宿主菌，PCR方法分别鉴定重组质粒PST中的neo，sFv及TNF-α基因片段.
1.3 逆转录病毒产生细胞系的建立 以标准的磷酸钙共沉淀法将20μg重组质粒PST转染PA317包装细胞16h，换完全DMEM培养液继续培养36h，换以含600mg·L-1 G418的完全DMEM培养液.每4d换液1次，直至抗性细胞集落形成，挑选细胞集落，用普通完全DMEM培养液扩大培养，以制备含病毒的包装细胞上清并测定病毒滴度.转染的包装细胞命名为PA317/PST.以NIH3T3细胞为指示靶细胞测定病毒滴度，计算集落形成率(colony forming unit，cfu).挑选出cfu最高的细胞集落，扩大培养.分别提取逆转录病毒产生细胞PA317/PST，逆转录病毒转导细胞NIH3T3/PST及对照PA317，NIH3T3细胞中的基因组DNA，PCR扩增neo基因，以证实外源neo基因导入靶细胞.
2 结果
2.1 重组质粒PST中neo，sFv及TNF-α基因PCR鉴定结果 PCR产物于15g·L-1 琼脂糖凝胶电泳，在327，470及790bp区域见强荧光条带分别与neo，TNF-α及sFv基因大小相符，阴性对照未见任何扩增条带(图1).
图1 略
2.2 逆转录病毒产生细胞系的建立及鉴定分析 20μg PST 质粒经磷酸钙共沉淀法转染6×105 PA317包装细胞，600mg·L-1 G418筛选10d后挑选50个细胞集落，于不含G418的完全DMEM培养液中扩大培养，其中29个细胞集落存活，生长至2wk左右测cfu.用倍比稀释的PA317/PST细胞上清感染NIH3T3细胞，24h后500mg·L-1 G418筛选，10～14d后镜下可见抗性细胞集落形成，结晶紫染色，计算cfu，筛选出具有最高cfu(1.6×109 ·L-1 )的细胞集落C22 .对其细胞基因组DNA中neo基因PCR分析结果显示，PA317/PST细胞和NIH3T3/PST细胞均扩增出327bp的条带，而对照PA317和NIH3T3细胞均未扩增出相应的条带(图2).
图2 略
3 讨论
将目的基因导入靶细胞是基因治疗过程中的一个重要环节，其效率的高低将直接影响基因治疗的效果甚至成败.而逆转录病毒介导的基因转移中高滴度感染性逆转录病毒包装细胞系的获得对目的基因转导效率至关重要.我们所采用的逆转录病毒载体[2] pLXSN来源于Moloney小鼠白血病病毒(MoMuLV)，转染包装细胞后能够瞬时或稳定表达包装信号ψ、插入的目的基因及标志基因neo，包装的子代病毒颗粒以芽生的方式从包装细胞膜分泌至培养上清，具有感染性但无复制能力，即建立了产生重组逆转录病毒颗粒的细胞系.由于逆转录病毒包膜中含有env基因编码的一种糖蛋白，而许多哺乳动物细胞具有识别这种糖蛋白的受体，两者结合可介导逆转录病毒对靶细胞的有效感染，进而整合到宿主细胞染色体DNA中.PA317细胞是目前较广泛使用的第二代包装细胞[3] ，能产生宽宿主谱的双向性毒种，而不产生可测出的辅助病毒，用它制备的逆转录病毒可以感染人和其他哺乳动物细胞，是一种广泛使用、较安全的包装细胞.
我们的结果显示，在建立稳定并高效产生重组逆转录病毒的包装细胞系时，挑选细胞集落的数量不应少于50个，因为是否能高效、稳定包装子代逆转录病毒颗粒并不只取决于包装细胞中是否已导入逆转录病毒载体.通过物理和化学方法介导的基因转移往往很难达到持续稳定的表达，外源基因只是随机整合到转染细胞的基因组DNA中，常常经受正常机制的降解并从细胞中排除出去，因而外源目的基因很容易丢失.研究表明，PA317细胞转染后筛选出的病毒滴度大于1×106 的细胞株只占很小的比例，都在5%以下[4] ，因此，要筛选出一株较高滴度的重组逆转录病毒产生细胞，需要挑选足够数量的细胞集落.
在实验中，我们将分泌型抗肝癌单链双功能抗体基因克隆至逆转录病毒表达载体pLXSN，包装后筛选出一株cfu>1×106 的感染性重组病毒产生细胞系C22 .对C22 细胞及其上清转导的NIH3T3细胞基因组DNA进行neo基因PCR分析，结果表明外源基因已整合到转染细胞DNA中，证实了重组病毒的活性及其转导靶细胞的可行性，为我们进一步应用抗肝癌单链双功能抗体基因进行肝癌基因治疗研究奠定了理论基础.在以后的实验中，我们将用C
22 细胞产生的重组病毒上清感染人T淋巴细胞，观察转导T细胞对肝癌细胞的体外杀伤作用.
参考文献:
[1]Duan L，Bagasra O，Laughlin MA，Dakes JW，Pomerantz RJ.Potent inhibition of human immunodeficiency virus type1repli-cation by an intracellular anti-Rev single-chain antibody [J].Proc Natl Acad Sci USA，1994;91:5075-5079.
[2]Hoeben RC，Valerio D，Van der Eb AJ，Van Ormondt H.Gene therapy for human inherited disorders:Techniques and status [J].Crit Rev Oncol Hemato，1992;13(1):33-54.
[3]Miller AD and Buttimore C.Redesign of retrovirus packaging cell lines to avoid recombination leading to helper virus produc-tion [J].Mol Cell Biol，1986;6:2895.
[4]胡 亮，钱关祥，沈文红，许伟榕，张腾飞，陈诗书.PA317产生高滴度带有人TNF-α基因逆转录病毒的研究[J].中国肿瘤生物治疗杂志，1995;2(3):235-238.
编辑 王 睿
1 第四军医大学基础部病理学教研室，陕西西安710033，
2 第四军医大学唐都医院全军骨肿瘤研究所
作者简介: 程 虹(1967-)，女(汉族)，安徽省宣州市人.博士，讲师. Tel.(029)3374541, http://www.100md.com(程虹 刘彦仿 张惠中 于继云 张素珍)
0 引言
人类基因治疗技术的迅速发展使越来越多针对先天性和获得性疾病的基因治疗方案进入临床试验，同时，逆转录病毒作为介导基因转染的载体也是目前基础和临床应用研究中最广泛使用的基因转移方法[1] .迄今所掌握的研究资料表明，接受逆转录病毒介导基因治疗的患者中尚未发现因病毒感染导致的不良反应.因此，我们选择改造的缺陷型逆转录病毒载体pLXSN，将分泌型抗肝癌单链双功能抗体基因(sFv-TNF-α)克隆至该载体，进行病毒包装并筛选具有高滴度感染性重组病毒产生细胞系的研究.
1 材料和方法
1.1 材料 分泌型抗肝癌单链双功能抗体质粒pEGFP-sFv-TNF-α由本实验室构建.逆转录病毒表达载体pLXSN，大肠杆菌HB101由廖文俊博士惠赠.包装细胞PA317和NIH Swiss小鼠成纤维细胞NIH3T3购自中国科学院细胞库.磷酸钙转染试剂盒和DNA纯化试剂盒购自Promega公司.限制性内切酶、T4 DNA连接酶、DMEM、G418购自Gibco公司.PCR引物由上海生物工程公司合成.
1.2 抗肝癌单链双功能抗体逆转录病毒表达载体的构建 分别用XhoⅠ及SacⅡ单酶切pLXSN载体及pEGFP-sFv-TNF-α质粒，Klenow酶补平粘末端，分别用EcoRⅠ单酶切，回收平、粘末端的线性化pLXSN载体及1260bp的sFv-TNF-α片段.将sFv-TNF-α片段与线性化pLXSN载体片段平-粘端连接，其产物为pLXSN-sFv-TNF-α(简称PST).转化HB101感受态宿主菌，PCR方法分别鉴定重组质粒PST中的neo，sFv及TNF-α基因片段.
1.3 逆转录病毒产生细胞系的建立 以标准的磷酸钙共沉淀法将20μg重组质粒PST转染PA317包装细胞16h，换完全DMEM培养液继续培养36h，换以含600mg·L-1 G418的完全DMEM培养液.每4d换液1次，直至抗性细胞集落形成，挑选细胞集落，用普通完全DMEM培养液扩大培养，以制备含病毒的包装细胞上清并测定病毒滴度.转染的包装细胞命名为PA317/PST.以NIH3T3细胞为指示靶细胞测定病毒滴度，计算集落形成率(colony forming unit，cfu).挑选出cfu最高的细胞集落，扩大培养.分别提取逆转录病毒产生细胞PA317/PST，逆转录病毒转导细胞NIH3T3/PST及对照PA317，NIH3T3细胞中的基因组DNA，PCR扩增neo基因，以证实外源neo基因导入靶细胞.
2 结果
2.1 重组质粒PST中neo，sFv及TNF-α基因PCR鉴定结果 PCR产物于15g·L-1 琼脂糖凝胶电泳，在327，470及790bp区域见强荧光条带分别与neo，TNF-α及sFv基因大小相符，阴性对照未见任何扩增条带(图1).
图1 略
2.2 逆转录病毒产生细胞系的建立及鉴定分析 20μg PST 质粒经磷酸钙共沉淀法转染6×105 PA317包装细胞，600mg·L-1 G418筛选10d后挑选50个细胞集落，于不含G418的完全DMEM培养液中扩大培养，其中29个细胞集落存活，生长至2wk左右测cfu.用倍比稀释的PA317/PST细胞上清感染NIH3T3细胞，24h后500mg·L-1 G418筛选，10～14d后镜下可见抗性细胞集落形成，结晶紫染色，计算cfu，筛选出具有最高cfu(1.6×109 ·L-1 )的细胞集落C22 .对其细胞基因组DNA中neo基因PCR分析结果显示，PA317/PST细胞和NIH3T3/PST细胞均扩增出327bp的条带，而对照PA317和NIH3T3细胞均未扩增出相应的条带(图2).
图2 略
3 讨论
将目的基因导入靶细胞是基因治疗过程中的一个重要环节，其效率的高低将直接影响基因治疗的效果甚至成败.而逆转录病毒介导的基因转移中高滴度感染性逆转录病毒包装细胞系的获得对目的基因转导效率至关重要.我们所采用的逆转录病毒载体[2] pLXSN来源于Moloney小鼠白血病病毒(MoMuLV)，转染包装细胞后能够瞬时或稳定表达包装信号ψ、插入的目的基因及标志基因neo，包装的子代病毒颗粒以芽生的方式从包装细胞膜分泌至培养上清，具有感染性但无复制能力，即建立了产生重组逆转录病毒颗粒的细胞系.由于逆转录病毒包膜中含有env基因编码的一种糖蛋白，而许多哺乳动物细胞具有识别这种糖蛋白的受体，两者结合可介导逆转录病毒对靶细胞的有效感染，进而整合到宿主细胞染色体DNA中.PA317细胞是目前较广泛使用的第二代包装细胞[3] ，能产生宽宿主谱的双向性毒种，而不产生可测出的辅助病毒，用它制备的逆转录病毒可以感染人和其他哺乳动物细胞，是一种广泛使用、较安全的包装细胞.
我们的结果显示，在建立稳定并高效产生重组逆转录病毒的包装细胞系时，挑选细胞集落的数量不应少于50个，因为是否能高效、稳定包装子代逆转录病毒颗粒并不只取决于包装细胞中是否已导入逆转录病毒载体.通过物理和化学方法介导的基因转移往往很难达到持续稳定的表达，外源基因只是随机整合到转染细胞的基因组DNA中，常常经受正常机制的降解并从细胞中排除出去，因而外源目的基因很容易丢失.研究表明，PA317细胞转染后筛选出的病毒滴度大于1×106 的细胞株只占很小的比例，都在5%以下[4] ，因此，要筛选出一株较高滴度的重组逆转录病毒产生细胞，需要挑选足够数量的细胞集落.
在实验中，我们将分泌型抗肝癌单链双功能抗体基因克隆至逆转录病毒表达载体pLXSN，包装后筛选出一株cfu>1×106 的感染性重组病毒产生细胞系C22 .对C22 细胞及其上清转导的NIH3T3细胞基因组DNA进行neo基因PCR分析，结果表明外源基因已整合到转染细胞DNA中，证实了重组病毒的活性及其转导靶细胞的可行性，为我们进一步应用抗肝癌单链双功能抗体基因进行肝癌基因治疗研究奠定了理论基础.在以后的实验中，我们将用C
22 细胞产生的重组病毒上清感染人T淋巴细胞，观察转导T细胞对肝癌细胞的体外杀伤作用.
参考文献:
[1]Duan L，Bagasra O，Laughlin MA，Dakes JW，Pomerantz RJ.Potent inhibition of human immunodeficiency virus type1repli-cation by an intracellular anti-Rev single-chain antibody [J].Proc Natl Acad Sci USA，1994;91:5075-5079.
[2]Hoeben RC，Valerio D，Van der Eb AJ，Van Ormondt H.Gene therapy for human inherited disorders:Techniques and status [J].Crit Rev Oncol Hemato，1992;13(1):33-54.
[3]Miller AD and Buttimore C.Redesign of retrovirus packaging cell lines to avoid recombination leading to helper virus produc-tion [J].Mol Cell Biol，1986;6:2895.
[4]胡 亮，钱关祥，沈文红，许伟榕，张腾飞，陈诗书.PA317产生高滴度带有人TNF-α基因逆转录病毒的研究[J].中国肿瘤生物治疗杂志，1995;2(3):235-238.
编辑 王 睿
1 第四军医大学基础部病理学教研室，陕西西安710033，
2 第四军医大学唐都医院全军骨肿瘤研究所
作者简介: 程 虹(1967-)，女(汉族)，安徽省宣州市人.博士，讲师. Tel.(029)3374541, http://www.100md.com(程虹 刘彦仿 张惠中 于继云 张素珍)