bcl┐2核酶对SMMC7721细胞端粒酶活性的影响作用
关键词: 肝肿瘤;bcl-2;核酶;脱噬作用
摘 要:目的 观察bcl-2核酶对SMMC-7721细胞的作用，探讨bcl-2表达水平的改变对细胞端粒酶活性的影响. 方法 经脂质体介导的方法将PMTr-neo(正向bcl-2核酶真核表达载体)导入SMMC7721细胞中，细胞克隆转移扩大培养后，采用TUNEL，TRAP-PCR-ELISA，免疫组化技术结合图像分析技术检测SMMC7721/PMTr-neo细胞凋亡、细胞端粒酶活性及P16，P21的改变. 结果 较对照组SMMC7721/PMTr-neo细胞Bcl-2表达水平显著下降，伴有显著细胞凋亡现象;同时端粒酶活性下降，P16，P21表达水平显著增加. 结论 bcl-2核酶可促进SMMC7721细胞发生凋亡，并降低细胞端粒酶活性，提示Bcl-2表达水平的改变对细胞端粒酶活性有一定的影响.
bcl┐2ribozyme reduces telomerase activity of SMMC7721cells
ZHANG Chuan-Shan WANG Wen-Liang PENG Wei-Dan HU Pei-Zhen CHAI Yu-Bo ZHANG Yan-Guo
1 Department of Pathology，Xijing Hospital，
2 Department of Biochemistry，Faculty of Preclinical Medicine，Fourth Military Medical University，Xi'an710033，China
Keywords:liver neoplasms;bcl-2;ribozyme;apoptosis
Abstract:AIM To observe the effect of bcl-2ribozyme on SMMC7721cells and to investigate bcl-2expression on cellu-lar apoptosis and telomerase activity.METHODS PMTr-neo(sense bcl-2ribozyme eucaryotic expression vector)was introduced into SMMC7221cells by using lipofectin media-tion，after cloning TUNEL and TRAP in combination of ELISA and IHC in combination of imaging analysis was used to determine SMMC7721/PMTr-neo apoptosis and telom-erase activity.RESULTS Compared with control，SMMC7721/PMTr-neo presented a significant drop in bcl-2expression and an increase in P16and P21expression，accom-panied by a decline in remarkable apoptosis and telomerase activity.CONCLUSION bcl-2ribozyme promotes apoptosis of SMMC7721cells and reduces telomerase activity.These provide a theoretical basis for applying antisense technique to treatment of hepatocarcinoma.
0 引言
抗凋亡蛋白Bcl-2在肿瘤发生过程中有着重要意义.自从Vaux首次证实bcl-2高表达可以诱发肿瘤后，人们对其进行深入研究，发现bcl-2可以抑制细胞凋亡、延长细胞生存期[1-3] 人们对bcl-2与肝癌的关系也进行了探讨，认为它与肝癌的发生也存在密切关系.目前有关核酶的研究在生物学领域中已成为新的热点:一方面可以利用核酶来研究特定基因的功能，因而其在基因表达调控研究中倍受重视;另一方面将核酶应用于基因治疗较其他反义技术具有更多优点.在肿瘤治疗方面，人们也开始有益的尝试，希望核酶能为肿瘤治疗提供新的有效手段.我们采用脂质体介导的基因转移方法，将bcl-2核酶导入人肝癌细胞株SMMC7721细胞中，结合TUNEL，TRAP-PCR-ELISA及免疫组化等技术观察bcl-2核酶对SMMC7721细胞的影响，为肿瘤基因治疗提供理论依据.
1 材料和方法
1.1 材料 大肠杆菌JM109由本校生物化学教研室惠赠;PMTr-neo质粒(含bcl-2核酶)由彭玮丹博士构建[4] ;核酸内切酶购自Promega公司;脂质体转染试剂盒购自Gibico公司;凋亡检测试剂盒购自Boehringer Mannheim公司;SMMC7721细胞由本室保存培养.
1.2 方法
1.2.1 PMTr-neo转染SMMC7721细胞 ①PMTr-neo质粒的鉴定:将PMTr-neo质粒转化JM109大肠杆菌，扩增提取质粒，经核酸内切酶BamHI，EcoRI双酶切后，电泳鉴定bcl-2核酶片段大小正确.②PMTr-neo转染SMMC7721细胞:把处于对数生长期的SMMC7721细胞分为两组:对照组(SMMC7721细胞)、实验组(转染PMTr-neo的SMMC7721细胞)，转染方法按脂质体转染试剂盒操作步骤说明进行，培养48h后传代，加入含G418550mg L-1 的培养液，筛选抗性细胞.继续培养2wk后，可见细胞克隆形成，继续扩大培养.③SMMC7721/PMTr-neo细胞的鉴定:细胞克隆扩大培养后，制作细胞爬片，用100μmol L-1 硫酸锌诱导bcl-2核酶表达.48h后，丙酮固定，免疫组化检测.Bcl-2单抗购自博士德生物公司，免疫组化按照DAKO公司Envi-sionTM +System，HRP试剂盒说明进行.免疫组化检测步骤如下:①30mL L-1 H2 O2 甲醇封闭30min;②3mL L-1 BSA封闭30min;③加一抗4℃过夜;④加DAKO EnvisionTM +System，HRP，mouse，(R4001);⑤显色，苏木精衬染封片.以上步骤均用PBS缓冲液洗涤，光镜下观察结果.同时设立对照实验.
1.2.2 bcl-2核酶对SMMC7721细胞作用 ①TUNEL检测:细胞克隆扩大培养后，细胞爬片，用100μmol L-1 硫酸锌诱导bcl-2核酶表达.48h后，丙酮固定，检测细胞凋亡情况.实验操作步骤参照In Situ Cell Death Detection Kit，AP操作说明进行.②TRAP-PCR-ELISA端粒酶活性检测:分别收集用100μmol L-1 硫酸锌诱导表达48h的1×107 对照组细胞、实验组细胞，进行细胞端粒酶活性检测.细胞端粒酶活性检测按照TRA-PCR-ELISA.AP试剂盒操作说明书进行.在DYNATECH MR400仪器上检测波长为450nm/630nm处各组细胞的吸光度(A).参照试剂盒结果判别说明，证实检测结果有效.③P16，P21免疫组化检测:细胞克隆扩大培养后，细胞爬片，用100μmol L-1 硫酸锌诱导bcl-2核酶表达.48h后，丙酮固定，免疫组化检测.P16，P21单抗购自中山生物公司，免疫组化检测步骤同上述.在高倍视野(×400)下，选择5个视野，分别计数200个细胞，并应用HPIAS-1000图文报告管理系统进行处理，检测细胞平均吸光度(A).
统计学处理:将所得各种实验数据结果，分别进行统计学处理.其中有关率的变化采用χ2 检验，有关x ±s，采用t检验.
2 结果
2.1 TUNEL检测 光镜观察可见SMMC7721/PMTr-neo较对照组细胞凋亡数量显著增多(Fig1，2)，在高倍视野(×400)下，选择5个视野分别计数200个细胞，统计凋亡细胞所占百分比，发现实验组凋亡细胞(24±4)/200(12.0±2.0)%，比对照组(8±4)/200(4.0±2.0)%明显增多(P<0.01，χ2 =7.643).
图1 - 图2 略
2.2 TRAP┐PCR┐ELISA端粒酶活性检测 结果显示，SMMC7721细胞表达高水平的端粒酶活性，吸光度(A450 -A630 )为2.861，而转染bcl-2核酶的细胞SMMC7721/PMTr-neo端粒酶活性表达显著下降，吸光度(A450 -A630 )仅为0.980.说明转染bcl-2核酶对SMMC7721细胞端粒酶活性有一定影响.
2.3 Bcl┐2，P16，P21组化检测 在SMMC7721/PMTr-neo细胞中，未能检测到Bcl-2蛋白，而对照组Bcl-2结果为阳性，说明在Zn2+ 诱导下bcl-2核酶有效表达，在转录水平上封闭了bcl-2表达.光镜观察可见SMMC7721/PMTr-neo较对照组细胞P16，P21蛋白表达水平显著增高，组化结果呈强阳性.应用图像分析仪测定免疫组化染色p16，p21阳性细胞吸光度(A)，实验组为:0.18±0.02，0.19±0.03，对照组为:0.23±0.06，0.26±0.02.实验组较对照组显著增高(P<0.05).
3 讨论
凋亡是细胞死亡的一种生理机制，在调节组织内环境稳定过程中起重要作用.凋亡的调节是一种非常复杂的过程，涉及到许多癌基因与抑癌基因的表达.Bcl-2是肿瘤研究中最受关注的抑制凋亡蛋白，认为其在肿瘤发生中有重要意义[1-3] .目前有关核酶的研究在生物学领域中已成为新的热点[5，6] ，将核酶应用于基因治疗较其他反义技术具有更多优点:核酶具有较为稳定的空间结构，不易受RNase的攻击;单个核酶分子可与多个RNA分子结合并使其在特定部位断裂，而核酶本身并不消耗，可重复利用.正是基于核酶的众多优点，在肿瘤治疗方面，人们也开始有益的尝试，希望为肿瘤治疗提供了新的手段.
本实验将带有锤头状bcl-2核酶的可诱导的真核表达载体，通过脂质体介导方法转入SMMC7721培养细胞中，目的在于通过bcl-2核酶阻断bcl-2表达，观察bcl-2核酶对SMMC7721细胞的影响.结果表明，转染bcl-2核酶SMMC7721细胞Bcl-2表达水平显著下降，采用免疫组化方法未能检测出转染bcl-2核酶的SMMC7721细胞中有Bcl-2蛋白表达，从而证实bcl-2核酶能有效表达并封闭了bcl-2基因.经TRAP-PCR-ELISA检测，发现转染bcl-2核酶基因的SMMC7721细胞端粒酶活性显著降低.Bcl-2具有抑制细胞凋亡、延长细胞寿命的功能，而细胞端粒酶在端粒修复及维持、保持染色体稳定性方面起重要作用[7] ;尽管在大多数癌组织中发现端粒酶活化与bcl-2表达下调同时存在，但二者之间是否存在联系尚不清楚.有文献报道，细胞端粒酶活性与bcl-2，p53表达无关[6，8] ;也有文献认为，细胞端粒酶活性与bcl-2表达水平存在密切关系[5，7] .我们的结果表明，bcl-2核酶对肝癌细胞端粒酶活性有一定抑制作用，说明Bcl-2对细胞端粒酶活性有一定上调的作用，但其调节机制有待深入探讨.TUNEL检测结果表明，转染bcl-2核酶后，也可诱导细胞发生显著凋亡.Dorai等[5] 观察到bcl-2核酶对前列腺癌细胞有明显促凋亡作用，并认为运用bcl-2核酶治疗肿瘤是一种可行的有效方法.但也有人发现，bcl-2核酶对慢性髓细胞白血病细胞没有明显的促凋亡作用[6] .我们的结果与Dorai等[5] 观察到的结果相同.有关bcl-2核酶诱导细胞凋亡的机制，目前尚不清楚.Scheid等[6] 认为bcl-2核酶诱发凋亡并不是通过减少Bcl-2水平而是通过未知的机制来实现，但我们的结果并不支持这一观点.bcl-2抑制细胞凋亡有时需要bak或其他基因的协调作用[2] ，抑制了bcl-2表达，仍可能有其他抗凋亡基因继续发挥作用.故采用bcl-2核酶结合其他手段诱导癌细胞凋亡的效果可能更为显著.同时我们的结果还发现，bcl-2核酶在有效表达并封闭了bcl-2基因表达后，还伴有P16，P21表达水平的增加.有人认为Bcl-2高表达可以抑制P53介导的细胞凋亡、干扰P53 靶基因的转录活性[3] .而p21作为p53的下游基因，其转录活性常常受到p53调节;另一方面，p21又是依赖细胞周期蛋白激酶的抑制因子，参与细胞周期调控;同时细胞端粒酶活性也与细胞周期调控有关[9，10] .这就提示我们:通过bcl-2核酶封闭bcl-2mRNA的表达，导致Bcl-2表达水平的改变除可能影响细胞端粒酶活性，进而还可能间接通过p53调控p21的表达，影响细胞周期的调控.总之，bcl-2核酶在有效表达并封闭了bcl-2基因表达后，Bcl-2表达水平的改变有可能影响细胞端粒酶活性，进而影响到细胞端粒修复及维持、并降低染色体稳定性诱发细胞凋亡;同时也有可能通过p53继发性引起P21，P16表达增加，间接影响细胞周期调控.这些提示我们bcl-2与端粒酶之间可能存在的作用，和bcl-2与其他癌基因/抑癌基因间的作用相似，也有可能在肝癌的发生过程中起重要作用.
参考文献:
[1]Hockenbery DM，Oltvai ZN，Miliman CL，Korsmeyer SJ.Bcl-2function in an antioxidant pathway to prevent apoptosis [J].Cell，1993;75(2):241-251.
[2]Oltvai ZN，Milliman CL，Korsmeyer SJ.Bcl-2heterodimerizes in vivo with a conserved homolog，bax，that accelerates pro-grammed cell death [J].Cell，1993;74(4):609-619.
[3]Froesch BA，Aime SC，Leber B，Andrews D，Reed JC.Inhibi-tion of p53transcriptional activity by Bcl-2requires its mem-brance-anchoring domain [J].J Biol Chem，1999;274(10):6469-6475.
[4]Peng WD，Zhang J，Zhao YT，Hui HX，Zhu F，Yang AG，Wang CJ.Bcl-2mRNA targeting hammerhead ribozyme can ac-celerate apoptosis [J].Zhongguo Shengwu Huaxue Yu Fenzi Shengwu Xuebao(Chin J Biochem Mol)，2000;16(2):258-263.
[5]Dorai T，Goluboff ET，Osson CA，Buttyan R.Development of a hammerhead ribozyme against Bcl-2，Ⅱ，Ribozyme treatment sensitizes hormone-resistant prostate cancer cells to apoptotic a-gents [J].Anticancer Res，1997;17(5A):3307-3312.
[6]Scheid S，Heinzinger M，Waller CF，Lange W.Bcl-2mRNA-targeted ribozymes:Effects on programmed cell death in chronic myelogenous leukemia cell lines [J].Ann Hematol，1998;76(3-4):117-125.
[7]Mandal M，Kumar R.Bcl-2modulates telomerase activity [J].J Biol Chem，1997;272(2):14183-14187.
[8]Kunimura C，Kikuchi K，Ahmed N，Shimizu A，Yasumoto S.Telomerase activity in a specific cell subset co-expressing inte-grin beta l/EGFR but not p75NGFR/bcl-2/integrin beta4in normal human epithelial cells [J].Oncogene，1998;17(2):187-197.
[9]Okayasu I，Mitomi H，Yamashita K，Mikami T，Fujiwara M，Kato M，Oshimura M.Telomerase activity significantly corre-lates with cell differentiation，proliferation and lymph node metastasis in colorectal carcinomas [J].Cancer Res Clin Oncol，1998;124(8):444-449.
[10]Kallassy M，Martel N，Damour O，Yamasaki H，Nakazawa H.Growth arrest of immortalized human keratinocytes and suppres-sion of telomerase activity by p21
WAF1 gene expression [J].Mol Carcinog，1998;21(1):26-36.
编辑 井晓梅
第四军医大学: 1 西京医院病理科，
2 基础部生物化学教研室，陕西西安710033
作者简介: 张传山(1966-)，男(汉族)，天津市人.博士，讲师.Tel.(029)3374541Ext.115, http://www.100md.com(张传山 王文亮 彭玮丹 胡沛臻 柴玉波 张衍国)
摘 要:目的 观察bcl-2核酶对SMMC-7721细胞的作用，探讨bcl-2表达水平的改变对细胞端粒酶活性的影响. 方法 经脂质体介导的方法将PMTr-neo(正向bcl-2核酶真核表达载体)导入SMMC7721细胞中，细胞克隆转移扩大培养后，采用TUNEL，TRAP-PCR-ELISA，免疫组化技术结合图像分析技术检测SMMC7721/PMTr-neo细胞凋亡、细胞端粒酶活性及P16，P21的改变. 结果 较对照组SMMC7721/PMTr-neo细胞Bcl-2表达水平显著下降，伴有显著细胞凋亡现象;同时端粒酶活性下降，P16，P21表达水平显著增加. 结论 bcl-2核酶可促进SMMC7721细胞发生凋亡，并降低细胞端粒酶活性，提示Bcl-2表达水平的改变对细胞端粒酶活性有一定的影响.
bcl┐2ribozyme reduces telomerase activity of SMMC7721cells
ZHANG Chuan-Shan WANG Wen-Liang PENG Wei-Dan HU Pei-Zhen CHAI Yu-Bo ZHANG Yan-Guo
1 Department of Pathology，Xijing Hospital，
2 Department of Biochemistry，Faculty of Preclinical Medicine，Fourth Military Medical University，Xi'an710033，China
Keywords:liver neoplasms;bcl-2;ribozyme;apoptosis
Abstract:AIM To observe the effect of bcl-2ribozyme on SMMC7721cells and to investigate bcl-2expression on cellu-lar apoptosis and telomerase activity.METHODS PMTr-neo(sense bcl-2ribozyme eucaryotic expression vector)was introduced into SMMC7221cells by using lipofectin media-tion，after cloning TUNEL and TRAP in combination of ELISA and IHC in combination of imaging analysis was used to determine SMMC7721/PMTr-neo apoptosis and telom-erase activity.RESULTS Compared with control，SMMC7721/PMTr-neo presented a significant drop in bcl-2expression and an increase in P16and P21expression，accom-panied by a decline in remarkable apoptosis and telomerase activity.CONCLUSION bcl-2ribozyme promotes apoptosis of SMMC7721cells and reduces telomerase activity.These provide a theoretical basis for applying antisense technique to treatment of hepatocarcinoma.
0 引言
抗凋亡蛋白Bcl-2在肿瘤发生过程中有着重要意义.自从Vaux首次证实bcl-2高表达可以诱发肿瘤后，人们对其进行深入研究，发现bcl-2可以抑制细胞凋亡、延长细胞生存期[1-3] 人们对bcl-2与肝癌的关系也进行了探讨，认为它与肝癌的发生也存在密切关系.目前有关核酶的研究在生物学领域中已成为新的热点:一方面可以利用核酶来研究特定基因的功能，因而其在基因表达调控研究中倍受重视;另一方面将核酶应用于基因治疗较其他反义技术具有更多优点.在肿瘤治疗方面，人们也开始有益的尝试，希望核酶能为肿瘤治疗提供新的有效手段.我们采用脂质体介导的基因转移方法，将bcl-2核酶导入人肝癌细胞株SMMC7721细胞中，结合TUNEL，TRAP-PCR-ELISA及免疫组化等技术观察bcl-2核酶对SMMC7721细胞的影响，为肿瘤基因治疗提供理论依据.
1 材料和方法
1.1 材料 大肠杆菌JM109由本校生物化学教研室惠赠;PMTr-neo质粒(含bcl-2核酶)由彭玮丹博士构建[4] ;核酸内切酶购自Promega公司;脂质体转染试剂盒购自Gibico公司;凋亡检测试剂盒购自Boehringer Mannheim公司;SMMC7721细胞由本室保存培养.
1.2 方法
1.2.1 PMTr-neo转染SMMC7721细胞 ①PMTr-neo质粒的鉴定:将PMTr-neo质粒转化JM109大肠杆菌，扩增提取质粒，经核酸内切酶BamHI，EcoRI双酶切后，电泳鉴定bcl-2核酶片段大小正确.②PMTr-neo转染SMMC7721细胞:把处于对数生长期的SMMC7721细胞分为两组:对照组(SMMC7721细胞)、实验组(转染PMTr-neo的SMMC7721细胞)，转染方法按脂质体转染试剂盒操作步骤说明进行，培养48h后传代，加入含G418550mg L-1 的培养液，筛选抗性细胞.继续培养2wk后，可见细胞克隆形成，继续扩大培养.③SMMC7721/PMTr-neo细胞的鉴定:细胞克隆扩大培养后，制作细胞爬片，用100μmol L-1 硫酸锌诱导bcl-2核酶表达.48h后，丙酮固定，免疫组化检测.Bcl-2单抗购自博士德生物公司，免疫组化按照DAKO公司Envi-sionTM +System，HRP试剂盒说明进行.免疫组化检测步骤如下:①30mL L-1 H2 O2 甲醇封闭30min;②3mL L-1 BSA封闭30min;③加一抗4℃过夜;④加DAKO EnvisionTM +System，HRP，mouse，(R4001);⑤显色，苏木精衬染封片.以上步骤均用PBS缓冲液洗涤，光镜下观察结果.同时设立对照实验.
1.2.2 bcl-2核酶对SMMC7721细胞作用 ①TUNEL检测:细胞克隆扩大培养后，细胞爬片，用100μmol L-1 硫酸锌诱导bcl-2核酶表达.48h后，丙酮固定，检测细胞凋亡情况.实验操作步骤参照In Situ Cell Death Detection Kit，AP操作说明进行.②TRAP-PCR-ELISA端粒酶活性检测:分别收集用100μmol L-1 硫酸锌诱导表达48h的1×107 对照组细胞、实验组细胞，进行细胞端粒酶活性检测.细胞端粒酶活性检测按照TRA-PCR-ELISA.AP试剂盒操作说明书进行.在DYNATECH MR400仪器上检测波长为450nm/630nm处各组细胞的吸光度(A).参照试剂盒结果判别说明，证实检测结果有效.③P16，P21免疫组化检测:细胞克隆扩大培养后，细胞爬片，用100μmol L-1 硫酸锌诱导bcl-2核酶表达.48h后，丙酮固定，免疫组化检测.P16，P21单抗购自中山生物公司，免疫组化检测步骤同上述.在高倍视野(×400)下，选择5个视野，分别计数200个细胞，并应用HPIAS-1000图文报告管理系统进行处理，检测细胞平均吸光度(A).
统计学处理:将所得各种实验数据结果，分别进行统计学处理.其中有关率的变化采用χ2 检验，有关x ±s，采用t检验.
2 结果
2.1 TUNEL检测 光镜观察可见SMMC7721/PMTr-neo较对照组细胞凋亡数量显著增多(Fig1，2)，在高倍视野(×400)下，选择5个视野分别计数200个细胞，统计凋亡细胞所占百分比，发现实验组凋亡细胞(24±4)/200(12.0±2.0)%，比对照组(8±4)/200(4.0±2.0)%明显增多(P<0.01，χ2 =7.643).
图1 - 图2 略
2.2 TRAP┐PCR┐ELISA端粒酶活性检测 结果显示，SMMC7721细胞表达高水平的端粒酶活性，吸光度(A450 -A630 )为2.861，而转染bcl-2核酶的细胞SMMC7721/PMTr-neo端粒酶活性表达显著下降，吸光度(A450 -A630 )仅为0.980.说明转染bcl-2核酶对SMMC7721细胞端粒酶活性有一定影响.
2.3 Bcl┐2，P16，P21组化检测 在SMMC7721/PMTr-neo细胞中，未能检测到Bcl-2蛋白，而对照组Bcl-2结果为阳性，说明在Zn2+ 诱导下bcl-2核酶有效表达，在转录水平上封闭了bcl-2表达.光镜观察可见SMMC7721/PMTr-neo较对照组细胞P16，P21蛋白表达水平显著增高，组化结果呈强阳性.应用图像分析仪测定免疫组化染色p16，p21阳性细胞吸光度(A)，实验组为:0.18±0.02，0.19±0.03，对照组为:0.23±0.06，0.26±0.02.实验组较对照组显著增高(P<0.05).
3 讨论
凋亡是细胞死亡的一种生理机制，在调节组织内环境稳定过程中起重要作用.凋亡的调节是一种非常复杂的过程，涉及到许多癌基因与抑癌基因的表达.Bcl-2是肿瘤研究中最受关注的抑制凋亡蛋白，认为其在肿瘤发生中有重要意义[1-3] .目前有关核酶的研究在生物学领域中已成为新的热点[5，6] ，将核酶应用于基因治疗较其他反义技术具有更多优点:核酶具有较为稳定的空间结构，不易受RNase的攻击;单个核酶分子可与多个RNA分子结合并使其在特定部位断裂，而核酶本身并不消耗，可重复利用.正是基于核酶的众多优点，在肿瘤治疗方面，人们也开始有益的尝试，希望为肿瘤治疗提供了新的手段.
本实验将带有锤头状bcl-2核酶的可诱导的真核表达载体，通过脂质体介导方法转入SMMC7721培养细胞中，目的在于通过bcl-2核酶阻断bcl-2表达，观察bcl-2核酶对SMMC7721细胞的影响.结果表明，转染bcl-2核酶SMMC7721细胞Bcl-2表达水平显著下降，采用免疫组化方法未能检测出转染bcl-2核酶的SMMC7721细胞中有Bcl-2蛋白表达，从而证实bcl-2核酶能有效表达并封闭了bcl-2基因.经TRAP-PCR-ELISA检测，发现转染bcl-2核酶基因的SMMC7721细胞端粒酶活性显著降低.Bcl-2具有抑制细胞凋亡、延长细胞寿命的功能，而细胞端粒酶在端粒修复及维持、保持染色体稳定性方面起重要作用[7] ;尽管在大多数癌组织中发现端粒酶活化与bcl-2表达下调同时存在，但二者之间是否存在联系尚不清楚.有文献报道，细胞端粒酶活性与bcl-2，p53表达无关[6，8] ;也有文献认为，细胞端粒酶活性与bcl-2表达水平存在密切关系[5，7] .我们的结果表明，bcl-2核酶对肝癌细胞端粒酶活性有一定抑制作用，说明Bcl-2对细胞端粒酶活性有一定上调的作用，但其调节机制有待深入探讨.TUNEL检测结果表明，转染bcl-2核酶后，也可诱导细胞发生显著凋亡.Dorai等[5] 观察到bcl-2核酶对前列腺癌细胞有明显促凋亡作用，并认为运用bcl-2核酶治疗肿瘤是一种可行的有效方法.但也有人发现，bcl-2核酶对慢性髓细胞白血病细胞没有明显的促凋亡作用[6] .我们的结果与Dorai等[5] 观察到的结果相同.有关bcl-2核酶诱导细胞凋亡的机制，目前尚不清楚.Scheid等[6] 认为bcl-2核酶诱发凋亡并不是通过减少Bcl-2水平而是通过未知的机制来实现，但我们的结果并不支持这一观点.bcl-2抑制细胞凋亡有时需要bak或其他基因的协调作用[2] ，抑制了bcl-2表达，仍可能有其他抗凋亡基因继续发挥作用.故采用bcl-2核酶结合其他手段诱导癌细胞凋亡的效果可能更为显著.同时我们的结果还发现，bcl-2核酶在有效表达并封闭了bcl-2基因表达后，还伴有P16，P21表达水平的增加.有人认为Bcl-2高表达可以抑制P53介导的细胞凋亡、干扰P53 靶基因的转录活性[3] .而p21作为p53的下游基因，其转录活性常常受到p53调节;另一方面，p21又是依赖细胞周期蛋白激酶的抑制因子，参与细胞周期调控;同时细胞端粒酶活性也与细胞周期调控有关[9，10] .这就提示我们:通过bcl-2核酶封闭bcl-2mRNA的表达，导致Bcl-2表达水平的改变除可能影响细胞端粒酶活性，进而还可能间接通过p53调控p21的表达，影响细胞周期的调控.总之，bcl-2核酶在有效表达并封闭了bcl-2基因表达后，Bcl-2表达水平的改变有可能影响细胞端粒酶活性，进而影响到细胞端粒修复及维持、并降低染色体稳定性诱发细胞凋亡;同时也有可能通过p53继发性引起P21，P16表达增加，间接影响细胞周期调控.这些提示我们bcl-2与端粒酶之间可能存在的作用，和bcl-2与其他癌基因/抑癌基因间的作用相似，也有可能在肝癌的发生过程中起重要作用.
参考文献:
[1]Hockenbery DM，Oltvai ZN，Miliman CL，Korsmeyer SJ.Bcl-2function in an antioxidant pathway to prevent apoptosis [J].Cell，1993;75(2):241-251.
[2]Oltvai ZN，Milliman CL，Korsmeyer SJ.Bcl-2heterodimerizes in vivo with a conserved homolog，bax，that accelerates pro-grammed cell death [J].Cell，1993;74(4):609-619.
[3]Froesch BA，Aime SC，Leber B，Andrews D，Reed JC.Inhibi-tion of p53transcriptional activity by Bcl-2requires its mem-brance-anchoring domain [J].J Biol Chem，1999;274(10):6469-6475.
[4]Peng WD，Zhang J，Zhao YT，Hui HX，Zhu F，Yang AG，Wang CJ.Bcl-2mRNA targeting hammerhead ribozyme can ac-celerate apoptosis [J].Zhongguo Shengwu Huaxue Yu Fenzi Shengwu Xuebao(Chin J Biochem Mol)，2000;16(2):258-263.
[5]Dorai T，Goluboff ET，Osson CA，Buttyan R.Development of a hammerhead ribozyme against Bcl-2，Ⅱ，Ribozyme treatment sensitizes hormone-resistant prostate cancer cells to apoptotic a-gents [J].Anticancer Res，1997;17(5A):3307-3312.
[6]Scheid S，Heinzinger M，Waller CF，Lange W.Bcl-2mRNA-targeted ribozymes:Effects on programmed cell death in chronic myelogenous leukemia cell lines [J].Ann Hematol，1998;76(3-4):117-125.
[7]Mandal M，Kumar R.Bcl-2modulates telomerase activity [J].J Biol Chem，1997;272(2):14183-14187.
[8]Kunimura C，Kikuchi K，Ahmed N，Shimizu A，Yasumoto S.Telomerase activity in a specific cell subset co-expressing inte-grin beta l/EGFR but not p75NGFR/bcl-2/integrin beta4in normal human epithelial cells [J].Oncogene，1998;17(2):187-197.
[9]Okayasu I，Mitomi H，Yamashita K，Mikami T，Fujiwara M，Kato M，Oshimura M.Telomerase activity significantly corre-lates with cell differentiation，proliferation and lymph node metastasis in colorectal carcinomas [J].Cancer Res Clin Oncol，1998;124(8):444-449.
[10]Kallassy M，Martel N，Damour O，Yamasaki H，Nakazawa H.Growth arrest of immortalized human keratinocytes and suppres-sion of telomerase activity by p21
WAF1 gene expression [J].Mol Carcinog，1998;21(1):26-36.
编辑 井晓梅
第四军医大学: 1 西京医院病理科，
2 基础部生物化学教研室，陕西西安710033
作者简介: 张传山(1966-)，男(汉族)，天津市人.博士，讲师.Tel.(029)3374541Ext.115, http://www.100md.com(张传山 王文亮 彭玮丹 胡沛臻 柴玉波 张衍国)