HBVx基因真核表达载体的构建及对肝癌细胞恶性表型的影响
关键词: 乙型肝炎病毒x基因;真核表达载体;肝癌细胞
摘 要:目的 构建乙型肝炎病毒x基因真核表达载体并在肝癌细胞中表达，以研究其对肝癌细胞恶性表型的影响. 方法 应用PCR、基因克隆等方法构建乙型肝炎病毒x基因真核表达载体pcDNA3.1-HBX，用基因转染的方法将pcD-NA3.1-HBX转染入肝癌细胞HCC-9204，筛选稳定表达乙型肝炎病毒X蛋白的肝癌细胞.MTT比色实验、平板集落形成实验检测肝癌细胞恶性表型. 结果 成功构建了乙型肝炎病毒x基因真核表达载体pcDNA3.1-HBX并获得了稳定表达乙型肝炎病毒X蛋白的肝癌细胞系HCC-9204细胞克隆，且MTT比色实验、平板克隆形成实验显示稳定表达乙型肝炎病毒X蛋白的肝癌细胞恶性度增高. 结论 乙型肝炎病毒X蛋白具有生长因子样作用，可刺激肝癌细胞生长，在肝癌细胞中稳定表达乙型肝炎病毒X蛋白可增加肝癌细胞恶性表型.
Construction and expression of eukaryotic expres┐sion vector of HBV x gene and its effect on the ma┐lignant phenotype of hepatocellular carcinoma cells
GUO Shuang-Ping WANG Wen-Liang ZHAI Yu-Qiang
1 Department of Pathology，Faculty of Preclinical Medicine，Fourth Military Medical University，Xi'an710033，China，
2 Central Hospital of Xi'an
Keywords:HBV x gene;eukaryotic expression vector;hepa-tocellular carcinoma cell
Abstract:AIM To construct and express the eukaryotic ex-pression vector of HBV x gene and study its effect on the ma-lignant phenotype of hepatocellular carcinoma cells.METHODS Polymerase chain reaction(PCR)and other molecular biological methods were used to construct the eukaryotic expression vector of HBV x gene pcDNA3.1-HBX.Then gene transfection mediated by the lipofectamine was used to introduce the eukaryotic expression vector of HBV x gene into human hepatocellular carcinoma cell line HCC-9204.The selective medium containing G418was used to select the cell clones which express the X protein of HBV constantly.MTT colorimetric analysis experiment and agarose colony-forming were used to study the role of the X protein in the malignant phenotype and growth of hepatocel-lular carcinoma cells.RESULTS The eukaryotic expression vector of HBV x gene was successfully constructed.The cell clones which expressed the X protein constantly were ob-tained by the selective medium containing G418.Cells which constitutively expressed the X protein had a relatively higher malignant phenotype.CONCLUSION The X protein has growth factor-like activities and can stimulate the growth of hepatocellular carcinoma cells and enhance its malignant phe-notype.
0 引言
乙型肝炎病毒(HBV)相关的原发性肝癌发病率和死亡率都很高，HBV与原发性肝癌之间存在着密切的关系.阐明二者的关系将对探讨HBV相关的原发性肝癌的发生、发展、预防及治疗具有重要意义.为此，本研究首先构建了HBV x基因真核表达载体，并通过基因转染技术转染至人HCC-9204肝癌细胞，经过药物筛选获得稳定表达HBV X蛋白的细胞克隆，观察肝癌细胞在转染外源性HBV x基因后细胞恶性表型的变化.
1 材料和方法
1.1 材料 人肝癌细胞系HCC-9204为病理学教研室建株.肝癌细胞取自60岁男性肝癌患者手术标本，病理诊断为肝细胞肝癌Ⅱ～Ⅲ级.MTT购自Sigma公司，Taq DNA聚合酶、G418购自Promega公司，EcoR I，Kpn I，BamH I，T4 DNA连接酶为华美公司产品，兔抗HBx多克隆抗体购自美国Fox Chase癌症中心，地高辛DNA随机引物标记试剂盒购自德国宝灵曼公司，HBV x基因PCR引物由上海生工生物工程公司合成.
1.2 HBV x基因克隆及序列测定
1.2.1 PCR法从质粒pTTHK中扩增HBV x基因 模板为含HBV DNA的质粒pTTHK，分别在PCR引物的上游引物和下游引物的5'端加上相应的限制性内切酶Kpn I和EcoR I酶切位点，引物顺序如下:上游引物5'ATCGGTACCATGGCTGC-TAGGCTG3';下游引物5'GGAGAATTCAT-GATTAGGCAGAGGTG3'.
应用上述引物对模板DNA进行PCR，按下列条件在PCR自动扩增仪上进行PCR.94℃5min→59℃1min→74℃1min，循环30次后，74℃延伸10min.阴性对照除不含模板DNA外，其他成分与实验组相同.
1.2.2 PCR产物与克隆载体pT7Blue连接 先用EcoR V将克隆载体pT7Blue切成线性，然后将回收的PCR产物HBx DNA片段接于克隆载体pT7-Blue.取连接产物转化感受态细菌DH5α大肠杆菌，挑选单菌落，筛选重组体.
1.2.3 筛选重组体pT7Blue-HBX 取上述质粒用EcoRI和KpnI双酶切鉴定.
1.2.4 序列测定 选择酶切结果正确的细菌菌落，提取质粒DNA并纯化.用紫外分光光度计测定DNA浓度，将5～10μg质粒DNA溶于三蒸水，用DNA自动测序仪进行序列测定.
1.2.5 真核表达载体pcDNA3.1-HBX的构建 将已经过序列测定的重组质粒pT7Blue-HBX及真核表达载体pcDNA3.1分别用EcoRI和KpnI双酶切，用DNA回收试剂盒回收并纯化HBx和pcDNA3.1片段，T4 DNA连接酶进行连接.EcoRI和KpnI双酶切鉴定重组质粒pcDNA3.1-HBX.
1.3 基因转染及筛选 用脂质体载体法将经聚乙二醇6000纯化的pcDNA3.1-HBX和pcDNA3.1质粒分别转染HCC-9204肝癌细胞，参照GIBCORL说明书进行.接种细胞于选择性培养液含G418700mg·L-1 ，培养1wk后换于含G418500mg·L-1 的培养液继续培养.同时设对照，用选择性培养液培养未进行基因转染的亲本细胞.
1.4 HBV x基因在肝癌细胞中的表达 原位杂交法检测转染pcDNA3.1-HBX质粒的第四代肝癌细胞中HBV x mRNA，探针用DNA随机引物法进行标记.对照实验:设未转染肝癌细胞为阴性对照，不加探针的空白对照.免疫荧光法检测经G418筛选的转染pcDNA3.1-HBX或pcDNA3.1质粒的第四代 肝癌细胞中X蛋白.对照实验:空白对照分别用PBS代替一抗或二抗.阴性对照为未进行基因转染的HCC-9204肝癌细胞爬片.
1.5 转染pcDNA3.1┐HBX质粒对肝癌细胞恶性表型的影响
1.5.1 四唑盐(MTT)比色试验 将未进行基因转染的HCC-9204肝癌细胞，转染pcDNA3.1空载体的肝癌细胞及稳定表达X蛋白的肝癌细胞，阿霉素诱导细胞凋亡.待细胞基本长满培养孔底时，将培养板移入4℃冰箱放置1h，分别用200μL浓度为5，10，20，40和80μmol·L-1 阿霉素作用于细胞，每3孔为1组，浓度相同，37℃，5mL·L-1 CO2 及饱和湿度下培养.3h后，吸弃药液，培养液洗细胞2次，换新的完全培养液200μL继续培养6h.每孔加新鲜配制的MTT(5g·L-1 )20μL作用4h，加二甲基亚砜(DMSO)150μL，振荡10min，酶联免疫检测仪上测定各孔在490nm波长的吸光度，记录结果.
1.5.2 平板集落形成实验 取对数生长期的转染pcDNA3.1-HBX，pcDNA3.1质粒的肝癌细胞及未进行基因转染的亲本细胞HCC-9204，制成单细胞悬液;按每个培养皿含2000个细胞的密度分别接种.将平皿倒置并叠加一张带网格的透明胶片，用肉眼直接计数细胞隆数，计算克隆形成率并进行χ2 检验.
2 结果
2.1 HBV x基因真核表达载体pcDNA3.1┐HBX的构建 2.1.1 HBV x基因的克隆及序列测定 应用HBV x基因的引物，对含HBV DNA的质粒pTTHK模板进行PCR反应，电泳结果显示仅在480bp处有单一条带，阴性对照为阴性(Fig1).
图1 略
2.1.2 HBV x DNA与克隆载体pT7Blue的连接及重组体的鉴定 回收并纯化480bp大小的HBV x DNA与克隆载体pT7Blue的连接复合物，扩增后提取质粒DNA，用EcoRI和KpnI双酶切鉴定，结果表明HBV x DNA已克隆到pT7Blue载体，构建成重组体pT7Blue-HBX(Fig2).
图2 略
2.1.3 重组体pT7Blue-HBX序列测定 将已经酶切鉴定的pT7Blue-HBX重组质粒，经DNA自动测序仪进行序列分析，表明克隆到pT7Blue中的PCR产物是HBV x基因，属adw2型.
2.1.4 HBV x基因真核表达载体的构建 取经过测序的重组质粒pT7Blue-HBX用EcoRI和KpnI双酶切，将HBV x片段定向克隆于真核表达载体pcD-NA3.1，转化宿主菌DH5α大肠杆菌，筛选重组质粒，酶切鉴定，电泳结果见Fig3.表明HBV x基因已被定向克隆于真核表达载体，构建成了HBV x基因真核表达载体pcDNA3.1-HBX.
图3 略
2.2 HBV x基因在肝癌细胞中的表达
2.2.1 基因转染 用脂质体介导法分别将经聚乙二醇6000纯化的pcDNA3.1-HBX和pcDNA3.1质粒转染人HCC-9204肝癌细胞，3d后用G418筛选抗 G418肝癌细胞，2wk后绝大多数细胞都死亡，仅残留少数贴壁细胞.贴壁细胞逐渐呈克隆性生长(Fig4)，待细胞生长至瓶底面积60%时，将部分细胞冻存，部分细胞扩大培养.对照组结果，未转染基因的肝癌细胞，经相同浓度G418作用2wk后，细胞全部死亡，初步说明基因转染成功.
2.2.2 转录水平检测肝癌细胞中HBV x基因的表达 原位杂交法检测肝癌细胞中HBV X mRNA，按常规方法检测转染pcDNA3.1-HBX质粒的第四代肝癌细胞中HBV X mRNA，未转染基因的肝癌细胞为阴性对照.在实验组细胞，结果可见蓝紫色颗粒样物位于细胞质中，细胞核中无阳性信号，对照组细胞质和细胞核中均无阳性信号(Fig5).说明HBV x基因被转染入肝癌细胞并转录成mRNA.
2.2.3 免疫荧光法检测X蛋白在肝癌细胞中的表达 按常规方法检测X蛋白在转染pcDNA3.1-HBX质粒的第四代肝癌细胞中的表达，未进行基因转染的肝癌细胞为阴性对照.荧光显微镜下观察，在实验组细胞胞质和细胞核中均可见黄绿色荧光，对照组细胞无黄绿色荧光.说明，转染HBV x基因的肝癌细胞表达X蛋白.
2.3 转染pcDNA3.1┐HBX对肝癌细胞恶性表型的影响
2.3.1 MTT比色试验 取每组3个孔数据均数，进行方差分析，两两比较.5，10和20μmol·L-1 阿霉素作用各组细胞时，稳定表达X蛋白肝癌细胞的A490nm 值显著高于单独转染空载体及未进行基因转染的肝癌细胞(P<0.05).转染空载体及未转染基因的肝癌细胞比较，各个浓度阿霉素作用后，A490nm 值差异均无显著性(P>0.05，Tab1).
表1 阿霉素诱导HCC-9204细胞凋亡的MTT试验结果 略
2.3.2 平板集落形成实验 将对数生长期的稳定表达X蛋白的肝癌细胞，转染空载体的肝癌细胞及未转染基因的亲本细胞各2000个/每皿，接种于培养皿，培养2wk后可见细胞集落形成，姬姆萨染色(Fig6，7)，计算克隆形成率，分别为75.6%，38.9%和41.7%.χ2 检验显示，稳定表达X蛋白的肝癌细胞克隆形成率较其他两种细胞高，并且差异有显著性(P<0.05)，转染空载体的肝癌细胞克隆形成率与亲本细胞克隆形成率相近，差异无显著性(P>0.05).
图4 -图7 略
3 讨论
原发性肝癌的发生和HBV感染密切相关，是最常见的恶性肿瘤之一.研究表明，HBV感染与原发性肝癌之间存在着密切的关系，特别是HBV x基因编码的X蛋白具有反式激活作用，可激活病毒和细胞基因，调控其转录，与病毒复制和慢性感染状态的维持相关，在HCC的发生发展过程中具有重要作用[1] .为研究X蛋白的功能，已建立了不少HBV x基因表达体系，有在大肠杆菌表达融合蛋白的，有在昆虫细胞中表达的，也有在人和哺乳动物细胞表达的.不论那种表达体系和检测形式X蛋白均具有活性，说明X蛋白功能域稳定，在各种细胞内其活性均不受影响.为研究X蛋白对肝癌细胞恶性表型的影响，本研究首先构建了HBV x基因真核表达载体，用脂质体介导法将其转入肝癌细胞HCC-9204，并经G418筛选获得稳定表达X蛋白的肝癌细胞克隆.MTT比色试验、平板集落形成试验表明稳定表达X蛋白的肝癌细胞恶性程度增高，克隆形成率高于未转染基因的亲本细胞.细胞生长力旺盛、分裂相极多见，完全失去接触性抑制呈多层生长.表明X蛋白具有生长调控蛋白样作用，可促进肝癌细胞生长，使肝癌细胞恶性程度增高.
X蛋白属于核蛋白，但在转染的肝癌细胞中定位于细胞质和细胞核.这与一些研究报道一致，在HBV急慢性感染的肝组织和肝癌组织中，X蛋白共存于细胞质和细胞核[2] .X蛋白在细胞中的位置与细胞种类，状态及X蛋白的作用状态有关，细胞中不同的X结合蛋白决定了X蛋白在细胞中的定位，而且不同定位的X蛋白在细胞中发挥的作用不同.细胞质中的X蛋白可影响细胞信号转导，已发现X蛋白可影响细胞Ras/Raf/MAPK信号转导途径[3，4] ，X蛋白可激活转录因子NF-κB[5，6] ，还可与p53形成蛋白质-蛋白质复合体[7，8] ，影响p53介导的信号转导[9] .X蛋白具有生长调控蛋白样作用，不恰当地激活信号转导途径，刺激细胞生长[10] .
在HBV相关的原发性肝癌发生过程中，HBV x基因最常被整合入宿主细胞基因组，并且整合的x基因可编码在体内外都具有反式激活作用的X蛋白[8] .随着HBV复制，表达病毒膜抗原的肝细胞被机体免疫反应识别并清除，而含有整合型病毒基因的肝细胞，由于病毒基因的缺陷可逃逸机体免疫反应，并随着肝细胞再生而呈克隆性增生，成为优势细胞 [11] .在其他致癌因素协同作用下促进细胞恶性转化，这可能是HBV相关的原发性肝癌发生的重要机制之一.
参考文献:
[1]Seifer M，Hohne M，Schaefer S，Hoeijmakers JH，Curtis CH.In vitro tumorigenicity of hepatitis B virus DNA and HBx pro-tein [J].J Hepatol，1991;13(4):561-565.
[2]Wang WL，London WT，Feitelson MA.Hepatitis B x antigen in hepatitis B virus carrier patients with liver cancer [J].Cancer Res，1991;51:4971-4977.
[3]Benn J，Schneider RJ.HBV X protein activates ras-GTP com-plex formation and establishes a ras，raf MAP kinase signaling cascade [J].Proc Natl Acad Sci USA，1994;91:10350-10354.
[4]Benn J，Schneider RJ.Hepatitis B virus HBx protein deregulates cell cycle checkpoint controls [J].Proc Natl Acad Sci USA，1995;92:11215-11219.
[5]Kekule AS，Laure U，Weiss L，Luber B，Hofschneider PH.HBV transactivator HBx uses a tumour promoter signalling pathway [J].Nature，1993;361:742-745.
[6]Marakami S，Cheong JH，Ohno S，Tab S，Hotta Y.Transacti-vation of human HBV X protein，HBx operates through mecha-nism distinct from protein kinase C and okadaic acid activation pathways [J].Virology，1994;199:243-246.
[7]Zhu MH，Duan LX，Feitelson MA，Yu Y.Function and signi-fance of HBV and tumour suppressor gene p53interaction [J].Virology，1998;14:10-15.
[8]Feitelson MA，Duan LX.Hepatitis B virus x antigen in the pathogensis of chronic infections and the development of hepato-cellular carcinoma [J].Am J Pathol，1997;150:1141-1149.
[9]Feitelson MA，Zhu M，Duan LX，Griep AE.HBx Ag and p53are associated in vitro and in liver tissues from patients with pri-mary hepatocellular carcinoma [J].Oncogene，1993;8:1109-1117.
[10]Benn J，Schneider RJ.HBV X protein activates ras-GTP com-plex formation and establishes a ras，raf MAP kinase signaling cascade [J].Proc Natl Acad Sci USA，1994;91:10350-10354.
[11]Kim H，Lee H，Yu Y.X-gene product of hepatitis B virus in-duced apoptosis in liver cells [J].Biol Chem，1998;273:381-385.
编辑 王 睿
1 第四军医大学基础部病理学教研室，陕西西安710033，
2 西安市中心医院
基金项目: 国家自然科学基金资助项目(39470771)
作者简介: 郭双平(1967-)，女(汉族)，甘肃省通渭县人.博士，讲师.Tel.(029)3374541Ext.115, 百拇医药(郭双平 王文亮 翟宇强)
摘 要:目的 构建乙型肝炎病毒x基因真核表达载体并在肝癌细胞中表达，以研究其对肝癌细胞恶性表型的影响. 方法 应用PCR、基因克隆等方法构建乙型肝炎病毒x基因真核表达载体pcDNA3.1-HBX，用基因转染的方法将pcD-NA3.1-HBX转染入肝癌细胞HCC-9204，筛选稳定表达乙型肝炎病毒X蛋白的肝癌细胞.MTT比色实验、平板集落形成实验检测肝癌细胞恶性表型. 结果 成功构建了乙型肝炎病毒x基因真核表达载体pcDNA3.1-HBX并获得了稳定表达乙型肝炎病毒X蛋白的肝癌细胞系HCC-9204细胞克隆，且MTT比色实验、平板克隆形成实验显示稳定表达乙型肝炎病毒X蛋白的肝癌细胞恶性度增高. 结论 乙型肝炎病毒X蛋白具有生长因子样作用，可刺激肝癌细胞生长，在肝癌细胞中稳定表达乙型肝炎病毒X蛋白可增加肝癌细胞恶性表型.
Construction and expression of eukaryotic expres┐sion vector of HBV x gene and its effect on the ma┐lignant phenotype of hepatocellular carcinoma cells
GUO Shuang-Ping WANG Wen-Liang ZHAI Yu-Qiang
1 Department of Pathology，Faculty of Preclinical Medicine，Fourth Military Medical University，Xi'an710033，China，
2 Central Hospital of Xi'an
Keywords:HBV x gene;eukaryotic expression vector;hepa-tocellular carcinoma cell
Abstract:AIM To construct and express the eukaryotic ex-pression vector of HBV x gene and study its effect on the ma-lignant phenotype of hepatocellular carcinoma cells.METHODS Polymerase chain reaction(PCR)and other molecular biological methods were used to construct the eukaryotic expression vector of HBV x gene pcDNA3.1-HBX.Then gene transfection mediated by the lipofectamine was used to introduce the eukaryotic expression vector of HBV x gene into human hepatocellular carcinoma cell line HCC-9204.The selective medium containing G418was used to select the cell clones which express the X protein of HBV constantly.MTT colorimetric analysis experiment and agarose colony-forming were used to study the role of the X protein in the malignant phenotype and growth of hepatocel-lular carcinoma cells.RESULTS The eukaryotic expression vector of HBV x gene was successfully constructed.The cell clones which expressed the X protein constantly were ob-tained by the selective medium containing G418.Cells which constitutively expressed the X protein had a relatively higher malignant phenotype.CONCLUSION The X protein has growth factor-like activities and can stimulate the growth of hepatocellular carcinoma cells and enhance its malignant phe-notype.
0 引言
乙型肝炎病毒(HBV)相关的原发性肝癌发病率和死亡率都很高，HBV与原发性肝癌之间存在着密切的关系.阐明二者的关系将对探讨HBV相关的原发性肝癌的发生、发展、预防及治疗具有重要意义.为此，本研究首先构建了HBV x基因真核表达载体，并通过基因转染技术转染至人HCC-9204肝癌细胞，经过药物筛选获得稳定表达HBV X蛋白的细胞克隆，观察肝癌细胞在转染外源性HBV x基因后细胞恶性表型的变化.
1 材料和方法
1.1 材料 人肝癌细胞系HCC-9204为病理学教研室建株.肝癌细胞取自60岁男性肝癌患者手术标本，病理诊断为肝细胞肝癌Ⅱ～Ⅲ级.MTT购自Sigma公司，Taq DNA聚合酶、G418购自Promega公司，EcoR I，Kpn I，BamH I，T4 DNA连接酶为华美公司产品，兔抗HBx多克隆抗体购自美国Fox Chase癌症中心，地高辛DNA随机引物标记试剂盒购自德国宝灵曼公司，HBV x基因PCR引物由上海生工生物工程公司合成.
1.2 HBV x基因克隆及序列测定
1.2.1 PCR法从质粒pTTHK中扩增HBV x基因 模板为含HBV DNA的质粒pTTHK，分别在PCR引物的上游引物和下游引物的5'端加上相应的限制性内切酶Kpn I和EcoR I酶切位点，引物顺序如下:上游引物5'ATCGGTACCATGGCTGC-TAGGCTG3';下游引物5'GGAGAATTCAT-GATTAGGCAGAGGTG3'.
应用上述引物对模板DNA进行PCR，按下列条件在PCR自动扩增仪上进行PCR.94℃5min→59℃1min→74℃1min，循环30次后，74℃延伸10min.阴性对照除不含模板DNA外，其他成分与实验组相同.
1.2.2 PCR产物与克隆载体pT7Blue连接 先用EcoR V将克隆载体pT7Blue切成线性，然后将回收的PCR产物HBx DNA片段接于克隆载体pT7-Blue.取连接产物转化感受态细菌DH5α大肠杆菌，挑选单菌落，筛选重组体.
1.2.3 筛选重组体pT7Blue-HBX 取上述质粒用EcoRI和KpnI双酶切鉴定.
1.2.4 序列测定 选择酶切结果正确的细菌菌落，提取质粒DNA并纯化.用紫外分光光度计测定DNA浓度，将5～10μg质粒DNA溶于三蒸水，用DNA自动测序仪进行序列测定.
1.2.5 真核表达载体pcDNA3.1-HBX的构建 将已经过序列测定的重组质粒pT7Blue-HBX及真核表达载体pcDNA3.1分别用EcoRI和KpnI双酶切，用DNA回收试剂盒回收并纯化HBx和pcDNA3.1片段，T4 DNA连接酶进行连接.EcoRI和KpnI双酶切鉴定重组质粒pcDNA3.1-HBX.
1.3 基因转染及筛选 用脂质体载体法将经聚乙二醇6000纯化的pcDNA3.1-HBX和pcDNA3.1质粒分别转染HCC-9204肝癌细胞，参照GIBCORL说明书进行.接种细胞于选择性培养液含G418700mg·L-1 ，培养1wk后换于含G418500mg·L-1 的培养液继续培养.同时设对照，用选择性培养液培养未进行基因转染的亲本细胞.
1.4 HBV x基因在肝癌细胞中的表达 原位杂交法检测转染pcDNA3.1-HBX质粒的第四代肝癌细胞中HBV x mRNA，探针用DNA随机引物法进行标记.对照实验:设未转染肝癌细胞为阴性对照，不加探针的空白对照.免疫荧光法检测经G418筛选的转染pcDNA3.1-HBX或pcDNA3.1质粒的第四代 肝癌细胞中X蛋白.对照实验:空白对照分别用PBS代替一抗或二抗.阴性对照为未进行基因转染的HCC-9204肝癌细胞爬片.
1.5 转染pcDNA3.1┐HBX质粒对肝癌细胞恶性表型的影响
1.5.1 四唑盐(MTT)比色试验 将未进行基因转染的HCC-9204肝癌细胞，转染pcDNA3.1空载体的肝癌细胞及稳定表达X蛋白的肝癌细胞，阿霉素诱导细胞凋亡.待细胞基本长满培养孔底时，将培养板移入4℃冰箱放置1h，分别用200μL浓度为5，10，20，40和80μmol·L-1 阿霉素作用于细胞，每3孔为1组，浓度相同，37℃，5mL·L-1 CO2 及饱和湿度下培养.3h后，吸弃药液，培养液洗细胞2次，换新的完全培养液200μL继续培养6h.每孔加新鲜配制的MTT(5g·L-1 )20μL作用4h，加二甲基亚砜(DMSO)150μL，振荡10min，酶联免疫检测仪上测定各孔在490nm波长的吸光度，记录结果.
1.5.2 平板集落形成实验 取对数生长期的转染pcDNA3.1-HBX，pcDNA3.1质粒的肝癌细胞及未进行基因转染的亲本细胞HCC-9204，制成单细胞悬液;按每个培养皿含2000个细胞的密度分别接种.将平皿倒置并叠加一张带网格的透明胶片，用肉眼直接计数细胞隆数，计算克隆形成率并进行χ2 检验.
2 结果
2.1 HBV x基因真核表达载体pcDNA3.1┐HBX的构建 2.1.1 HBV x基因的克隆及序列测定 应用HBV x基因的引物，对含HBV DNA的质粒pTTHK模板进行PCR反应，电泳结果显示仅在480bp处有单一条带，阴性对照为阴性(Fig1).
图1 略
2.1.2 HBV x DNA与克隆载体pT7Blue的连接及重组体的鉴定 回收并纯化480bp大小的HBV x DNA与克隆载体pT7Blue的连接复合物，扩增后提取质粒DNA，用EcoRI和KpnI双酶切鉴定，结果表明HBV x DNA已克隆到pT7Blue载体，构建成重组体pT7Blue-HBX(Fig2).
图2 略
2.1.3 重组体pT7Blue-HBX序列测定 将已经酶切鉴定的pT7Blue-HBX重组质粒，经DNA自动测序仪进行序列分析，表明克隆到pT7Blue中的PCR产物是HBV x基因，属adw2型.
2.1.4 HBV x基因真核表达载体的构建 取经过测序的重组质粒pT7Blue-HBX用EcoRI和KpnI双酶切，将HBV x片段定向克隆于真核表达载体pcD-NA3.1，转化宿主菌DH5α大肠杆菌，筛选重组质粒，酶切鉴定，电泳结果见Fig3.表明HBV x基因已被定向克隆于真核表达载体，构建成了HBV x基因真核表达载体pcDNA3.1-HBX.
图3 略
2.2 HBV x基因在肝癌细胞中的表达
2.2.1 基因转染 用脂质体介导法分别将经聚乙二醇6000纯化的pcDNA3.1-HBX和pcDNA3.1质粒转染人HCC-9204肝癌细胞，3d后用G418筛选抗 G418肝癌细胞，2wk后绝大多数细胞都死亡，仅残留少数贴壁细胞.贴壁细胞逐渐呈克隆性生长(Fig4)，待细胞生长至瓶底面积60%时，将部分细胞冻存，部分细胞扩大培养.对照组结果，未转染基因的肝癌细胞，经相同浓度G418作用2wk后，细胞全部死亡，初步说明基因转染成功.
2.2.2 转录水平检测肝癌细胞中HBV x基因的表达 原位杂交法检测肝癌细胞中HBV X mRNA，按常规方法检测转染pcDNA3.1-HBX质粒的第四代肝癌细胞中HBV X mRNA，未转染基因的肝癌细胞为阴性对照.在实验组细胞，结果可见蓝紫色颗粒样物位于细胞质中，细胞核中无阳性信号，对照组细胞质和细胞核中均无阳性信号(Fig5).说明HBV x基因被转染入肝癌细胞并转录成mRNA.
2.2.3 免疫荧光法检测X蛋白在肝癌细胞中的表达 按常规方法检测X蛋白在转染pcDNA3.1-HBX质粒的第四代肝癌细胞中的表达，未进行基因转染的肝癌细胞为阴性对照.荧光显微镜下观察，在实验组细胞胞质和细胞核中均可见黄绿色荧光，对照组细胞无黄绿色荧光.说明，转染HBV x基因的肝癌细胞表达X蛋白.
2.3 转染pcDNA3.1┐HBX对肝癌细胞恶性表型的影响
2.3.1 MTT比色试验 取每组3个孔数据均数，进行方差分析，两两比较.5，10和20μmol·L-1 阿霉素作用各组细胞时，稳定表达X蛋白肝癌细胞的A490nm 值显著高于单独转染空载体及未进行基因转染的肝癌细胞(P<0.05).转染空载体及未转染基因的肝癌细胞比较，各个浓度阿霉素作用后，A490nm 值差异均无显著性(P>0.05，Tab1).
表1 阿霉素诱导HCC-9204细胞凋亡的MTT试验结果 略
2.3.2 平板集落形成实验 将对数生长期的稳定表达X蛋白的肝癌细胞，转染空载体的肝癌细胞及未转染基因的亲本细胞各2000个/每皿，接种于培养皿，培养2wk后可见细胞集落形成，姬姆萨染色(Fig6，7)，计算克隆形成率，分别为75.6%，38.9%和41.7%.χ2 检验显示，稳定表达X蛋白的肝癌细胞克隆形成率较其他两种细胞高，并且差异有显著性(P<0.05)，转染空载体的肝癌细胞克隆形成率与亲本细胞克隆形成率相近，差异无显著性(P>0.05).
图4 -图7 略
3 讨论
原发性肝癌的发生和HBV感染密切相关，是最常见的恶性肿瘤之一.研究表明，HBV感染与原发性肝癌之间存在着密切的关系，特别是HBV x基因编码的X蛋白具有反式激活作用，可激活病毒和细胞基因，调控其转录，与病毒复制和慢性感染状态的维持相关，在HCC的发生发展过程中具有重要作用[1] .为研究X蛋白的功能，已建立了不少HBV x基因表达体系，有在大肠杆菌表达融合蛋白的，有在昆虫细胞中表达的，也有在人和哺乳动物细胞表达的.不论那种表达体系和检测形式X蛋白均具有活性，说明X蛋白功能域稳定，在各种细胞内其活性均不受影响.为研究X蛋白对肝癌细胞恶性表型的影响，本研究首先构建了HBV x基因真核表达载体，用脂质体介导法将其转入肝癌细胞HCC-9204，并经G418筛选获得稳定表达X蛋白的肝癌细胞克隆.MTT比色试验、平板集落形成试验表明稳定表达X蛋白的肝癌细胞恶性程度增高，克隆形成率高于未转染基因的亲本细胞.细胞生长力旺盛、分裂相极多见，完全失去接触性抑制呈多层生长.表明X蛋白具有生长调控蛋白样作用，可促进肝癌细胞生长，使肝癌细胞恶性程度增高.
X蛋白属于核蛋白，但在转染的肝癌细胞中定位于细胞质和细胞核.这与一些研究报道一致，在HBV急慢性感染的肝组织和肝癌组织中，X蛋白共存于细胞质和细胞核[2] .X蛋白在细胞中的位置与细胞种类，状态及X蛋白的作用状态有关，细胞中不同的X结合蛋白决定了X蛋白在细胞中的定位，而且不同定位的X蛋白在细胞中发挥的作用不同.细胞质中的X蛋白可影响细胞信号转导，已发现X蛋白可影响细胞Ras/Raf/MAPK信号转导途径[3，4] ，X蛋白可激活转录因子NF-κB[5，6] ，还可与p53形成蛋白质-蛋白质复合体[7，8] ，影响p53介导的信号转导[9] .X蛋白具有生长调控蛋白样作用，不恰当地激活信号转导途径，刺激细胞生长[10] .
在HBV相关的原发性肝癌发生过程中，HBV x基因最常被整合入宿主细胞基因组，并且整合的x基因可编码在体内外都具有反式激活作用的X蛋白[8] .随着HBV复制，表达病毒膜抗原的肝细胞被机体免疫反应识别并清除，而含有整合型病毒基因的肝细胞，由于病毒基因的缺陷可逃逸机体免疫反应，并随着肝细胞再生而呈克隆性增生，成为优势细胞 [11] .在其他致癌因素协同作用下促进细胞恶性转化，这可能是HBV相关的原发性肝癌发生的重要机制之一.
参考文献:
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[11]Kim H，Lee H，Yu Y.X-gene product of hepatitis B virus in-duced apoptosis in liver cells [J].Biol Chem，1998;273:381-385.
编辑 王 睿
1 第四军医大学基础部病理学教研室，陕西西安710033，
2 西安市中心医院
基金项目: 国家自然科学基金资助项目(39470771)
作者简介: 郭双平(1967-)，女(汉族)，甘肃省通渭县人.博士，讲师.Tel.(029)3374541Ext.115, 百拇医药(郭双平 王文亮 翟宇强)