真核表达载体pcDNA3.0Cx43的构建及其在骨髓基质干细胞中的表达
Construction and expressin of eukaryotic expression vector pcDNA3.0Cx43 in mesenchymal stem cells
ZHOU HePing, CAI ZhenJie, YU ShiQiang, ZHAO KeYan, WU TieJun
Center of Cardiovascular Surgery, Xijing Hospital, Fourth Military Medical University, Xian 710033, China
【Abstract】 AIM: To construct a eukaryotic expression vector encoding fulllength connexin43 (Cx43) cDNA and to investigate its overexpression in mesenchymal stem cells (MSCs). METHODS: Fulllength Cx43 cDNA was amplified in E. coli JM109 and cloned into the eukaryotic expression vector pcDNA3.0. Stably transfected cell colonies were obtained by gene transfer and G418 screening and control cells were transfected with pcDNA3.0 and screened by using the same method. RESULTS: Electrophoresis results indicated that the recombinant vector was constructed correctly. Immunocytochemical analysis revealed an overexpression of Cx43 in pcDNA3.0Cx43 transfected MSCs. CONCLUSION: The connexin43 can be expressed in MSCs.
【Keywords】 connexin 43; bone marrow cells; stem cells; gene expression; transfection.
【摘要】 目的： 构建携带间隙连接蛋白connexin 43 (Cx 43) cDNA的真核表达载体,转染骨髓基质干细胞，观察间隙连接蛋白Cx 43在骨髓基质干细胞中的过量表达. 方法： 目的基因Cx 43 cDNA在大肠杆菌中扩增后连入真核表达载体pcDNA3.0，转染大鼠骨髓基质干细胞，用G418筛选得到Cx 43基因高表达的细胞；对照组为pcDNA3.0直接转染骨髓基质干细胞. 结果： 酶切电泳结果显示按设计构建的载体pcDNA3.0Cx43，经G418筛选得到不同抗性的骨髓基质干细胞，免疫细胞化学显示有Cx 43蛋白的表达. 结论： Cx 43可以在骨髓基质干细胞中表达.
【关键词】 连接蛋白43；骨髓细胞；干细胞；基因表达；转染
0引言
研究表明，细胞移植有望成为治疗终末期心脏疾病的有效方法. 移植种子细胞有胚胎干细胞[1]、新生心肌细胞[2]、成肌细胞[3]、骨髓基质干细胞(MSCs)等. Orlic等[4]研究表明，MSCs在体内微环境的诱导下可分化为心肌细胞和血管结构，且因其具有来源可靠、体外易扩增、无免疫排斥反应及不涉及伦理问题等优点而成为首选种子细胞. 而无论何种细胞，功能的发挥主要取决于种子细胞之间以及种子细胞和正常心肌细胞之间能否形成有效的电—机械耦连，其主要结构是细胞间间隙连接，而细胞间间隙连接即为细胞膜上的间隙连接蛋白(connexin, Cx)构成的六聚体跨膜蛋白通道. 我们通过构建携带间隙连接蛋白Cx 43 的真核表达载体，转染骨髓基质干细胞，观察Cx 43在MSCs中的过量表达对移植细胞间通讯的影响.
1材料和方法
1.1材料
成年SD大鼠购自第四军医大学实验动物中心. 质粒载体pcDNA3.0由第四军医大学生物化学与分子生物学教研室惠赠. 大肠杆菌菌种JM109由第四军医大学细胞工程研究中心李郁博士惠赠. 鼠抗Cx 43 mAb购自美国SantaCruz公司. Cx43特异性引物由上海申友生物技术有限责任公司合成. RNA反转录试剂盒、DNA限制性内切酶和DNA连接酶、Lucifer Yellow，Trizol，DMEM培养基及G418等分别购自Promega，Takara，Sigma，GibcoBRL及上海华美生物工程公司. 质粒抽提试剂盒为Qiagene公司产品. 脂质体转染试剂盒为Invitrogen公司产品.
1.2方法
1.2.1真核表达载体pcDNA3Cx43的构建和纯化Trizol法提取SD大鼠心肌组织总RNA，利用合成的特异性引物(5′端引物GTT GGA TCC ATG GGT GAC TGG AGT；3′端引物GTT GAA TTC TTA AAT CTC CAG GTC)通过反转录PCR法合成Cx 43 cDNA，经EcoRⅠ和BamHⅠ酶切回收目的基因片段. EcoRⅠ和BamHⅠ酶切载体pcDNA3. DNA连接酶连接载体片段和目的基因片段，连接产物转化感受态大肠杆菌. 分别以EcoRⅠ和BamHⅠ酶切电泳鉴定重组体，得到正确连接的重组体.
1.2.2MSCs体外分离和培养将大鼠脱臼处死后置于75 mL/L乙醇浸泡5 min，无菌条件下分离出股骨和胫骨. 用注射器冲出骨髓后，将骨髓液吹打制成单细胞悬液并缓慢注入预先加有密度为1.082的Percoll细胞分离液的试管中，离心后取中间的单个核细胞层，以2×105/cm2的密度接种于DMEM培养基(含青霉素、链霉素各1×105 u/L,胎牛血清150 mL/L),置于50 mL/L CO2孵箱内培养. 24 h后更换培养液，去掉非贴壁细胞，3～4 d换液1次，待2 wk左右细胞生长融合后，2.5 g/L胰酶消化，以5×104/cm2密度传代培养.
1.2.3Cx 43蛋白高表达细胞的筛选按照LF2000脂质体转染试剂盒说明，高纯度的真核表达载体pcDNA3.0Cx 43转染生长良好的第2代MSCs，在浓度不断升高的含G418的培养液中生长，最终得到能抵抗G418浓度为300 mg/L的细胞，分别命名为G418100，G418200和G418300.
1.2.4转化细胞中Cx 43蛋白的表达
1.2.4.1Western Blotting以大鼠心肌细胞作为阳性对照. 收集转染组及对照组各约1×106细胞，加入细胞裂解缓冲液，冰浴30 min，提取细胞全蛋白，分光光度计测定蛋白浓度，每孔取40 μg蛋白，与上样缓冲液混合，100℃煮沸5 min，蛋白电泳装置(美国BioRad)100 V电泳20 min至分离胶，120 V电泳1 h，完成10% SDSPAGE电泳. 蛋白转移(美国BioRad)100 V，300 mA 1 h将蛋白转移至NC膜. 10 g/L白蛋白室温封闭2 h，加鼠抗Cx 43 mAb(1∶1000)摇床孵育过夜，TBS洗涤10 min，3次，与辣根过氧化酶标记IgG室温孵育1 h，TBS洗涤，增强化学发光检测试剂盒(英国Amersham)行放射自显影.
1.2.4.2免疫细胞化学测定Cx 43蛋白Cx43转染的MSCs和对照组MSCs爬片生长于双室培养玻片(丹麦Nunc公司),多聚甲醛固定细胞，加入一抗鼠抗Cx 43 mAb(1∶50稀释)，4℃湿盒内过夜，PBS冲洗后加二抗异硫氰酸荧光素(FITC)标记的IgG(1∶200稀释)，室温孵育1 h. 两组细胞均用PI衬染，PBS冲洗去除非特异性背景染色. 激光共聚焦显微镜观察Cx 43蛋白的表达，FITC激发波长488 nm, PI激发波长630 nm.
2结果
2.1pcDNA3.0Cx43重组体的鉴定重组体EcoRⅠ和BamHⅠ酶切电泳结果如Fig 1. 1,4为正确构建的重组体.
2.2MSCs体外培养接种24 h后可见成纤维状的细胞以散在方式贴壁生长，基本为梭形的成纤维细胞状形态，也可见一些圆形的内皮样细胞. 传代培养后细胞基本成均匀分布生长(Fig 2).
2.3Western Blotting筛选出的G418抗性Cx43转染MSCs中的Cx 43蛋白的表达明显高于对照组(Fig 3).
2.4免疫细胞化学Cx43转染的MSCs中，细胞核为橙黄色荧光，Cx 43蛋白呈绿色荧光并分布于胞质及细胞膜上；而对照组基本为阴性(Fig 4).A: Control transfected MSCs; B: Connexin 43 transfected MSCs.
3讨论
MSCs是成体干细胞的一种. 研究表明，MSCs在体内[4]、体外[5]都可向心肌细胞方向分化. MSCs由于具有易获取、体外扩增迅速、容易转染等特点而成为基因治疗的良好靶细胞. 目前已成功的利用MSCs表达了IL3[6]，IL7[7]、生长激素[8]等.
心肌不同于横纹肌，其在功能上是一个“合胞体”. 移植细胞要发挥功能必须能与周围正常心肌细胞在解剖结构上发生整合以达到同步收缩[9]. 间隙连接是心肌细胞间沟通的主要结构，间隙连接是由连接子多聚体形成，而连接子的主要成分即连接蛋白. 在心室肌中Cx 43为主要的连接蛋白，在细胞间通讯过程中发挥重要作用. Cx 43的cDNA序列由Beyer等首次克隆成功，全长有2768 bp，开放阅读框包括1146 bp,可合成含382个氨基酸的蛋白，Mr为43036[10].真核表达载体pcDNA3.0含SV40启动子、neomycin ORF. 文献报道pcDNA3.0可表达多种外源基因使之表达各种蛋白. 我们的实验结果表明，通过构建一个携带Cx 43外源基因的真核表达载体可使之在MSCs中表达，但表达量不是很高，且在细胞连接部位及胞质内也有表达. 我们实验仅为体外初步探讨Cx 43在MSCs中的过量表达，但在细胞移植体内后Cx 43蛋白表达情况以及对MSCs向心肌细胞分化有何影响尚待进一步研究.
【参考文献】
[1] Kehat I, KenyaginKarsenti D, Snir M, et al. Human embryonic stem cells can differentiate into myocytes with structural and functional properties of cardiomyocytes [J]. J Clin Invest, 2001;108:407-414.
[2] Reinecke H, Zhang M, Bartosek T, et al. Survival, integration, and differentiation of cardiomyocyte grafts [J]. Circulation, 1999;100:193-202.
[3] Suzuki K, Brand NJ, Jayakumar J, et al. Development of a novel method for cell transplantation through the coronary artery [J]. Circulation, 2000;10:Ⅲ359-Ⅲ364.
[4] Orlic D, Kajstura J, Chimenti S, et al. Bone marrow cells regerate infarcted myocardium [J]. Nature, 2001;410(6829):701-705.
[5] Makino S, Fukuda K, Miyoshi S, et al. Cardiomyocytes can be generated from marrow stromal cells in vivo [J]. J Clin Invest, 1999;103:697-705.
[6] Nolta JA, Hanley MB, Kohn DB, et al. Sustained human hematopoiesis in immunodeficient mice by cotransplantation of marrow stroma expressing human interleukins: Analysis of gene transduction of longlived progenitors [J]. Blood, 1994;83:3041-3051.
[7] Bolotin E, Nolta J, Smith S, et al. Gene therapy with marrow stroma transduced with IL7 gene rapidly after murine bone marrow transplant [J]. Blood, 1996;88:135.
[8] Hurwitz DR, Kirchgesser M, Merrill W, et al. Systemic delivery of human growth hormone or human factor IX in dogs by reintroduced genetically modified autologous bone marrow stromal cells [J]. Hum Gene Ther, 1997;8:137-156.
[9] Chedrawy E, Wang J, Nguyen D, et al. Incorporation and integration of implanted myogenic and stem cells into native myocardial fibers: Anatomic basis for functional improvements [J]. J Thorac Cardiovasc Surg, 2002;124:584-590.
[10] Beyer E, Paul D, Goodenough D. Connexin 43: A protein from rat heart homologous to a gap junction protein from liver [J]. J Cell Biol, 1987;105:2621-2629.
作者简介：周和平(1977)，男(汉族)，安徽省芜湖市人. 硕士. (029)83375311Email. zhplove1234@163.com
(第四军医大学西京医院心血管外科中心，陕西 西安，710033)
编辑王睿, 百拇医药(周和平，蔡振杰，俞世强，赵科研，吴铁军)
ZHOU HePing, CAI ZhenJie, YU ShiQiang, ZHAO KeYan, WU TieJun
Center of Cardiovascular Surgery, Xijing Hospital, Fourth Military Medical University, Xian 710033, China
【Abstract】 AIM: To construct a eukaryotic expression vector encoding fulllength connexin43 (Cx43) cDNA and to investigate its overexpression in mesenchymal stem cells (MSCs). METHODS: Fulllength Cx43 cDNA was amplified in E. coli JM109 and cloned into the eukaryotic expression vector pcDNA3.0. Stably transfected cell colonies were obtained by gene transfer and G418 screening and control cells were transfected with pcDNA3.0 and screened by using the same method. RESULTS: Electrophoresis results indicated that the recombinant vector was constructed correctly. Immunocytochemical analysis revealed an overexpression of Cx43 in pcDNA3.0Cx43 transfected MSCs. CONCLUSION: The connexin43 can be expressed in MSCs.
【Keywords】 connexin 43; bone marrow cells; stem cells; gene expression; transfection.
【摘要】 目的： 构建携带间隙连接蛋白connexin 43 (Cx 43) cDNA的真核表达载体,转染骨髓基质干细胞，观察间隙连接蛋白Cx 43在骨髓基质干细胞中的过量表达. 方法： 目的基因Cx 43 cDNA在大肠杆菌中扩增后连入真核表达载体pcDNA3.0，转染大鼠骨髓基质干细胞，用G418筛选得到Cx 43基因高表达的细胞；对照组为pcDNA3.0直接转染骨髓基质干细胞. 结果： 酶切电泳结果显示按设计构建的载体pcDNA3.0Cx43，经G418筛选得到不同抗性的骨髓基质干细胞，免疫细胞化学显示有Cx 43蛋白的表达. 结论： Cx 43可以在骨髓基质干细胞中表达.
【关键词】 连接蛋白43；骨髓细胞；干细胞；基因表达；转染
0引言
研究表明，细胞移植有望成为治疗终末期心脏疾病的有效方法. 移植种子细胞有胚胎干细胞[1]、新生心肌细胞[2]、成肌细胞[3]、骨髓基质干细胞(MSCs)等. Orlic等[4]研究表明，MSCs在体内微环境的诱导下可分化为心肌细胞和血管结构，且因其具有来源可靠、体外易扩增、无免疫排斥反应及不涉及伦理问题等优点而成为首选种子细胞. 而无论何种细胞，功能的发挥主要取决于种子细胞之间以及种子细胞和正常心肌细胞之间能否形成有效的电—机械耦连，其主要结构是细胞间间隙连接，而细胞间间隙连接即为细胞膜上的间隙连接蛋白(connexin, Cx)构成的六聚体跨膜蛋白通道. 我们通过构建携带间隙连接蛋白Cx 43 的真核表达载体，转染骨髓基质干细胞，观察Cx 43在MSCs中的过量表达对移植细胞间通讯的影响.
1材料和方法
1.1材料
成年SD大鼠购自第四军医大学实验动物中心. 质粒载体pcDNA3.0由第四军医大学生物化学与分子生物学教研室惠赠. 大肠杆菌菌种JM109由第四军医大学细胞工程研究中心李郁博士惠赠. 鼠抗Cx 43 mAb购自美国SantaCruz公司. Cx43特异性引物由上海申友生物技术有限责任公司合成. RNA反转录试剂盒、DNA限制性内切酶和DNA连接酶、Lucifer Yellow，Trizol，DMEM培养基及G418等分别购自Promega，Takara，Sigma，GibcoBRL及上海华美生物工程公司. 质粒抽提试剂盒为Qiagene公司产品. 脂质体转染试剂盒为Invitrogen公司产品.
1.2方法
1.2.1真核表达载体pcDNA3Cx43的构建和纯化Trizol法提取SD大鼠心肌组织总RNA，利用合成的特异性引物(5′端引物GTT GGA TCC ATG GGT GAC TGG AGT；3′端引物GTT GAA TTC TTA AAT CTC CAG GTC)通过反转录PCR法合成Cx 43 cDNA，经EcoRⅠ和BamHⅠ酶切回收目的基因片段. EcoRⅠ和BamHⅠ酶切载体pcDNA3. DNA连接酶连接载体片段和目的基因片段，连接产物转化感受态大肠杆菌. 分别以EcoRⅠ和BamHⅠ酶切电泳鉴定重组体，得到正确连接的重组体.
1.2.2MSCs体外分离和培养将大鼠脱臼处死后置于75 mL/L乙醇浸泡5 min，无菌条件下分离出股骨和胫骨. 用注射器冲出骨髓后，将骨髓液吹打制成单细胞悬液并缓慢注入预先加有密度为1.082的Percoll细胞分离液的试管中，离心后取中间的单个核细胞层，以2×105/cm2的密度接种于DMEM培养基(含青霉素、链霉素各1×105 u/L,胎牛血清150 mL/L),置于50 mL/L CO2孵箱内培养. 24 h后更换培养液，去掉非贴壁细胞，3～4 d换液1次，待2 wk左右细胞生长融合后，2.5 g/L胰酶消化，以5×104/cm2密度传代培养.
1.2.3Cx 43蛋白高表达细胞的筛选按照LF2000脂质体转染试剂盒说明，高纯度的真核表达载体pcDNA3.0Cx 43转染生长良好的第2代MSCs，在浓度不断升高的含G418的培养液中生长，最终得到能抵抗G418浓度为300 mg/L的细胞，分别命名为G418100，G418200和G418300.
1.2.4转化细胞中Cx 43蛋白的表达
1.2.4.1Western Blotting以大鼠心肌细胞作为阳性对照. 收集转染组及对照组各约1×106细胞，加入细胞裂解缓冲液，冰浴30 min，提取细胞全蛋白，分光光度计测定蛋白浓度，每孔取40 μg蛋白，与上样缓冲液混合，100℃煮沸5 min，蛋白电泳装置(美国BioRad)100 V电泳20 min至分离胶，120 V电泳1 h，完成10% SDSPAGE电泳. 蛋白转移(美国BioRad)100 V，300 mA 1 h将蛋白转移至NC膜. 10 g/L白蛋白室温封闭2 h，加鼠抗Cx 43 mAb(1∶1000)摇床孵育过夜，TBS洗涤10 min，3次，与辣根过氧化酶标记IgG室温孵育1 h，TBS洗涤，增强化学发光检测试剂盒(英国Amersham)行放射自显影.
1.2.4.2免疫细胞化学测定Cx 43蛋白Cx43转染的MSCs和对照组MSCs爬片生长于双室培养玻片(丹麦Nunc公司),多聚甲醛固定细胞，加入一抗鼠抗Cx 43 mAb(1∶50稀释)，4℃湿盒内过夜，PBS冲洗后加二抗异硫氰酸荧光素(FITC)标记的IgG(1∶200稀释)，室温孵育1 h. 两组细胞均用PI衬染，PBS冲洗去除非特异性背景染色. 激光共聚焦显微镜观察Cx 43蛋白的表达，FITC激发波长488 nm, PI激发波长630 nm.
2结果
2.1pcDNA3.0Cx43重组体的鉴定重组体EcoRⅠ和BamHⅠ酶切电泳结果如Fig 1. 1,4为正确构建的重组体.
2.2MSCs体外培养接种24 h后可见成纤维状的细胞以散在方式贴壁生长，基本为梭形的成纤维细胞状形态，也可见一些圆形的内皮样细胞. 传代培养后细胞基本成均匀分布生长(Fig 2).
2.3Western Blotting筛选出的G418抗性Cx43转染MSCs中的Cx 43蛋白的表达明显高于对照组(Fig 3).
2.4免疫细胞化学Cx43转染的MSCs中，细胞核为橙黄色荧光，Cx 43蛋白呈绿色荧光并分布于胞质及细胞膜上；而对照组基本为阴性(Fig 4).A: Control transfected MSCs; B: Connexin 43 transfected MSCs.
3讨论
MSCs是成体干细胞的一种. 研究表明，MSCs在体内[4]、体外[5]都可向心肌细胞方向分化. MSCs由于具有易获取、体外扩增迅速、容易转染等特点而成为基因治疗的良好靶细胞. 目前已成功的利用MSCs表达了IL3[6]，IL7[7]、生长激素[8]等.
心肌不同于横纹肌，其在功能上是一个“合胞体”. 移植细胞要发挥功能必须能与周围正常心肌细胞在解剖结构上发生整合以达到同步收缩[9]. 间隙连接是心肌细胞间沟通的主要结构，间隙连接是由连接子多聚体形成，而连接子的主要成分即连接蛋白. 在心室肌中Cx 43为主要的连接蛋白，在细胞间通讯过程中发挥重要作用. Cx 43的cDNA序列由Beyer等首次克隆成功，全长有2768 bp，开放阅读框包括1146 bp,可合成含382个氨基酸的蛋白，Mr为43036[10].真核表达载体pcDNA3.0含SV40启动子、neomycin ORF. 文献报道pcDNA3.0可表达多种外源基因使之表达各种蛋白. 我们的实验结果表明，通过构建一个携带Cx 43外源基因的真核表达载体可使之在MSCs中表达，但表达量不是很高，且在细胞连接部位及胞质内也有表达. 我们实验仅为体外初步探讨Cx 43在MSCs中的过量表达，但在细胞移植体内后Cx 43蛋白表达情况以及对MSCs向心肌细胞分化有何影响尚待进一步研究.
【参考文献】
[1] Kehat I, KenyaginKarsenti D, Snir M, et al. Human embryonic stem cells can differentiate into myocytes with structural and functional properties of cardiomyocytes [J]. J Clin Invest, 2001;108:407-414.
[2] Reinecke H, Zhang M, Bartosek T, et al. Survival, integration, and differentiation of cardiomyocyte grafts [J]. Circulation, 1999;100:193-202.
[3] Suzuki K, Brand NJ, Jayakumar J, et al. Development of a novel method for cell transplantation through the coronary artery [J]. Circulation, 2000;10:Ⅲ359-Ⅲ364.
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[5] Makino S, Fukuda K, Miyoshi S, et al. Cardiomyocytes can be generated from marrow stromal cells in vivo [J]. J Clin Invest, 1999;103:697-705.
[6] Nolta JA, Hanley MB, Kohn DB, et al. Sustained human hematopoiesis in immunodeficient mice by cotransplantation of marrow stroma expressing human interleukins: Analysis of gene transduction of longlived progenitors [J]. Blood, 1994;83:3041-3051.
[7] Bolotin E, Nolta J, Smith S, et al. Gene therapy with marrow stroma transduced with IL7 gene rapidly after murine bone marrow transplant [J]. Blood, 1996;88:135.
[8] Hurwitz DR, Kirchgesser M, Merrill W, et al. Systemic delivery of human growth hormone or human factor IX in dogs by reintroduced genetically modified autologous bone marrow stromal cells [J]. Hum Gene Ther, 1997;8:137-156.
[9] Chedrawy E, Wang J, Nguyen D, et al. Incorporation and integration of implanted myogenic and stem cells into native myocardial fibers: Anatomic basis for functional improvements [J]. J Thorac Cardiovasc Surg, 2002;124:584-590.
[10] Beyer E, Paul D, Goodenough D. Connexin 43: A protein from rat heart homologous to a gap junction protein from liver [J]. J Cell Biol, 1987;105:2621-2629.
作者简介：周和平(1977)，男(汉族)，安徽省芜湖市人. 硕士. (029)83375311Email. zhplove1234@163.com
(第四军医大学西京医院心血管外科中心，陕西 西安，710033)
编辑王睿, 百拇医药(周和平，蔡振杰，俞世强，赵科研，吴铁军)