红霉素对豚鼠单心室肌细胞APD及主要跨膜离子电流的作用
关键词: 红霉素;动作电位;IKr
摘 要:目的 通过观察红霉素对豚鼠单心室肌细胞动作电位时程(APD)及动作电位形成过程中主要跨膜离子电流的作用，探讨其诱发室性心律失常的电生理学机制. 方法 采用膜片钳全细胞技术记录红霉素对ADP及主要电流的影响. 结果 红霉素可使APD明显延长，并选择性地抑制了延迟整流钾电流(IK )中的快速激活成份IKr .红霉素对心室肌细胞直接的电生理作用较弱，只有在较高浓度时才会对单心室肌细胞APD及IKr 产生抑制作用. 结论 红霉素通过选择性抑制IKr 而使APD延长，这可能是临床应用红霉素诱发室性心律失常的机制.
Effects of erythromycin on APD and main currents involved in action potentional in single guinea pig ventricular myocytes
WANG Hai-Chang，JIA Guo-Liang
Department of Cardiovasology，Xijing Hospital，Fourth Military Medical University，Xi'an710033，China
Keywords:erythromycin;action potential;IKr
Abstract:AIM To explain the ventricular tachycardia in-duced by administration of erythromycin by observing the its effects on action potential duration(APD)and main ion chan-nel currents in guinea pig ventricular myocytes.METHODS Whole-cell patch-clamp techniques were used.RESULTS Erythromycin prolonged APD and selectively blocked the rapid activating component of the delayed rectifier potassium current(IKr ).The electrophysiological effects of ery-thromycin on ventricular myocytes were weak.It prolonged APD and inhibited IKr only at relatively high concentrations.CONCLUSION Erythromycin could prolong APD by selec-tively blocking the rapid activating component of the delayed rectifier potassium current(IKr )，which may be the mecha-nisms of ventricular tachycardia induced by erythromycin.
0 引言
红霉素是临床上广泛应用的有效抗生素，但已有数例关于患者在iv或po后由于QT间期过度延长而出现多形性室速(尖端扭转型室速)的报道，部分患者发生了心源性猝死[1-6] .本实验采用膜片钳技术研究了红霉素对豚鼠单心室肌细胞动作电位时程(APD)及主要跨膜离子电流的作用，探讨其诱发QT间期延长及室性心律失常的电生理机制.
1 材料和方法
1.1 溶液及试剂 Tyrode氏液组成为(mmol·L-1 ):NaCl143，KCl5.4，MgCl2 0.5，CaCl2 1.8，NaH2 PO4 0.3，glucose5.5，HEPES5(NaOH调pH7.4).电极内液的组成为(mmol·L-1 ):K-aspartat-ic120，KCl20，MgCl2 5，K2 ATP5，EGTA10，HEPES5(KOH调pH7.3).
1.2 电生理学测定
选择边缘整齐、横纹清楚、无收缩活动的柱状心室肌细胞进行实验.所有实验均在室温(25±1)℃下完成.玻璃微电极由外径1.44mm的Pyrex玻璃毛细管经程控电极拉制器拉制而成，当充以电极内液并浸入到细胞外液时的电极阻抗为2～4MΩ.
1.3 心肌细胞分离
单豚鼠心室肌细胞采用改良酶解法进行分离[7] .实验数据经膜片钳放大器(Axon-200A)2kHz滤波放大后贮存于个人计算机内，采用专用程序进行分析，各类数据均以x ±s表示，用药前后数据以配对t检验进行分析，P<0.05被认为具有统计学差异.
2 结果
2.1 红霉素对心室肌细胞APD的影响
采用nys-tatin-破膜法测定红霉素对APD的影响，刺激频率为5Hz，刺激持续时间为0.5ms时，100μmol·L-1 红霉素对APD无影响，但当红霉素的浓度增加到300μmol·L-1 时，APD出现延长，APD
90 平均延长11.89%[(65.33±9.71)ms]，延长到(73.10±5.24)ms(P<0.05，n=5)，动作电位0相幅度无改变.当用正常Tyrode氏液取代含红霉素的细胞外液后，延长的APD可部分恢复(Fig1).
2.2 红霉素对IK 的抑制作用
红霉素对IK 的作用是在全细胞电压钳制下进行测定的.钳制细胞膜于-40mV，除极至-30～+60mV的膜电位水平，持续250ms和1000ms.由于细胞膜被钳制于-40mV时钠通道处于失活状态，L-型钙通道则由细胞外液中的0.5μmol·L-1 nesoldipine完全阻断.250ms除极化时，100μmol·L-1 红霉素使IK 尾电流(tail current)及稳态电流(steady state current)均轻度下降(Fig2A)，其中尾电流下降显著(P<0.05，Fig2B).
2.3 红霉素对动作电位形成过程中其他离子通道的作用
300μmol·L-1 红霉素对内向整流钾电流IK1 ，L-型钙电流及钠电流均无抑制作用. 图4 不同浓度红霉素对IK 尾电流和稳态电流的作用
3 讨论
心室肌细胞动作电位时程APD是由细胞膜离子通道、离子泵及离子交换机制等多种电流的综合净电流控制的.其中延迟整流钾电流IK 是心室肌细胞动作电位复极化过程中的主要外向电流，IK 的激活标志着平台期的结束和3相快速复极化的开始.
根据通道动力学特性及药物敏感性的不同可将IK 分为快速激活的IKr 和缓慢激活的IKs[8-10] .其中IKr 激活较快，在较低膜电位水平时即可被激活，在大于0mV膜电位时具有明显的内向整流作用，对第Ⅲ类抗心律失常药E-4031特异性敏感.IKs 的激活明显慢于IKr ，只有在较高膜电位水平下才被激活，无内向整流作用，对E-4031不敏感.遗传型LQT中的一种(LQT2)就是由于编码IKr 通道蛋白的HERG基因变异导致了IKr 通道功能部分或全部丧失而致[11] ，具有IKr 特异性阻断作用的E-4031或so-talol临床应用不当时也会使QT间期明显延长，形成继发性LQT.这充分证明IKr 在心室肌的复极化过程中起重要作用，IKr 的减小会使心室肌复极化过程 减慢，QT间期延长.
我们发现，100μmol·L-1 红霉素不能使APD延长，只有当进一步提高药物浓度时APD才明显延长.同时发现红霉素对短时程除极化(250ms)及长时程(1000ms)、低膜电位除极化时诱发的IK 具有直接的抑制作用，受抑制部分的IK 与IKr 具有相同的激活特性.100μmol·L-1 红霉素对IK 的作用弱，只有当浓度进一步升高时I K 才会受到明显的抑制.该药对IKs 及其他跨膜电流无影响则表明此药只选择性地抑制IKr .
致 谢 日本冈崎国立共同研究机构生理学研究所机能协关部冈田泰伸教授、森岛 繁博士在实验及论文写作过程中给予帮助.
参考文献:
[1]McComb JM，Campbell NPS，Cleland J.Recurrent ventricular tachycardia associated with QT prolongation after mitral value replacement and its association with intravenous administration of erythromycin [J].Am J Cardiol，1984;54:922-923.
[2]Brandriss MW，Richardson WS，Barold SS.Erythromycin-in-duced QT prolongation and polymorphic ventricular tachycardia(torsade de pointes):Case report and review [J].Clin Infect Dis，1994;18:995-998.
[3]Freeman RA，Anderson KP，Green LS，Mason JW.Effects of erythromycin on ventricular arrhythmias and its association with intravenous administration of erythromycin [J].Am J Cardiol，1987;59:168-169.
[4]Farrar HC，Walsh-Sukys MC，Kyllonen K，Blumer JL.Cardiac toxicity associated with intravenous erythromycin lactobionate:two case reports and review of the literature [J].Pediatr Infect Dis J，1993;12:688-691.
[5]Nattle S，Ranger S，Talajic M，Lemery R，Roy D.Ery-thromycin induced long QT syndrome:Concordance with quini-dine and underlying cellular electrophysiologic mechanism [J].Am J Med，1990;89:235-238.
[6]Guelon D，Bedock B，Chartier C，Haberer JP.QT prolongation and recurrent torsade de pointes during erythromycin lactobion-ate infusion [J].Am J Cardiol，1986;58:666-672.
[7]Powell T.Methods for the isolation and preparation of single adult myocytes [A].In:Clarkw A，Decker RS，Bog TK.Biol-ogy of isolated adult canine myocytes [M].New York.NY:El-sevier Sciences Publishing Co.1988:9-12.
[8]Sanguinetti MC，Jurkiewicz NK.Two components of cardiac de-layed rectifier K
+ current:Differential sensitivity to block by class III antiarrhythmic agents [J].J Gen Physiol，1990;96:195-215.
[9]Horie M，Hayashi S，Kawai C.Two types of delayed rectifying K+ channels in atrial cells of guinea pig heart [J].Jpn J Physi-ol，1990;40:479-490.
[10]Chinn K.Two delayed rectifiers in guinea pig ventricular my-ocytes distinguished by tail current kinetics [J].J Pharmacol Exp Ther，1993;264:555-560.
[11]Chiany CE，Roden DM.The long QT syndromes:Genetic basis and clinical implications [J].JACC，2000;1-12:36.
作者简介: 王海昌(1963-)，男(汉族)，辽宁省西丰县人.博士，副主任，副教授，副主任医师.Tel.(029)3375187
(第四军医大学西京医院心血管内科，陕西西安710033)
编辑 王 睿
收稿日期:2001-06-25, 百拇医药(王海昌，贾国良)
摘 要:目的 通过观察红霉素对豚鼠单心室肌细胞动作电位时程(APD)及动作电位形成过程中主要跨膜离子电流的作用，探讨其诱发室性心律失常的电生理学机制. 方法 采用膜片钳全细胞技术记录红霉素对ADP及主要电流的影响. 结果 红霉素可使APD明显延长，并选择性地抑制了延迟整流钾电流(IK )中的快速激活成份IKr .红霉素对心室肌细胞直接的电生理作用较弱，只有在较高浓度时才会对单心室肌细胞APD及IKr 产生抑制作用. 结论 红霉素通过选择性抑制IKr 而使APD延长，这可能是临床应用红霉素诱发室性心律失常的机制.
Effects of erythromycin on APD and main currents involved in action potentional in single guinea pig ventricular myocytes
WANG Hai-Chang，JIA Guo-Liang
Department of Cardiovasology，Xijing Hospital，Fourth Military Medical University，Xi'an710033，China
Keywords:erythromycin;action potential;IKr
Abstract:AIM To explain the ventricular tachycardia in-duced by administration of erythromycin by observing the its effects on action potential duration(APD)and main ion chan-nel currents in guinea pig ventricular myocytes.METHODS Whole-cell patch-clamp techniques were used.RESULTS Erythromycin prolonged APD and selectively blocked the rapid activating component of the delayed rectifier potassium current(IKr ).The electrophysiological effects of ery-thromycin on ventricular myocytes were weak.It prolonged APD and inhibited IKr only at relatively high concentrations.CONCLUSION Erythromycin could prolong APD by selec-tively blocking the rapid activating component of the delayed rectifier potassium current(IKr )，which may be the mecha-nisms of ventricular tachycardia induced by erythromycin.
0 引言
红霉素是临床上广泛应用的有效抗生素，但已有数例关于患者在iv或po后由于QT间期过度延长而出现多形性室速(尖端扭转型室速)的报道，部分患者发生了心源性猝死[1-6] .本实验采用膜片钳技术研究了红霉素对豚鼠单心室肌细胞动作电位时程(APD)及主要跨膜离子电流的作用，探讨其诱发QT间期延长及室性心律失常的电生理机制.
1 材料和方法
1.1 溶液及试剂 Tyrode氏液组成为(mmol·L-1 ):NaCl143，KCl5.4，MgCl2 0.5，CaCl2 1.8，NaH2 PO4 0.3，glucose5.5，HEPES5(NaOH调pH7.4).电极内液的组成为(mmol·L-1 ):K-aspartat-ic120，KCl20，MgCl2 5，K2 ATP5，EGTA10，HEPES5(KOH调pH7.3).
1.2 电生理学测定
选择边缘整齐、横纹清楚、无收缩活动的柱状心室肌细胞进行实验.所有实验均在室温(25±1)℃下完成.玻璃微电极由外径1.44mm的Pyrex玻璃毛细管经程控电极拉制器拉制而成，当充以电极内液并浸入到细胞外液时的电极阻抗为2～4MΩ.
1.3 心肌细胞分离
单豚鼠心室肌细胞采用改良酶解法进行分离[7] .实验数据经膜片钳放大器(Axon-200A)2kHz滤波放大后贮存于个人计算机内，采用专用程序进行分析，各类数据均以x ±s表示，用药前后数据以配对t检验进行分析，P<0.05被认为具有统计学差异.
2 结果
2.1 红霉素对心室肌细胞APD的影响
采用nys-tatin-破膜法测定红霉素对APD的影响，刺激频率为5Hz，刺激持续时间为0.5ms时，100μmol·L-1 红霉素对APD无影响，但当红霉素的浓度增加到300μmol·L-1 时，APD出现延长，APD
90 平均延长11.89%[(65.33±9.71)ms]，延长到(73.10±5.24)ms(P<0.05，n=5)，动作电位0相幅度无改变.当用正常Tyrode氏液取代含红霉素的细胞外液后，延长的APD可部分恢复(Fig1).
2.2 红霉素对IK 的抑制作用
红霉素对IK 的作用是在全细胞电压钳制下进行测定的.钳制细胞膜于-40mV，除极至-30～+60mV的膜电位水平，持续250ms和1000ms.由于细胞膜被钳制于-40mV时钠通道处于失活状态，L-型钙通道则由细胞外液中的0.5μmol·L-1 nesoldipine完全阻断.250ms除极化时，100μmol·L-1 红霉素使IK 尾电流(tail current)及稳态电流(steady state current)均轻度下降(Fig2A)，其中尾电流下降显著(P<0.05，Fig2B).
2.3 红霉素对动作电位形成过程中其他离子通道的作用
300μmol·L-1 红霉素对内向整流钾电流IK1 ，L-型钙电流及钠电流均无抑制作用. 图4 不同浓度红霉素对IK 尾电流和稳态电流的作用
3 讨论
心室肌细胞动作电位时程APD是由细胞膜离子通道、离子泵及离子交换机制等多种电流的综合净电流控制的.其中延迟整流钾电流IK 是心室肌细胞动作电位复极化过程中的主要外向电流，IK 的激活标志着平台期的结束和3相快速复极化的开始.
根据通道动力学特性及药物敏感性的不同可将IK 分为快速激活的IKr 和缓慢激活的IKs[8-10] .其中IKr 激活较快，在较低膜电位水平时即可被激活，在大于0mV膜电位时具有明显的内向整流作用，对第Ⅲ类抗心律失常药E-4031特异性敏感.IKs 的激活明显慢于IKr ，只有在较高膜电位水平下才被激活，无内向整流作用，对E-4031不敏感.遗传型LQT中的一种(LQT2)就是由于编码IKr 通道蛋白的HERG基因变异导致了IKr 通道功能部分或全部丧失而致[11] ，具有IKr 特异性阻断作用的E-4031或so-talol临床应用不当时也会使QT间期明显延长，形成继发性LQT.这充分证明IKr 在心室肌的复极化过程中起重要作用，IKr 的减小会使心室肌复极化过程 减慢，QT间期延长.
我们发现，100μmol·L-1 红霉素不能使APD延长，只有当进一步提高药物浓度时APD才明显延长.同时发现红霉素对短时程除极化(250ms)及长时程(1000ms)、低膜电位除极化时诱发的IK 具有直接的抑制作用，受抑制部分的IK 与IKr 具有相同的激活特性.100μmol·L-1 红霉素对IK 的作用弱，只有当浓度进一步升高时I K 才会受到明显的抑制.该药对IKs 及其他跨膜电流无影响则表明此药只选择性地抑制IKr .
致 谢 日本冈崎国立共同研究机构生理学研究所机能协关部冈田泰伸教授、森岛 繁博士在实验及论文写作过程中给予帮助.
参考文献:
[1]McComb JM，Campbell NPS，Cleland J.Recurrent ventricular tachycardia associated with QT prolongation after mitral value replacement and its association with intravenous administration of erythromycin [J].Am J Cardiol，1984;54:922-923.
[2]Brandriss MW，Richardson WS，Barold SS.Erythromycin-in-duced QT prolongation and polymorphic ventricular tachycardia(torsade de pointes):Case report and review [J].Clin Infect Dis，1994;18:995-998.
[3]Freeman RA，Anderson KP，Green LS，Mason JW.Effects of erythromycin on ventricular arrhythmias and its association with intravenous administration of erythromycin [J].Am J Cardiol，1987;59:168-169.
[4]Farrar HC，Walsh-Sukys MC，Kyllonen K，Blumer JL.Cardiac toxicity associated with intravenous erythromycin lactobionate:two case reports and review of the literature [J].Pediatr Infect Dis J，1993;12:688-691.
[5]Nattle S，Ranger S，Talajic M，Lemery R，Roy D.Ery-thromycin induced long QT syndrome:Concordance with quini-dine and underlying cellular electrophysiologic mechanism [J].Am J Med，1990;89:235-238.
[6]Guelon D，Bedock B，Chartier C，Haberer JP.QT prolongation and recurrent torsade de pointes during erythromycin lactobion-ate infusion [J].Am J Cardiol，1986;58:666-672.
[7]Powell T.Methods for the isolation and preparation of single adult myocytes [A].In:Clarkw A，Decker RS，Bog TK.Biol-ogy of isolated adult canine myocytes [M].New York.NY:El-sevier Sciences Publishing Co.1988:9-12.
[8]Sanguinetti MC，Jurkiewicz NK.Two components of cardiac de-layed rectifier K
+ current:Differential sensitivity to block by class III antiarrhythmic agents [J].J Gen Physiol，1990;96:195-215.
[9]Horie M，Hayashi S，Kawai C.Two types of delayed rectifying K+ channels in atrial cells of guinea pig heart [J].Jpn J Physi-ol，1990;40:479-490.
[10]Chinn K.Two delayed rectifiers in guinea pig ventricular my-ocytes distinguished by tail current kinetics [J].J Pharmacol Exp Ther，1993;264:555-560.
[11]Chiany CE，Roden DM.The long QT syndromes:Genetic basis and clinical implications [J].JACC，2000;1-12:36.
作者简介: 王海昌(1963-)，男(汉族)，辽宁省西丰县人.博士，副主任，副教授，副主任医师.Tel.(029)3375187
(第四军医大学西京医院心血管内科，陕西西安710033)
编辑 王 睿
收稿日期:2001-06-25, 百拇医药(王海昌，贾国良)