山莨菪碱对脂多糖结合血管内皮细胞及诱导NO合成的抑制作用
关键词: 山莨菪碱;内皮，血管;脂多糖类;一氧化氮
摘 要:目的 实验观察山莨菪碱对细菌脂多糖(LPS)结合血管内皮细胞膜及诱导NO生成的影响. 方法 体外分离培养牛主动脉血管内皮细胞，用免疫组化显色反应显示细菌脂多糖与血管内皮细胞的结合，并通过图像分析对结果进行半定量;用高压液相色谱分析细胞培养液中NO
3- 的含量，间接反应NO的生成水平. 结果 细胞分组处理，间接法显色后图像分析，结果表明山莨菪碱组的平均灰度值明显低于LPS组(P<0.05);并且对细胞培养液中NO
3- 的检测显示山莨菪碱组的浓度明显低于LPS组(P<0.05). 结论 山莨菪碱能够抑制LPS结合血管内皮细胞，并且能够抑制LPS对NO合成的诱导作用.
Inhibitory effects of anisodamine on lipopolysac┐chrides attaching to endothelium and inducing NO release
SUN Jun，YAO Xiu-Juan，ZHAO De-Hua
Department of Pharmacology，Faculty of Preclinical Medicine，Fourth Military Medical University，Xi'an710033，China
Keywords:anisodamine;endothelium，vascular;lipopolysac-charides;nitric oxide
Abstract:AIM To investigate the effect of anisodamine on lipopolysaccharides attached to the membrane of endothelium and inducing the releasing of nitric oxide(NO).METHODS The bovine aortic endothelial cells(BAEC)were isolated and cultured for study.The lipopolysaccharides(LPS)at-tached to the membrane of endothelium was detected by im-munocytochemistric means.The NO 3- level which reflected the releasing of NO in culture medium was determined by high-performance liquid chromatography.RESULTS Af-terbeing treated with LPS，the group incubating with aniso-damine showed there had less LPS attached on than the group treated with LPS only.And the NO 3- level of the group in-cubating with anisodamine was lower than the group treated with LPS only.And the NO 3- level of the group incubating with anisodamine was lower than the group treated with LPS only.CONCLUSION This result suggests that anisodamine can significantly inhibit the LPS attached to the membrane of endothelium and inducing the releasing of NO.
0 引言
研究与临床实践证明大剂量的山莨菪碱对于抢救内毒素休克有效，其研究的结果表明其抗休克的作用机制主要在细胞水平上.近年对大肠杆菌脂多糖(lipopolysaccharides，LPS)识别结合细胞膜上受体，引发各种病理生理过程的研究日渐深入.本实验旨在通过体外培养血管内皮细胞，观察山莨菪碱对LPS结合血管内皮细胞膜上受体以及诱导NO合成的影响，以此进一步揭示山莨菪碱抗内毒素休克的作用机制.
1 材料和方法
1.1 材料
①药品与试剂:Ⅰ型胶原酶;正辛胺(n-octylamine);大肠杆菌脂多糖E.coil O11B4(lipopolysaccharides，LPS，美国Sigma公司);RPMT-1640培养基(美国Gibco公司);抗LPS单克隆抗体参照马越云等[1] 建立的方法制备;Ⅷ因子相关抗原抗体与CD14单克隆抗体(武汉博士德生物技术公司);辣根过氧化酶(HRP)标记的山羊抗小鼠IgG抗体(华美生物工程公司);盐酸消旋山莨菪碱(芜湖长江药业有限公司产品，批号9806192).地塞米松(天津药业有限公司);②仪器设备:高压液相色谱仪(美国Beckman公司);CMIAS系列-多功能彩色病理图像分析系统(北京航空航天大学图像中心).
1.2 方法
①细胞培养与鉴定:无菌条件下取牛主动脉血管10～15cm，管腔注入1g L-1 Ⅰ型胶原酶，37℃消化20min，收集消化液，离心洗涤细胞2次，计数，以1×108 L-1 细胞数接种于含200g L-1 小牛血清的1640培养液，5mL L-1 CO 2 ，37℃条件下培养，胰酶消化传代，实验用6～10代细胞.培养细胞用Ⅷ因子相关抗原单克隆抗体检测呈阳性;②内皮细胞膜结合:LPS-sCD14复合物的检测细胞均匀爬片，每8张一组，分4组:空白对照组，LPS组，山莨菪碱组，CD14抗体组.其中山莨菪碱组含山莨菪碱25mg L-1 ;CD14抗体组含抗CD14单克隆抗体3mg L-1 .;除空白对照组以外，各组的培养液中均含LPS1.0mg L-1 .药物在含200g L-1 小牛血清的1640培养液中作用4h后，40g L-1 中型甲醛固定细胞，抗LPS单克隆抗体(50mg L-1 )检测结合于细胞膜上的LPS，用间接法进行免疫组化染色，由辣根过氧化物酶-DAB系统显色.在CMIAS系列-多功能彩色病理图像分析仪上进行计算机辅助图像分析;③细胞培养液的处理:细胞以2×10 5 /孔浓度均匀接种到24孔板中，贴壁生长.每20孔一组分为4组:空白对照组，LPS组，山莨菪碱组，地塞米松组.其中山莨菪碱组含山莨菪碱50mg L-1 ;地塞米松组含地塞米松60mg L-1 ;除空白对照组以外，各组的培养液中均含LPS10mg L-1 .于200mL L-1 小牛血清的1640培养液中培养.各组分别在实验开始4，8，16，32h时各取5孔培养液，每孔1mL.经三氯乙酸除蛋白并过滤后于-20℃保存待测;④细胞培养液NO3- 浓度的检测:参照Rizzo等[2] 的高压液相检测方法，选取250mm×4.6mm C18 柱为色谱柱，以10nmol L-1 n-octy-lamine为流动相(2nmol L-1 H2 SO4 调pH值至6.0±0.2)，检测波长220nm.流动速度1mL min-1 .统计处理:数据以x ±s表示，两组实验数据分别做t检验与多因素方差分析(ANOVA).
2 结果
2.1 山莨菪碱对LPS结合血管内皮细胞的影响
在CMIAS系列-多功能彩色病理图象分析仪上，200倍视野下，每张片子分别随机观察记录1个视野，记录所测细胞的平均灰度值.灰度单位分为256个等级，LPS与血管内皮细胞的结合量与灰度值呈反比关系(Fig1(略)).
2.2 山莨菪碱对LPS诱导血管内皮细胞NO合成的影响
NO的半衰期极短，很快被氧化为NO2- /NO3- ，并且NO2- 可进一步氧化为NO3- (Tab1). 表1 不同实验组的细胞培养液中NO(略)
3 讨论
G- 细菌引起感染性休克的主要致病因素为其菌体的LPS，进入体内后与血浆中的LBP蛋白、sCD14蛋白结合形成LPS-sCD14复合物，以复合物的形式与内皮细胞膜上相应受体结合[3] ，其中sCD14蛋白在LPS与其膜受体结合的过程中起关键性作用.相应的CD14单克隆抗体可以有效的抑制LPS与其膜受体结合、诱导一系列的细胞反应[4] .本实验中山莨菪碱表现了与CD14单克隆抗体类似的作用，能够抑制LPS-sCD14复合物与血管内皮细胞的结合.LPS结合血管内皮细胞可诱导其合成释放大量的NO，使血管平滑肌的K+ 离子通道开放，平滑肌舒张，血压下降，并使血管对儿茶酚胺的反应性降低，这是造成内毒素休克患者持续性低血压的重要原因[5，6] .实际上，用地塞米松、NG- 单甲基-L-精氨酸(L-NMMA)等药物阻断NO的生成可以明显的改善内毒素休克动物的持续低血压状态[7] .山莨菪碱阻碍LPS-sCD14复合物与血管内皮细胞的结合必然对LPS诱导的NO生成具有抑制作用，从而对内毒素休克时的持续低血压状态起到改善作用，相应的CD14单克隆抗体也在实验中证明有相同的作用[8] .由此实验我们认为，山莨菪碱在较高浓度的条件下对LPS结合内皮细胞膜上的相应受体具有抑制作用，此作用是通过哪一种途径产生还尚不明了，有待进一步的研究.
参考文献:
[1]Ma YY，Ding ZR，Yu WB，Su MQ，Mu SJ.Cross-reactivities of Monocolonal antibodies against lipopolysaccharide-high densi-ty lipoprotein [J]，J Cell Mol Immunol，1997;13(4):61-72.
[2]Rizzo V，Montalbetti L，Rozza AL.Nitrite/nitrate balance dur-ing photoinduced cerebral ischemia in the rat determined by high-performance liquid chromatography with UV and electro-chemical detection [J].J Chromatogr A，1998;798(1-2):103-108.
[3]Karima R，Matsumoto S，Higashi H.The molecular pathogene-sis of endotoxic shock and organ failure [J].Mol Med Today，1999;5(3):123-132.
[4]Wright SD.CD14and innate recognition of bacteria [J].J Im-munol，1995;155(1):6-8.
[5]Parrillo JE.Pathogenetic mechanisms of septic shock [J].N Engl J Med，1993;328(20):1471-1478.
[6]Gross SS，Wolin MS.Nitric oxide:Pathophysiological mecha-nisms [J].Annu Rev Physiol，1995;57(4):737-769.
[7]Kilbourn RG，Jubran A，Gross SS.Reversal of endotoxin-me-diated shock by NG-methyl-L-arginine，an inhibitor of nitric ox-ide synthesis [J].Biochem Biophys Res Commun，1990;172(3):1132-1138.
[8]Schimke J，Mathison J，Morgiewicz J.Anti-CD14mAb treat-ment provides therapeutic benefit after in vivo exposure to endo-toxin [J].Proc Natl Acad Sci USA，1998;95(23):13875-13880.
作者简介: 孙 军(1973-)，男(汉族)，山东省淄博市人.硕士，现工作在济南军区总院药剂科.Tel.13656410432Email.sunjun7561@163.net
编辑 许昌泰
收稿日期:2001-01-30, 百拇医药(孙军，姚秀娟，赵德化)
摘 要:目的 实验观察山莨菪碱对细菌脂多糖(LPS)结合血管内皮细胞膜及诱导NO生成的影响. 方法 体外分离培养牛主动脉血管内皮细胞，用免疫组化显色反应显示细菌脂多糖与血管内皮细胞的结合，并通过图像分析对结果进行半定量;用高压液相色谱分析细胞培养液中NO
3- 的含量，间接反应NO的生成水平. 结果 细胞分组处理，间接法显色后图像分析，结果表明山莨菪碱组的平均灰度值明显低于LPS组(P<0.05);并且对细胞培养液中NO
3- 的检测显示山莨菪碱组的浓度明显低于LPS组(P<0.05). 结论 山莨菪碱能够抑制LPS结合血管内皮细胞，并且能够抑制LPS对NO合成的诱导作用.
Inhibitory effects of anisodamine on lipopolysac┐chrides attaching to endothelium and inducing NO release
SUN Jun，YAO Xiu-Juan，ZHAO De-Hua
Department of Pharmacology，Faculty of Preclinical Medicine，Fourth Military Medical University，Xi'an710033，China
Keywords:anisodamine;endothelium，vascular;lipopolysac-charides;nitric oxide
Abstract:AIM To investigate the effect of anisodamine on lipopolysaccharides attached to the membrane of endothelium and inducing the releasing of nitric oxide(NO).METHODS The bovine aortic endothelial cells(BAEC)were isolated and cultured for study.The lipopolysaccharides(LPS)at-tached to the membrane of endothelium was detected by im-munocytochemistric means.The NO 3- level which reflected the releasing of NO in culture medium was determined by high-performance liquid chromatography.RESULTS Af-terbeing treated with LPS，the group incubating with aniso-damine showed there had less LPS attached on than the group treated with LPS only.And the NO 3- level of the group in-cubating with anisodamine was lower than the group treated with LPS only.And the NO 3- level of the group incubating with anisodamine was lower than the group treated with LPS only.CONCLUSION This result suggests that anisodamine can significantly inhibit the LPS attached to the membrane of endothelium and inducing the releasing of NO.
0 引言
研究与临床实践证明大剂量的山莨菪碱对于抢救内毒素休克有效，其研究的结果表明其抗休克的作用机制主要在细胞水平上.近年对大肠杆菌脂多糖(lipopolysaccharides，LPS)识别结合细胞膜上受体，引发各种病理生理过程的研究日渐深入.本实验旨在通过体外培养血管内皮细胞，观察山莨菪碱对LPS结合血管内皮细胞膜上受体以及诱导NO合成的影响，以此进一步揭示山莨菪碱抗内毒素休克的作用机制.
1 材料和方法
1.1 材料
①药品与试剂:Ⅰ型胶原酶;正辛胺(n-octylamine);大肠杆菌脂多糖E.coil O11B4(lipopolysaccharides，LPS，美国Sigma公司);RPMT-1640培养基(美国Gibco公司);抗LPS单克隆抗体参照马越云等[1] 建立的方法制备;Ⅷ因子相关抗原抗体与CD14单克隆抗体(武汉博士德生物技术公司);辣根过氧化酶(HRP)标记的山羊抗小鼠IgG抗体(华美生物工程公司);盐酸消旋山莨菪碱(芜湖长江药业有限公司产品，批号9806192).地塞米松(天津药业有限公司);②仪器设备:高压液相色谱仪(美国Beckman公司);CMIAS系列-多功能彩色病理图像分析系统(北京航空航天大学图像中心).
1.2 方法
①细胞培养与鉴定:无菌条件下取牛主动脉血管10～15cm，管腔注入1g L-1 Ⅰ型胶原酶，37℃消化20min，收集消化液，离心洗涤细胞2次，计数，以1×108 L-1 细胞数接种于含200g L-1 小牛血清的1640培养液，5mL L-1 CO 2 ，37℃条件下培养，胰酶消化传代，实验用6～10代细胞.培养细胞用Ⅷ因子相关抗原单克隆抗体检测呈阳性;②内皮细胞膜结合:LPS-sCD14复合物的检测细胞均匀爬片，每8张一组，分4组:空白对照组，LPS组，山莨菪碱组，CD14抗体组.其中山莨菪碱组含山莨菪碱25mg L-1 ;CD14抗体组含抗CD14单克隆抗体3mg L-1 .;除空白对照组以外，各组的培养液中均含LPS1.0mg L-1 .药物在含200g L-1 小牛血清的1640培养液中作用4h后，40g L-1 中型甲醛固定细胞，抗LPS单克隆抗体(50mg L-1 )检测结合于细胞膜上的LPS，用间接法进行免疫组化染色，由辣根过氧化物酶-DAB系统显色.在CMIAS系列-多功能彩色病理图像分析仪上进行计算机辅助图像分析;③细胞培养液的处理:细胞以2×10 5 /孔浓度均匀接种到24孔板中，贴壁生长.每20孔一组分为4组:空白对照组，LPS组，山莨菪碱组，地塞米松组.其中山莨菪碱组含山莨菪碱50mg L-1 ;地塞米松组含地塞米松60mg L-1 ;除空白对照组以外，各组的培养液中均含LPS10mg L-1 .于200mL L-1 小牛血清的1640培养液中培养.各组分别在实验开始4，8，16，32h时各取5孔培养液，每孔1mL.经三氯乙酸除蛋白并过滤后于-20℃保存待测;④细胞培养液NO3- 浓度的检测:参照Rizzo等[2] 的高压液相检测方法，选取250mm×4.6mm C18 柱为色谱柱，以10nmol L-1 n-octy-lamine为流动相(2nmol L-1 H2 SO4 调pH值至6.0±0.2)，检测波长220nm.流动速度1mL min-1 .统计处理:数据以x ±s表示，两组实验数据分别做t检验与多因素方差分析(ANOVA).
2 结果
2.1 山莨菪碱对LPS结合血管内皮细胞的影响
在CMIAS系列-多功能彩色病理图象分析仪上，200倍视野下，每张片子分别随机观察记录1个视野，记录所测细胞的平均灰度值.灰度单位分为256个等级，LPS与血管内皮细胞的结合量与灰度值呈反比关系(Fig1(略)).
2.2 山莨菪碱对LPS诱导血管内皮细胞NO合成的影响
NO的半衰期极短，很快被氧化为NO2- /NO3- ，并且NO2- 可进一步氧化为NO3- (Tab1). 表1 不同实验组的细胞培养液中NO(略)
3 讨论
G- 细菌引起感染性休克的主要致病因素为其菌体的LPS，进入体内后与血浆中的LBP蛋白、sCD14蛋白结合形成LPS-sCD14复合物，以复合物的形式与内皮细胞膜上相应受体结合[3] ，其中sCD14蛋白在LPS与其膜受体结合的过程中起关键性作用.相应的CD14单克隆抗体可以有效的抑制LPS与其膜受体结合、诱导一系列的细胞反应[4] .本实验中山莨菪碱表现了与CD14单克隆抗体类似的作用，能够抑制LPS-sCD14复合物与血管内皮细胞的结合.LPS结合血管内皮细胞可诱导其合成释放大量的NO，使血管平滑肌的K+ 离子通道开放，平滑肌舒张，血压下降，并使血管对儿茶酚胺的反应性降低，这是造成内毒素休克患者持续性低血压的重要原因[5，6] .实际上，用地塞米松、NG- 单甲基-L-精氨酸(L-NMMA)等药物阻断NO的生成可以明显的改善内毒素休克动物的持续低血压状态[7] .山莨菪碱阻碍LPS-sCD14复合物与血管内皮细胞的结合必然对LPS诱导的NO生成具有抑制作用，从而对内毒素休克时的持续低血压状态起到改善作用，相应的CD14单克隆抗体也在实验中证明有相同的作用[8] .由此实验我们认为，山莨菪碱在较高浓度的条件下对LPS结合内皮细胞膜上的相应受体具有抑制作用，此作用是通过哪一种途径产生还尚不明了，有待进一步的研究.
参考文献:
[1]Ma YY，Ding ZR，Yu WB，Su MQ，Mu SJ.Cross-reactivities of Monocolonal antibodies against lipopolysaccharide-high densi-ty lipoprotein [J]，J Cell Mol Immunol，1997;13(4):61-72.
[2]Rizzo V，Montalbetti L，Rozza AL.Nitrite/nitrate balance dur-ing photoinduced cerebral ischemia in the rat determined by high-performance liquid chromatography with UV and electro-chemical detection [J].J Chromatogr A，1998;798(1-2):103-108.
[3]Karima R，Matsumoto S，Higashi H.The molecular pathogene-sis of endotoxic shock and organ failure [J].Mol Med Today，1999;5(3):123-132.
[4]Wright SD.CD14and innate recognition of bacteria [J].J Im-munol，1995;155(1):6-8.
[5]Parrillo JE.Pathogenetic mechanisms of septic shock [J].N Engl J Med，1993;328(20):1471-1478.
[6]Gross SS，Wolin MS.Nitric oxide:Pathophysiological mecha-nisms [J].Annu Rev Physiol，1995;57(4):737-769.
[7]Kilbourn RG，Jubran A，Gross SS.Reversal of endotoxin-me-diated shock by NG-methyl-L-arginine，an inhibitor of nitric ox-ide synthesis [J].Biochem Biophys Res Commun，1990;172(3):1132-1138.
[8]Schimke J，Mathison J，Morgiewicz J.Anti-CD14mAb treat-ment provides therapeutic benefit after in vivo exposure to endo-toxin [J].Proc Natl Acad Sci USA，1998;95(23):13875-13880.
作者简介: 孙 军(1973-)，男(汉族)，山东省淄博市人.硕士，现工作在济南军区总院药剂科.Tel.13656410432Email.sunjun7561@163.net
编辑 许昌泰
收稿日期:2001-01-30, 百拇医药(孙军，姚秀娟，赵德化)