重组水蛭素局部治疗兔髂总动脉球囊扩张术后内膜增殖和管腔狭窄
关键词: 血管成形术;局部治疗;重组水蛭素;管腔狭窄;内膜增殖
摘 要:目的 探讨重组水蛭素经多孔球囊导管局部治疗对兔髂总动脉球囊扩张术后内膜增殖和管腔狭窄的影响. 方法 24只纯种日本大耳白兔随机分成对照组(n=12)和重组水蛭素局部治疗组(n=12)，采用兔髂总动脉球囊扩张术后内膜增殖和管腔狭窄动物模型，治疗组经多孔球囊导管于球囊扩张局部在2个大气压下给予重组水蛭素(13.8×106 抗凝血酶单位·g-1 )1mg·kg-1 ，对照组给予生理盐水.术后2wk和4wk复查血管造影，术后4wk取髂总动脉标本行HE染色、Masson三色染色、平滑肌肌动蛋白(α-actin)免疫组织化学染色和增殖细胞核抗原(PCNA)免疫组织化学染色，并进行计算机图像分析. 结果 治疗组术后2wk和4wk平均髂总动脉直径均较对照组显著扩大[2wk(86±5)%vs(56±10)%，P<0.01;4wk(77±13)%vs(56±10)%，P<0.01]，术后2wk和4wk平均髂总动脉面积亦显著增加.术后4wk治疗组球囊扩张血管管腔面积较对照组显著增加[(37±5)%vs(16±5)%，P<0.01]，管壁面积显著减少[(63±5)%vs(84±5)%，P<0.01]，其中主要是内膜面积的减少[(7±1)%vs(38±10)%，P<0.01].术后4wk治疗组球囊扩张血管壁α-actin和PCNA免疫组化染色阳性细胞均较对照组明显减少. 结论 重组水蛭素经多孔球囊导管局部治疗可显著减轻兔髂总动脉球囊扩张术后新生内膜增殖和管腔狭窄.
Effectiveness of recombinant hirudin locally deliv┐ered via a porous balloon on reducing neointimal proliferation and luminal stenosis after balloon an┐gioplasty in a rabbit model
TIAN Jian-Wei，ZHAO Lian-You，ZHENG Qiang-Sun，LIU Chao-Zhong，JIANG Yi-Qing，CHEN Hong，PIAO Long-Song
1 Department of Cardiovasology，Tangdu Hospital，Fourth Military Medical University，Xi'an710038，China，2 Department of Cardiovasology，General Hospital of Air Force，Beijing100036，China，3 Department of Cardiovasology，Air Force466Hos-pital，Beijing10036，China
Keywords:angioplasty;local therapy;recombinant hirudin;luminal stenosis;neointimal proliferation
Abstract:AIM To evaluate the effectiveness of recombinant hirudin(r-hirudin)locally delivered via a porous balloon on reducing neointimal proliferation and luminal stenosis after balloon angioplasty in rabbits.METHODS 24rabbits were randomized into r-hirudin group(n=12)and control group(n=12)，Balloon angioplasty were performed on rabbits nor-mal iliac arterial model.R-hirudin group received1mg·kg-1 r-hirudin [13.8×106 ATU(antithrobin unit)·g-1 ]via a porous balloon，while control group received normal saline.Angiograms were performed at2weeks and4weeks after procedure.Rabbits were killed and arteries were obtained at4weeks after angioplasty.For morphometric analysis，sec-tions of arteries were performed with HE staining，Masson staining，proliferation cell nuclear antigen(PCNA)and vas-cular smooth muscle cellα-actin immunohistochemical stain┐ing.RESULTS The mean common iliac arterial luminal di-ameter of r-hirudin group was significantly increased at2weeks [(86±5)%vs(56±10)%，P<0.01]and4weeks [(77±13)%vs(56±10)%，P<0.01]after angioplasty.At4weeks after angioplasty，there were the greater luminal ar-eas [(37±5)%vs(16±5)%，P<0.01]and the less neointi-mal areas in r-hirudin group [(7±1)%vs(38±10)%，P<0.01]than in control group.In addition，theα-actin positive cells and PCNA positive cells in r-hirudin group were less than that in control group.CONCLUSION r-hirudin locally delivered could significantly lessen neointimal proliferation and luminal stenosis of iliac arteries after balloon angioplasty in rabbits.
0 引言
经皮冠状动脉腔内血管成形术(percutaneous transluminal coronary angioplasty，PTCA)后0.5a内扩张部位再狭窄(restenosis，RS)的发生率高达30%左右[1，2] ，成为影响PTCA术远期效果的主要因素.RS的发生是众多因素相互作用的非常复杂的过程，目前认为，球囊扩张损伤以后，血管内膜下基质暴露，血液凝固系统激活，使血液中凝血酶水平迅速增高，强有力地刺激血小板沉积和活化，活化的血小板释放、激活多种生长因子和趋化因子，促使血管平滑肌细胞的迁移和增殖并导致管腔狭窄，而且凝血酶本身也有强的促使血管平滑肌细胞的迁移和增殖作用，因此，凝血酶在RS的发生中起到了重要的始动作用.重组水蛭素可以直接和凝血酶结合形成牢固的复合体从而抑制凝血酶的全部活性，球囊扩张术后给予国产重组水蛭素可以明显抑制平滑肌细胞增殖和再狭窄的发生[3] .PTCA时局部用药是一种更为安全有效的给药方法，经多孔球囊已成功地进行了多种药物的球囊扩张损伤局部血管壁内释放，使损伤血管壁局部药物浓度增加及作用时间延长.本实验旨在探讨经球囊导管局部释放国产重组水蛭素对兔髂动脉球囊损伤后内膜增殖和管腔狭窄的影响.
1 材料和方法
1.1 材料
国产重组水蛭素[大连高新生物制药公司惠赠，比活性为13.8×106 抗凝血酶单位(an-tithrombin unit，ATU)·g-1 ];鼠抗兔平滑肌肌动蛋白α-actin单克隆抗体、鼠抗兔增殖细胞核抗原(proliferation cell nuclear antigen，PCNA)单克隆抗体和免疫组化SP试剂盒均为博士德公司产品;图像分析仪(LEICA Q550IW)为德国产品.
1.2 模型建立和分组
选用纯种日本大耳白兔24只，平均体质量(2.95±0.25)kg，雌雄不拘.随机分成对照组(12只)和重组水蛭素局部治疗组(12只)，动物在喂养1wk后开始实验.用846合剂0.2mg·kg-1 加氯胺酮50mg im麻醉后，在外科无菌条件下分离切开右侧股动脉，注入10mg·L-1 的利多卡因2mL减少血管痉挛，于透视下送入冠脉球囊导管(3.0mm×20mm，Cordis公司)至右髂总动脉开口处下方，6个大气压下扩张60s，共扩张3次，每次间隔1min [3] .扩张前及扩张后即刻造影拍片.然后撤除球囊导管，结扎动脉，缝合皮肤.两组动物均于球囊扩张术后2wk和4wk重复血管造影.
1.3 治疗组处理
治疗组于球囊扩张术后即刻在X线透视下将多孔球囊导管(3.0mm×20mm，20小孔 呈螺旋状排列，小孔直径约10μm)送至扩张部位，在2个大气压下经导管给予国产重组水蛭素1mg·kg-1 ，对照组经多孔球囊导管给予生理盐水.两组动物均于穿刺成功后给予肝素150IU·kg-1 抗凝.
1.4 组织标本制作
术后4wk实验动物于动脉造影后行侧腹切开，显露腹主动脉和下腔静脉，分别插入16号针管，其中动脉针管与恒压灌注装置相接，用13.3kPa恒压生理盐水灌注，至静脉流出液清亮为止，然后以40g·L-1 多聚甲醛13.3kPa恒压动脉灌注15min，使动脉在生理压力下固定，自髂总动脉起始部起左右两侧各取10mm的标本，接着放入多聚甲醛液中固定24h.标本以石蜡包埋、切片，行HE染色、Masson三色染色、Actin(VSMC)和PCNA免疫组织化学染色，显微镜下观察并行计算机彩色图像分析.
1.5 计算机彩色图像分析
采用LEICA Q550IW图像分析系统测定管腔面积、内弹力板围绕面积和外弹力板围绕面积.以内弹力板围绕面积减管腔面积为内膜面积，以外弹力板围绕面积减内弹力板围绕面积为中膜面积.
统计学处理:实验数据以x ±s表示，采用SPSS软件做统计学处理，组间差异采用t检验.
2 结果
2.1 造影结果
血管直径以造影时血管最狭窄处直径与球囊扩张术前该血管直径的比值表示，血管面积以血管直径的平方表示.对照组术后2wk和术后4wk平均髂总动脉直径分别为(56±10)%和(45±12)%，平均面积分别为(32±11)%和(21±11)%，均较术前明显降低.重组水蛭素局部治疗组术后2wk平均髂总动脉直径为(86±5)%，平均面积为(74±9)%，均较对照组显著扩大(P<0.01)，术后4wk平均髂总动脉直径为(77±13)%，平均面积为(61±18)%，亦较对照组显著扩大(P<0.01，Fig1).
2.2 术后4wk病理结果及其计算机彩色图像分析
显微镜下正常兔髂总动脉壁分为内膜、中膜和外膜，三者分界清楚.内膜和中膜以呈波浪状的内弹力板为界，内膜为单层内皮细胞及其基质，中膜的主要成分是平滑肌细胞(VSMC)，呈长梭形，以管腔为中心同心圆排列，中膜与外膜以外弹力板为界.球囊扩张后血管均显示弥漫性内膜增厚，对照组内膜增生组织使管腔高度狭窄甚至几近完全闭塞，增生内膜以增殖的平滑肌细胞为主，且细胞外的胶原和弹力纤维亦明显增加，重组水蛭素经多孔球囊局部用药组内膜增生相对较轻.
HE染色病理切片计算机彩色图像分析显示:对照组和重组水蛭素局部用药组未扩张侧髂动脉管腔面积占血管总面积的百分比分别为(39±4)%和(41±9)%，两组间无显著差异(P>0.05);血管壁面积=中膜面积，占血管总面积的百分比分别为(61±4)%和(59±9)%，两组间亦无显著差异(P>0.05).对照组球囊扩张侧髂动脉管腔面积为(16±5)%，与未扩张侧相比显著减少(P<0.01)，血管壁面积=内膜面积+中膜面积，血管壁面积及内膜面积分别为(84±5)%和(38±10)%，均显著增加(P<0.01)，中膜面积无明显改变(P>0.05);重组水蛭素局部用药组髂动脉血管腔面积与对照组相比显著扩大[(37±5)%vs(16±5)%，P<0.01]，血管壁面积则显著减少[(63±5)%vs(84±5)%，P<0.01]，其中主要是内膜面积的减少[(7±1)%vs(38±10)%，P<0.01]，而中膜面积与对照组相比无明显差异[(56±5)%vs(46±7)%，P>0.05](Fig2).
Masson染色血管平滑肌细胞(VSMC)呈红色而胶原蛋白呈蓝色，正常兔髂总动脉VSMC仅见于中膜，胶原蛋白可见于中膜VSMC周围及血管外膜.球囊扩张后可见兔髂总动脉内膜增殖，增殖内膜中出现大量排列紊乱呈红色染色的VSMC和呈蓝色染色的胶原蛋白.Actin(VSMC)免疫组化染色阳性颗粒呈棕黄色，仅存在于正常血管的中膜，球囊扩张损伤后血管的Actin阳性细胞明显增加，并在增殖的内膜中大量出现，重组水蛭素组Actin阳性颗粒明显少于对照组.PCNA免疫组化染色阳性颗粒呈棕黄色，出现于增殖活跃细胞核内，正常血管中可见极少部分细胞PCNA染色阳性，对照组球囊扩张损伤后管壁PCNA阳性细胞明显增多，并大量出现于增殖的内膜中，而重组水蛭素组则PCNA阳性细胞相对较少.
3 讨论
Haycraft于1884年发现医用水蛭提取物中含有抗凝物质，20世纪50年代末Markwardt首次分离出其有效成分并命名为水蛭素.天然水蛭素可特异性地与凝血酶以等摩尔形成紧密的复合物，其解离常数Ki非常小，是迄今为止发现的作用最强的天然特效凝血酶抑制剂[4] .但天然水蛭素的提取步骤繁琐，且医用水蛭饲养困难、来源匮乏，难以得到足够量的纯品，使研究和临床应用受到限制.国产重组水蛭素是利用生物工程技术在酵母中大量表达生产的非硫化水蛭素变异体Ⅰ(Try63 位未硫化)，为65肽蛋白质，氨基酸序列除了N末端为异亮氨酸和63位酪氨酸无硫酸酯基团外，其他氨基酸序列均与天然水蛭素相同，其空间结构和抗凝血酶作用与天然水蛭素类似[5] .国产重组水蛭素的比活性与Hoechst Marion Roussel公司生产的REFLUDIN(Lepirudin)相近，且生产成本相对较为低廉，为抗栓治疗提供了一种新的选择.文献报道，血管在球囊扩张损伤后，血管内皮下组织暴露于血流之中，使得凝血系统激活，血液中和损伤血管局部凝血酶水平明显升高，球囊扩张术后静脉给予国产重组水蛭素可以明显抑制平滑肌细胞增殖和管腔狭窄的发生[3] .本实验在兔髂总动脉球囊扩张损伤后短期经多孔导管局部给予国产重组水蛭素治疗，可以明显减少术后2wk和4wk动脉管腔的狭窄，抑制血管壁Actin(VSMC)和PCNA表达，显著抑制动脉内膜增殖和平滑肌细胞增生，扩大血管腔面积.
PTCA术后局部用药是一种较全身用药更为安全有效的给药方法，经多孔球囊导管局部给药是在一定压力作用下将药物经囊壁小孔渗射入动脉壁，药物在血管损伤局部渗透释放，使损伤血管壁局部药物浓度增加，药物的作用时间延长，药物用量减少和副作用减轻 [6-8] .经多孔球囊导管在血管损伤局部给予重组水蛭素不仅抑制了血浆中凝血酶的作用，而且抑制损伤血管局部产生凝血酶的作用，使球囊扩张损伤后动脉血管内膜增殖明显减轻，抑制平滑肌细胞增殖和迁移.重组水蛭素抑制损伤后动脉内膜增殖减少管腔的狭窄的可能通过以下机制:①抑制血管损伤局部血液凝固及附壁血栓形成，消除由于血栓形成及以后机化导致的损伤局部血管再狭窄的形成及进展[9，10] ;②重组水蛭素可抑制凝血酶介导的血小板活化和凝集，从而抑制血小板活化并释放多种生物活性物质尤其是血小板衍生生长因子(PDGF)导致的平滑肌细胞增殖和迁移作用[11，12] ;③凝血酶具有直接促进平滑肌细胞增殖和迁移作用 [13，14] ，重组水蛭素可抑制其作用;④凝血酶具有促进血管平滑肌细胞合成与分泌细胞外基质的作用，重组水蛭素通过抑制凝血酶的作用而抑制细胞外基质的合成及分泌，从而减轻血管内膜增厚和管腔狭窄 [15] ;⑤抑制凝血酶介导的局部炎性细胞聚集和炎性细胞之间的相互作用 [16] ，从而抑制炎性细胞释放细胞因子导致的血管损伤局部平滑肌细胞增殖内膜的增厚.
总之，凝血酶在球囊扩张术后内膜增殖和管腔狭窄的发生过程中起着非常重要的作用，球囊扩张术后经多孔导管在损伤血管局部给予重组水蛭素治疗，可特异性抑制凝血酶的作用，抑制血管平滑肌细胞增殖和迁移，显著减轻动脉新生内膜增殖和管腔的狭窄，有望成为临床预防PTCA术后再狭窄的一种很有前途的治疗方法.
参考文献:
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作者简介: 田建伟(1972-)，男(汉族)，陕西省华阴市人.博士生(导师赵连友)，主治医师.Tel.(029)3577633 Email.Tianjianwei@263.net
(1 第四军医大学唐都医院心血管内科，陕西西安710038，2 空军总医院心血管内科，北京100036，3 空军第466医院心血管内科，北京100083)
编辑 王 睿
收稿日期:2001-08-22, 百拇医药(田建伟，赵连友，郑强荪，刘朝中，江一清，陈宏，朴龙松)
摘 要:目的 探讨重组水蛭素经多孔球囊导管局部治疗对兔髂总动脉球囊扩张术后内膜增殖和管腔狭窄的影响. 方法 24只纯种日本大耳白兔随机分成对照组(n=12)和重组水蛭素局部治疗组(n=12)，采用兔髂总动脉球囊扩张术后内膜增殖和管腔狭窄动物模型，治疗组经多孔球囊导管于球囊扩张局部在2个大气压下给予重组水蛭素(13.8×106 抗凝血酶单位·g-1 )1mg·kg-1 ，对照组给予生理盐水.术后2wk和4wk复查血管造影，术后4wk取髂总动脉标本行HE染色、Masson三色染色、平滑肌肌动蛋白(α-actin)免疫组织化学染色和增殖细胞核抗原(PCNA)免疫组织化学染色，并进行计算机图像分析. 结果 治疗组术后2wk和4wk平均髂总动脉直径均较对照组显著扩大[2wk(86±5)%vs(56±10)%，P<0.01;4wk(77±13)%vs(56±10)%，P<0.01]，术后2wk和4wk平均髂总动脉面积亦显著增加.术后4wk治疗组球囊扩张血管管腔面积较对照组显著增加[(37±5)%vs(16±5)%，P<0.01]，管壁面积显著减少[(63±5)%vs(84±5)%，P<0.01]，其中主要是内膜面积的减少[(7±1)%vs(38±10)%，P<0.01].术后4wk治疗组球囊扩张血管壁α-actin和PCNA免疫组化染色阳性细胞均较对照组明显减少. 结论 重组水蛭素经多孔球囊导管局部治疗可显著减轻兔髂总动脉球囊扩张术后新生内膜增殖和管腔狭窄.
Effectiveness of recombinant hirudin locally deliv┐ered via a porous balloon on reducing neointimal proliferation and luminal stenosis after balloon an┐gioplasty in a rabbit model
TIAN Jian-Wei，ZHAO Lian-You，ZHENG Qiang-Sun，LIU Chao-Zhong，JIANG Yi-Qing，CHEN Hong，PIAO Long-Song
1 Department of Cardiovasology，Tangdu Hospital，Fourth Military Medical University，Xi'an710038，China，2 Department of Cardiovasology，General Hospital of Air Force，Beijing100036，China，3 Department of Cardiovasology，Air Force466Hos-pital，Beijing10036，China
Keywords:angioplasty;local therapy;recombinant hirudin;luminal stenosis;neointimal proliferation
Abstract:AIM To evaluate the effectiveness of recombinant hirudin(r-hirudin)locally delivered via a porous balloon on reducing neointimal proliferation and luminal stenosis after balloon angioplasty in rabbits.METHODS 24rabbits were randomized into r-hirudin group(n=12)and control group(n=12)，Balloon angioplasty were performed on rabbits nor-mal iliac arterial model.R-hirudin group received1mg·kg-1 r-hirudin [13.8×106 ATU(antithrobin unit)·g-1 ]via a porous balloon，while control group received normal saline.Angiograms were performed at2weeks and4weeks after procedure.Rabbits were killed and arteries were obtained at4weeks after angioplasty.For morphometric analysis，sec-tions of arteries were performed with HE staining，Masson staining，proliferation cell nuclear antigen(PCNA)and vas-cular smooth muscle cellα-actin immunohistochemical stain┐ing.RESULTS The mean common iliac arterial luminal di-ameter of r-hirudin group was significantly increased at2weeks [(86±5)%vs(56±10)%，P<0.01]and4weeks [(77±13)%vs(56±10)%，P<0.01]after angioplasty.At4weeks after angioplasty，there were the greater luminal ar-eas [(37±5)%vs(16±5)%，P<0.01]and the less neointi-mal areas in r-hirudin group [(7±1)%vs(38±10)%，P<0.01]than in control group.In addition，theα-actin positive cells and PCNA positive cells in r-hirudin group were less than that in control group.CONCLUSION r-hirudin locally delivered could significantly lessen neointimal proliferation and luminal stenosis of iliac arteries after balloon angioplasty in rabbits.
0 引言
经皮冠状动脉腔内血管成形术(percutaneous transluminal coronary angioplasty，PTCA)后0.5a内扩张部位再狭窄(restenosis，RS)的发生率高达30%左右[1，2] ，成为影响PTCA术远期效果的主要因素.RS的发生是众多因素相互作用的非常复杂的过程，目前认为，球囊扩张损伤以后，血管内膜下基质暴露，血液凝固系统激活，使血液中凝血酶水平迅速增高，强有力地刺激血小板沉积和活化，活化的血小板释放、激活多种生长因子和趋化因子，促使血管平滑肌细胞的迁移和增殖并导致管腔狭窄，而且凝血酶本身也有强的促使血管平滑肌细胞的迁移和增殖作用，因此，凝血酶在RS的发生中起到了重要的始动作用.重组水蛭素可以直接和凝血酶结合形成牢固的复合体从而抑制凝血酶的全部活性，球囊扩张术后给予国产重组水蛭素可以明显抑制平滑肌细胞增殖和再狭窄的发生[3] .PTCA时局部用药是一种更为安全有效的给药方法，经多孔球囊已成功地进行了多种药物的球囊扩张损伤局部血管壁内释放，使损伤血管壁局部药物浓度增加及作用时间延长.本实验旨在探讨经球囊导管局部释放国产重组水蛭素对兔髂动脉球囊损伤后内膜增殖和管腔狭窄的影响.
1 材料和方法
1.1 材料
国产重组水蛭素[大连高新生物制药公司惠赠，比活性为13.8×106 抗凝血酶单位(an-tithrombin unit，ATU)·g-1 ];鼠抗兔平滑肌肌动蛋白α-actin单克隆抗体、鼠抗兔增殖细胞核抗原(proliferation cell nuclear antigen，PCNA)单克隆抗体和免疫组化SP试剂盒均为博士德公司产品;图像分析仪(LEICA Q550IW)为德国产品.
1.2 模型建立和分组
选用纯种日本大耳白兔24只，平均体质量(2.95±0.25)kg，雌雄不拘.随机分成对照组(12只)和重组水蛭素局部治疗组(12只)，动物在喂养1wk后开始实验.用846合剂0.2mg·kg-1 加氯胺酮50mg im麻醉后，在外科无菌条件下分离切开右侧股动脉，注入10mg·L-1 的利多卡因2mL减少血管痉挛，于透视下送入冠脉球囊导管(3.0mm×20mm，Cordis公司)至右髂总动脉开口处下方，6个大气压下扩张60s，共扩张3次，每次间隔1min [3] .扩张前及扩张后即刻造影拍片.然后撤除球囊导管，结扎动脉，缝合皮肤.两组动物均于球囊扩张术后2wk和4wk重复血管造影.
1.3 治疗组处理
治疗组于球囊扩张术后即刻在X线透视下将多孔球囊导管(3.0mm×20mm，20小孔 呈螺旋状排列，小孔直径约10μm)送至扩张部位，在2个大气压下经导管给予国产重组水蛭素1mg·kg-1 ，对照组经多孔球囊导管给予生理盐水.两组动物均于穿刺成功后给予肝素150IU·kg-1 抗凝.
1.4 组织标本制作
术后4wk实验动物于动脉造影后行侧腹切开，显露腹主动脉和下腔静脉，分别插入16号针管，其中动脉针管与恒压灌注装置相接，用13.3kPa恒压生理盐水灌注，至静脉流出液清亮为止，然后以40g·L-1 多聚甲醛13.3kPa恒压动脉灌注15min，使动脉在生理压力下固定，自髂总动脉起始部起左右两侧各取10mm的标本，接着放入多聚甲醛液中固定24h.标本以石蜡包埋、切片，行HE染色、Masson三色染色、Actin(VSMC)和PCNA免疫组织化学染色，显微镜下观察并行计算机彩色图像分析.
1.5 计算机彩色图像分析
采用LEICA Q550IW图像分析系统测定管腔面积、内弹力板围绕面积和外弹力板围绕面积.以内弹力板围绕面积减管腔面积为内膜面积，以外弹力板围绕面积减内弹力板围绕面积为中膜面积.
统计学处理:实验数据以x ±s表示，采用SPSS软件做统计学处理，组间差异采用t检验.
2 结果
2.1 造影结果
血管直径以造影时血管最狭窄处直径与球囊扩张术前该血管直径的比值表示，血管面积以血管直径的平方表示.对照组术后2wk和术后4wk平均髂总动脉直径分别为(56±10)%和(45±12)%，平均面积分别为(32±11)%和(21±11)%，均较术前明显降低.重组水蛭素局部治疗组术后2wk平均髂总动脉直径为(86±5)%，平均面积为(74±9)%，均较对照组显著扩大(P<0.01)，术后4wk平均髂总动脉直径为(77±13)%，平均面积为(61±18)%，亦较对照组显著扩大(P<0.01，Fig1).
2.2 术后4wk病理结果及其计算机彩色图像分析
显微镜下正常兔髂总动脉壁分为内膜、中膜和外膜，三者分界清楚.内膜和中膜以呈波浪状的内弹力板为界，内膜为单层内皮细胞及其基质，中膜的主要成分是平滑肌细胞(VSMC)，呈长梭形，以管腔为中心同心圆排列，中膜与外膜以外弹力板为界.球囊扩张后血管均显示弥漫性内膜增厚，对照组内膜增生组织使管腔高度狭窄甚至几近完全闭塞，增生内膜以增殖的平滑肌细胞为主，且细胞外的胶原和弹力纤维亦明显增加，重组水蛭素经多孔球囊局部用药组内膜增生相对较轻.
HE染色病理切片计算机彩色图像分析显示:对照组和重组水蛭素局部用药组未扩张侧髂动脉管腔面积占血管总面积的百分比分别为(39±4)%和(41±9)%，两组间无显著差异(P>0.05);血管壁面积=中膜面积，占血管总面积的百分比分别为(61±4)%和(59±9)%，两组间亦无显著差异(P>0.05).对照组球囊扩张侧髂动脉管腔面积为(16±5)%，与未扩张侧相比显著减少(P<0.01)，血管壁面积=内膜面积+中膜面积，血管壁面积及内膜面积分别为(84±5)%和(38±10)%，均显著增加(P<0.01)，中膜面积无明显改变(P>0.05);重组水蛭素局部用药组髂动脉血管腔面积与对照组相比显著扩大[(37±5)%vs(16±5)%，P<0.01]，血管壁面积则显著减少[(63±5)%vs(84±5)%，P<0.01]，其中主要是内膜面积的减少[(7±1)%vs(38±10)%，P<0.01]，而中膜面积与对照组相比无明显差异[(56±5)%vs(46±7)%，P>0.05](Fig2).
Masson染色血管平滑肌细胞(VSMC)呈红色而胶原蛋白呈蓝色，正常兔髂总动脉VSMC仅见于中膜，胶原蛋白可见于中膜VSMC周围及血管外膜.球囊扩张后可见兔髂总动脉内膜增殖，增殖内膜中出现大量排列紊乱呈红色染色的VSMC和呈蓝色染色的胶原蛋白.Actin(VSMC)免疫组化染色阳性颗粒呈棕黄色，仅存在于正常血管的中膜，球囊扩张损伤后血管的Actin阳性细胞明显增加，并在增殖的内膜中大量出现，重组水蛭素组Actin阳性颗粒明显少于对照组.PCNA免疫组化染色阳性颗粒呈棕黄色，出现于增殖活跃细胞核内，正常血管中可见极少部分细胞PCNA染色阳性，对照组球囊扩张损伤后管壁PCNA阳性细胞明显增多，并大量出现于增殖的内膜中，而重组水蛭素组则PCNA阳性细胞相对较少.
3 讨论
Haycraft于1884年发现医用水蛭提取物中含有抗凝物质，20世纪50年代末Markwardt首次分离出其有效成分并命名为水蛭素.天然水蛭素可特异性地与凝血酶以等摩尔形成紧密的复合物，其解离常数Ki非常小，是迄今为止发现的作用最强的天然特效凝血酶抑制剂[4] .但天然水蛭素的提取步骤繁琐，且医用水蛭饲养困难、来源匮乏，难以得到足够量的纯品，使研究和临床应用受到限制.国产重组水蛭素是利用生物工程技术在酵母中大量表达生产的非硫化水蛭素变异体Ⅰ(Try63 位未硫化)，为65肽蛋白质，氨基酸序列除了N末端为异亮氨酸和63位酪氨酸无硫酸酯基团外，其他氨基酸序列均与天然水蛭素相同，其空间结构和抗凝血酶作用与天然水蛭素类似[5] .国产重组水蛭素的比活性与Hoechst Marion Roussel公司生产的REFLUDIN(Lepirudin)相近，且生产成本相对较为低廉，为抗栓治疗提供了一种新的选择.文献报道，血管在球囊扩张损伤后，血管内皮下组织暴露于血流之中，使得凝血系统激活，血液中和损伤血管局部凝血酶水平明显升高，球囊扩张术后静脉给予国产重组水蛭素可以明显抑制平滑肌细胞增殖和管腔狭窄的发生[3] .本实验在兔髂总动脉球囊扩张损伤后短期经多孔导管局部给予国产重组水蛭素治疗，可以明显减少术后2wk和4wk动脉管腔的狭窄，抑制血管壁Actin(VSMC)和PCNA表达，显著抑制动脉内膜增殖和平滑肌细胞增生，扩大血管腔面积.
PTCA术后局部用药是一种较全身用药更为安全有效的给药方法，经多孔球囊导管局部给药是在一定压力作用下将药物经囊壁小孔渗射入动脉壁，药物在血管损伤局部渗透释放，使损伤血管壁局部药物浓度增加，药物的作用时间延长，药物用量减少和副作用减轻 [6-8] .经多孔球囊导管在血管损伤局部给予重组水蛭素不仅抑制了血浆中凝血酶的作用，而且抑制损伤血管局部产生凝血酶的作用，使球囊扩张损伤后动脉血管内膜增殖明显减轻，抑制平滑肌细胞增殖和迁移.重组水蛭素抑制损伤后动脉内膜增殖减少管腔的狭窄的可能通过以下机制:①抑制血管损伤局部血液凝固及附壁血栓形成，消除由于血栓形成及以后机化导致的损伤局部血管再狭窄的形成及进展[9，10] ;②重组水蛭素可抑制凝血酶介导的血小板活化和凝集，从而抑制血小板活化并释放多种生物活性物质尤其是血小板衍生生长因子(PDGF)导致的平滑肌细胞增殖和迁移作用[11，12] ;③凝血酶具有直接促进平滑肌细胞增殖和迁移作用 [13，14] ，重组水蛭素可抑制其作用;④凝血酶具有促进血管平滑肌细胞合成与分泌细胞外基质的作用，重组水蛭素通过抑制凝血酶的作用而抑制细胞外基质的合成及分泌，从而减轻血管内膜增厚和管腔狭窄 [15] ;⑤抑制凝血酶介导的局部炎性细胞聚集和炎性细胞之间的相互作用 [16] ，从而抑制炎性细胞释放细胞因子导致的血管损伤局部平滑肌细胞增殖内膜的增厚.
总之，凝血酶在球囊扩张术后内膜增殖和管腔狭窄的发生过程中起着非常重要的作用，球囊扩张术后经多孔导管在损伤血管局部给予重组水蛭素治疗，可特异性抑制凝血酶的作用，抑制血管平滑肌细胞增殖和迁移，显著减轻动脉新生内膜增殖和管腔的狭窄，有望成为临床预防PTCA术后再狭窄的一种很有前途的治疗方法.
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作者简介: 田建伟(1972-)，男(汉族)，陕西省华阴市人.博士生(导师赵连友)，主治医师.Tel.(029)3577633 Email.Tianjianwei@263.net
(1 第四军医大学唐都医院心血管内科，陕西西安710038，2 空军总医院心血管内科，北京100036，3 空军第466医院心血管内科，北京100083)
编辑 王 睿
收稿日期:2001-08-22, 百拇医药(田建伟，赵连友，郑强荪，刘朝中，江一清，陈宏，朴龙松)