反义cmyc重组腺病毒载体的构建及其对大鼠气道平滑肌细胞增殖的抑制作用
Construction of antisense recombinant adenoviral vector for cmyc and its antiproliferative effects on rat airway smooth muscle cells
LIU YingGe, QI HaoWen, LI HuanZhang, SU MingQuan, YU WenBin, MA YueYun
1Department of Respiratory Medicine, 2Department of Clinical Laboratory, Xijing Hospital, Fourth Military Medical University, Xi’an 710033, China
【Abstract】 AIM: To observe the antiproliferative effects of antisense recombinant adenoviral vector for cmyc on rat airway smooth muscle cells. METHODS: Antisense and sense bacterial plasmids for cmyc were constructed. Bacterial plasmids and E1 deleted adrenoviral plasmid were cotransfected into 293 cells. Recombinant adenoviral vectors were obtained after cotransfection. The antiproliferative effects were assayed by MTT and the expression of cMyc was detected by immunohistochemistry. RESULTS: The results showed that antisense recombinant adenoviral vector for cmyc could inhibit rat airway smooth muscle cells proliferation. The expression of cMyc decreased after antisense recombinant adenoviral vector for cmyc was transfected into cells. CONCLUSION: Recombinant adenoviral vector antisense for cmyc can inhibit rat airway smooth muscle cells proliferation.
【Keywords】 gene, cmyc; antisense nucleotide; recombinant adenoviral vector; smooth muscle
【摘要】 目的: 观察反义cmyc重组腺病毒载体对大鼠气道平滑肌细胞增殖的抑制作用. 方法: 构建大鼠反义及正义cmyc细菌质粒，并将所得细菌质粒及腺病毒E1缺失质粒导入293细胞系，经共转染得到正义及反义重组腺病毒载体. MTT法检测重组腺病毒载体对大鼠气道平滑肌细胞增殖的抑制作用，免疫组织化学染色检测重组腺病毒载体对cMyc蛋白的表达. 结果: 反义cmyc重组腺病毒载体可抑制大鼠气道平滑肌细胞增殖，降低气道平滑肌细胞cMyc蛋白的表达. 结论: 反义cmyc重组腺病毒载体可抑制大鼠气道平滑肌细胞增殖.
【关键词】 cmyc基因;反义核酸;腺病毒载体;平滑肌
0引言
相关的研究结果表明，抑制cmyc的转录及翻译可降低cMyc蛋白的表达，从而抑制细胞增殖. 本实验的前期也利用反义寡核苷酸对cmyc的表达进行干预，实验表明反义cmyc寡核苷酸可抑制大鼠气道平滑肌细胞(airway smooth muscle cells, ASMC)增殖，降低cMyc蛋白的表达[1]. 为了提高转染效率，并为将反义cmyc技术进一步应用到动物实验打下基础，本研究构建了反义cmyc重组腺病毒载体，并进行了部分离体实验.
1材料和方法
1.1材料
T4连接酶(Gibco公司)；限制性内切酶EcoR I及BamH I(大连TaKaRa宝生物工程有限公司)；Wizard Plus Minipreps DNA Purification Systems和Wizard PCR Preps DNA Purification System (Promega公司)；pcDNA3质粒(荷兰Invitrogen公司)；E.coli JM 109和293细胞系由第四军医大学西京医院检验科保存. pDC315及pBHGlox(delta)E1,3Cre质粒(加拿大Microbix Biosystems Inc.)，由本校骨科研究所李立文惠赠.
1.2方法
1.2.1反义及正义cmyc目的基因片段的扩增分别设计2对PCR引物，其扩增产物分别命名为反义cmyc (360 bp)和正义cmyc (360 bp). 引物序列如下：反义cmyc：P1：5′ GGTGAATTCTTGGGGTACGCGCTGC 3′，P2：5′ CCCTGGATCCGAAGGACGTAGCGAC 3′，正义cmyc：P1：5′ GGTGGATCCTTGGGGTACGC 3′，P2：5′ CCCTGAATTCGAAGGACGTAGCG 3′. 反义cmyc扩增条件：94℃变性10 min，94℃ 1 min, 65℃ 2 min, 72℃ 3 min共35 个循环，72℃ 10 min延伸，4℃保温. 正义cmyc扩增条件：94℃变性10 min，94℃ 1 min, 50℃ 2 min, 72℃ 3 min共30 个循环，72℃ 10 min延伸，4℃保温. 目的片段经10 g/L琼脂糖凝胶电泳，Wizard PCR Preps DNA Purification System回收.
1.2.2真核表达载体的构建PCR扩增产物和pcDNA3经EcoR I和BamH I双酶切，Wizard PCR Preps DNA Purification System回收，T4 DNA连接酶连接，转化. Amp+琼脂糖平板筛选阳性克隆，分别命名为：pcDNA3360antisense和pcDNA3360sense.
1.2.3细菌质粒的构建pcDNA3mycantisense, pcDNA3mycsense和pDC315经EcoR I和BamH I双酶切、10 g/L琼脂糖凝胶电泳、Wizard PCR Preps DNA Purification System回收，T4 DNA连接酶连接，转化. Amp+琼脂糖平板筛选阳性克隆，分别命名为：pDC315mycantisense和pDC315mycsense.
1.2.4重组腺病毒载体的构建利用阳离子脂质体将质粒和E1区缺失腺病毒质粒Cre同时导入293细胞系，进行细胞内同源重组. 转染前24 h以2×105/mL的浓度将293细胞接种于6孔板，取7 μL pDC315mycantisense或7 μL pDC315mycsense(3 mL LB培养液中所有细菌提取的质粒)加入90 μL无血清、无抗生素的DMEM中；将5 μL Lipofectin加入95 μL无血清、无抗生素DMEM中，静置30~45 min后混合上述两培养液，静置15 min后与1.8 mL无血清、无抗生素DMEM混合. 以无血清、无抗生素DMEM洗涤细胞两次，将上述混合液加入6孔板. 每日观察细胞生长状况.
1.2.5重组腺病毒载体的收获和鉴定待细胞出现病变时(7 d)收集病变细胞，-70℃反复冻融3次，于4℃, 5000 r/min离心20 min，取上清，用0.22 μm的微孔滤器过滤，分别命名为：AntisenseAd和SenseAd，收获的重组腺病毒-70℃保存备用；PCR检测上清液中重组腺病毒载体. 引物设计和扩增同1.2.1.
1.2.6重组腺病毒载体对ASMC的增殖抑制作用MTT法观察AntisenseAd和SenseAd对大鼠气道平滑肌的增殖抑制作用：以2 g/L胰酶消化细胞，调整细胞浓度至7×104/mL，每孔接种100 μL，5 d后观察重组腺病毒载体对ASMC的影响.
1.2.7重组腺病毒载体对cMyc表达的抑制作用ASMC感染重组腺病毒后3 d，收获细胞爬片，PBS洗涤2次，950 mL/L乙醇固定，标准SABC法行免疫组织化学染色. 以正常小鼠血清和磷酸盐缓冲液分别代替一抗和二抗，行替代对照和空白对照.
统计学处理： 数据以x±s表示，经SPSS软件分析，组间比较采用Oneway ANOVA检验.
2结果
2.1真核表达载体阳性克隆的鉴定pcDNA3mycantisense和pcDNA3mycsense经EcoR I和BamH I双酶切电泳鉴定(Fig 1)，可见到约360 bp的片段，与理论值符合. 进一步测定pcDNA3mycantisense和pcDNA3mycsense核苷酸序列，测序结果正确(测序图略).
2.2真核表达载体阳性克隆的鉴定pDC315mycsense和pDC315mycantisense经双酶切鉴定(Fig 2), 可见到约360 bp的片段，与理论值符合，证明cmyc连接到pDC315正确.
2.3重组腺病毒的鉴定PCR检测变性293细胞上清液中重组cmyc腺病毒载体(Fig 3), 可见到约360 bp的片段，与理论值符合，证明cmyc成功连接到腺病毒载体中.
2.4同源重组后293细胞系的病理变化同源重组后第5日，293细胞开始出现病变：细胞肿胀，细胞质浑浊. 细胞培养至第7日，上述变化进一步明显并成片出现，细胞大量死亡(Fig 4).
2.5重组腺病毒载体对ASMC的增殖抑制作用AntisenseAd作用大鼠ASMC 5 d，细胞生长减缓，与对照组比较有明显差异. SenseAd对细胞生长少有影响(Fig 5).
2.6重组腺病毒载体对cMyc表达的抑制作用AntisenseAd作用于细胞5 d，cMyc表达减少(Fig 6).
3讨论
基因治疗的最重要手段之一是将目的基因克隆于载体中，然后导入细胞，其中以克隆于病毒载体最为有效. 腺病毒是双链DNA病毒，其中E1区和E3区可被外源基因替代，E1区缺失的腺病毒可在293细胞中复制，这一细胞系是用Ad5的E1区转化人胚肾上皮细胞而获得的，可表达E1蛋白. E1区缺失腺病毒与含目的基因的穿梭质粒可在293细胞内进行同源重组，获得重组腺病毒.
腺病毒载体作为基因转染的有效手段具有以下优点：腺病毒的基因结构已经比较清楚，可插入的外源基因片段可达7.5 kb；腺病毒颗粒无外膜，在结构上比较稳定，对补体介导的灭活也不敏感；4, 7型野生型腺病毒可感染人体呼吸道上皮，但不引起明显症状，并无致瘤性；腺病毒无基因整合的证据. 腺病毒载体最大缺点是个别病例的严重免疫反应以及无选择性. 本实验在成功构建反义cmyc腺病毒载体后，很方便就可将腺病毒转染到大鼠ASMC内，显示了腺病毒载体容易操作及转染效率高的特点.
大鼠ASMC转染反义cmyc腺病毒载体后4 d，细胞生长较对照组及正义cmyc腺病毒载体组明显减慢，说明反义cmyc腺病毒载体可抑制ASMC增殖；免疫组织化学染色显示反义cmyc腺病毒载体可抑制cMyc蛋白的表达，表明反义cmyc腺病毒载体的确可干扰cmyc的转录和(或)翻译.
相关的研究显示反义cmyc重组腺病毒载体可抑制人肝癌及胃癌细胞系生长，抑制cMyc的表达并阻滞细胞周期于G1期，反义cmyc重组腺病毒载体同时诱导了人肝癌及胃癌细胞系的凋亡[2, 3]. 反义cmyc重组腺病毒载体还可抑制人宫颈癌细胞系cMyc的表达并抑制细胞生长，但当宫颈癌细胞高表达Bcl2时，其抑制作用明显降低[4]. 反义cmyc重组腺病毒载体可降低人肺腺癌细胞系cmyc的表达，抑制细胞于G1期，同时降低周期素D1, Bcl2及Bax的表达[5]. 另有研究显示正义cmyc重组腺病毒载体可刺激细胞进入S期，而刺激细胞分裂，反义cmyc重组腺病毒载体可降低S期细胞的数量，从而延长细胞周期[6]. 当然，细胞的生长和分化受众多因素调控，而且这些因素相互作用，相互影响，cmyc只是其中的一个，抑制cMyc的表达不可能完全抑制细胞的生长和分化. 研究表明Smad, Mad等均参与细胞生长，且与cmyc相互作用[7-9].
动物腹腔注射反义cmyc重组腺病毒载体后腺病毒主要分布于肝脏、脾脏和胃，并无明显炎症出现，表明反义cmyc重组腺病毒载体是安全的[10]. 腺病毒做为基因转染载体具有高效、方便等特点. 但其安全性及无选择性仍使其在临床的应用受到一定限制.
【参考文献】
[1] 刘颖格，戚好文，李焕章，等. 反义cmyc寡核苷酸抑制大鼠气道平滑肌细胞增殖[J]. 第四军医大学学报, 2002;23(13):1191-1194.
Liu YG, Qi HW, Li HZ, et al. Antiproliferative effect of cmyc antisense oligonucleotide on ratairway smooth muscle cells [J]. J Fourth Mil Med Univ, 2002;23(13):1191-1194.
[2] 张海增，邵永孚，林晨，等. 反义cmyc重组腺病毒对人肝细胞癌细胞的实验性治疗[J]. 中华医学杂志，2001;81(11):673-676.
Zhang HZ, Shao YF, Lin C, et al. Experimental therapy of adenovirus transferred antisense cmyc on hepatocellular cancer cell [J]. Natl Med J Chin, 2001;81(11):673-676.
[3] Chen JP, Lin C, Xu CP, et al. Molecular therapy with recombinant antisense cmyc adenovirus for human gastric carcinoma cells in vitro and in vivo [J]. J Gastroenterol Hepatol, 2001; 16(1): 22-28.
[4] 陈洁平，林晨，邓友平，等. 重组RA538、反义cmyc腺病毒对bcl2高表达细胞系的作用及分子机制[J]. 中华肿瘤杂志, 2000; 22(4): 279-282.
Chen JP，Lin C，Deng YP， et al. The effect of RA538 and antisense cmyc on cervical cancer cell lines with hight expression of bcl2 gene [J]. Chin J Oncol, 2000; 22(4): 279-282.
[5] 隗王月，林晨，张雪艳，等. 腺病毒介导的反义cmyc选择性诱导肿瘤细胞G1期阻滞和凋亡的研究[J]. 中华医学杂志，1999; 79(8): 617-620.
Wei Y, Lin C, Zhang XY, et al. Adenovirus transferred antisense cmyc selectively induces tumor cell cycle arrest and apoptosis [J]. Natl Med J Chin, 1999; 79(8): 617-620.
[6] Kolli S, Buchmann AM, Williams J, et al. Antisensemediated depletion of p300 in human cells leads to premature G1 exit and upregulation of cMYC [J]. Proc Natl Acad Sci USA, 2001; 98(8): 4646-4651.
[7] Yagi K, Furuhashi M, Aoki H, et al. cmyc is a downstream target of the Smad pathway [J]. J Biol Chem, 2002; 277(1): 854-861.
[8] Yin X, Landay MF, Han W, et al. Dynamic in vivo interactions among Myc network members [J]. Oncogene, 2001; 20(34): 4650-4664.
[9] Soucie EL, Annis MG, Sedivy J, et al. Myc potentiates apoptosis by stimulating Bax activity at the mitochondria [J]. Mol Cell Biol, 2001; 21(14): 4725-4736.
[10] 张海增，林晨，隗王月，等. 携带反义cmyc的重组腺病毒安全性研究[J]. 中华肿瘤杂志, 2000; 22(2): 116-119.
Zhang HZ, Lin C, Wei Y, et al. Safety evalution of Ad As myc in vitro and in viro [J]. Chin J Oncol, 2000; 22(2): 116-119.
基金项目：国家自然科学基金(39370325)
通讯作者：戚好文. Tel.(029)83375577 Email.qihaowen@fmmu.edu.cn
作者简介：刘颖格(1968)，男(汉族)，陕西省户县人. 博士，主治医师. Tel.(029)83375237Email.liuyingge@fmmu.edu.cn
(第四军医大学西京医院:1呼吸内科，2检验科，陕西 西安 710033)
编辑王雪萍, http://www.100md.com(刘颖格，戚好文，李焕章，苏明权，于文彬，马越云)
LIU YingGe, QI HaoWen, LI HuanZhang, SU MingQuan, YU WenBin, MA YueYun
1Department of Respiratory Medicine, 2Department of Clinical Laboratory, Xijing Hospital, Fourth Military Medical University, Xi’an 710033, China
【Abstract】 AIM: To observe the antiproliferative effects of antisense recombinant adenoviral vector for cmyc on rat airway smooth muscle cells. METHODS: Antisense and sense bacterial plasmids for cmyc were constructed. Bacterial plasmids and E1 deleted adrenoviral plasmid were cotransfected into 293 cells. Recombinant adenoviral vectors were obtained after cotransfection. The antiproliferative effects were assayed by MTT and the expression of cMyc was detected by immunohistochemistry. RESULTS: The results showed that antisense recombinant adenoviral vector for cmyc could inhibit rat airway smooth muscle cells proliferation. The expression of cMyc decreased after antisense recombinant adenoviral vector for cmyc was transfected into cells. CONCLUSION: Recombinant adenoviral vector antisense for cmyc can inhibit rat airway smooth muscle cells proliferation.
【Keywords】 gene, cmyc; antisense nucleotide; recombinant adenoviral vector; smooth muscle
【摘要】 目的: 观察反义cmyc重组腺病毒载体对大鼠气道平滑肌细胞增殖的抑制作用. 方法: 构建大鼠反义及正义cmyc细菌质粒，并将所得细菌质粒及腺病毒E1缺失质粒导入293细胞系，经共转染得到正义及反义重组腺病毒载体. MTT法检测重组腺病毒载体对大鼠气道平滑肌细胞增殖的抑制作用，免疫组织化学染色检测重组腺病毒载体对cMyc蛋白的表达. 结果: 反义cmyc重组腺病毒载体可抑制大鼠气道平滑肌细胞增殖，降低气道平滑肌细胞cMyc蛋白的表达. 结论: 反义cmyc重组腺病毒载体可抑制大鼠气道平滑肌细胞增殖.
【关键词】 cmyc基因;反义核酸;腺病毒载体;平滑肌
0引言
相关的研究结果表明，抑制cmyc的转录及翻译可降低cMyc蛋白的表达，从而抑制细胞增殖. 本实验的前期也利用反义寡核苷酸对cmyc的表达进行干预，实验表明反义cmyc寡核苷酸可抑制大鼠气道平滑肌细胞(airway smooth muscle cells, ASMC)增殖，降低cMyc蛋白的表达[1]. 为了提高转染效率，并为将反义cmyc技术进一步应用到动物实验打下基础，本研究构建了反义cmyc重组腺病毒载体，并进行了部分离体实验.
1材料和方法
1.1材料
T4连接酶(Gibco公司)；限制性内切酶EcoR I及BamH I(大连TaKaRa宝生物工程有限公司)；Wizard Plus Minipreps DNA Purification Systems和Wizard PCR Preps DNA Purification System (Promega公司)；pcDNA3质粒(荷兰Invitrogen公司)；E.coli JM 109和293细胞系由第四军医大学西京医院检验科保存. pDC315及pBHGlox(delta)E1,3Cre质粒(加拿大Microbix Biosystems Inc.)，由本校骨科研究所李立文惠赠.
1.2方法
1.2.1反义及正义cmyc目的基因片段的扩增分别设计2对PCR引物，其扩增产物分别命名为反义cmyc (360 bp)和正义cmyc (360 bp). 引物序列如下：反义cmyc：P1：5′ GGTGAATTCTTGGGGTACGCGCTGC 3′，P2：5′ CCCTGGATCCGAAGGACGTAGCGAC 3′，正义cmyc：P1：5′ GGTGGATCCTTGGGGTACGC 3′，P2：5′ CCCTGAATTCGAAGGACGTAGCG 3′. 反义cmyc扩增条件：94℃变性10 min，94℃ 1 min, 65℃ 2 min, 72℃ 3 min共35 个循环，72℃ 10 min延伸，4℃保温. 正义cmyc扩增条件：94℃变性10 min，94℃ 1 min, 50℃ 2 min, 72℃ 3 min共30 个循环，72℃ 10 min延伸，4℃保温. 目的片段经10 g/L琼脂糖凝胶电泳，Wizard PCR Preps DNA Purification System回收.
1.2.2真核表达载体的构建PCR扩增产物和pcDNA3经EcoR I和BamH I双酶切，Wizard PCR Preps DNA Purification System回收，T4 DNA连接酶连接，转化. Amp+琼脂糖平板筛选阳性克隆，分别命名为：pcDNA3360antisense和pcDNA3360sense.
1.2.3细菌质粒的构建pcDNA3mycantisense, pcDNA3mycsense和pDC315经EcoR I和BamH I双酶切、10 g/L琼脂糖凝胶电泳、Wizard PCR Preps DNA Purification System回收，T4 DNA连接酶连接，转化. Amp+琼脂糖平板筛选阳性克隆，分别命名为：pDC315mycantisense和pDC315mycsense.
1.2.4重组腺病毒载体的构建利用阳离子脂质体将质粒和E1区缺失腺病毒质粒Cre同时导入293细胞系，进行细胞内同源重组. 转染前24 h以2×105/mL的浓度将293细胞接种于6孔板，取7 μL pDC315mycantisense或7 μL pDC315mycsense(3 mL LB培养液中所有细菌提取的质粒)加入90 μL无血清、无抗生素的DMEM中；将5 μL Lipofectin加入95 μL无血清、无抗生素DMEM中，静置30~45 min后混合上述两培养液，静置15 min后与1.8 mL无血清、无抗生素DMEM混合. 以无血清、无抗生素DMEM洗涤细胞两次，将上述混合液加入6孔板. 每日观察细胞生长状况.
1.2.5重组腺病毒载体的收获和鉴定待细胞出现病变时(7 d)收集病变细胞，-70℃反复冻融3次，于4℃, 5000 r/min离心20 min，取上清，用0.22 μm的微孔滤器过滤，分别命名为：AntisenseAd和SenseAd，收获的重组腺病毒-70℃保存备用；PCR检测上清液中重组腺病毒载体. 引物设计和扩增同1.2.1.
1.2.6重组腺病毒载体对ASMC的增殖抑制作用MTT法观察AntisenseAd和SenseAd对大鼠气道平滑肌的增殖抑制作用：以2 g/L胰酶消化细胞，调整细胞浓度至7×104/mL，每孔接种100 μL，5 d后观察重组腺病毒载体对ASMC的影响.
1.2.7重组腺病毒载体对cMyc表达的抑制作用ASMC感染重组腺病毒后3 d，收获细胞爬片，PBS洗涤2次，950 mL/L乙醇固定，标准SABC法行免疫组织化学染色. 以正常小鼠血清和磷酸盐缓冲液分别代替一抗和二抗，行替代对照和空白对照.
统计学处理： 数据以x±s表示，经SPSS软件分析，组间比较采用Oneway ANOVA检验.
2结果
2.1真核表达载体阳性克隆的鉴定pcDNA3mycantisense和pcDNA3mycsense经EcoR I和BamH I双酶切电泳鉴定(Fig 1)，可见到约360 bp的片段，与理论值符合. 进一步测定pcDNA3mycantisense和pcDNA3mycsense核苷酸序列，测序结果正确(测序图略).
2.2真核表达载体阳性克隆的鉴定pDC315mycsense和pDC315mycantisense经双酶切鉴定(Fig 2), 可见到约360 bp的片段，与理论值符合，证明cmyc连接到pDC315正确.
2.3重组腺病毒的鉴定PCR检测变性293细胞上清液中重组cmyc腺病毒载体(Fig 3), 可见到约360 bp的片段，与理论值符合，证明cmyc成功连接到腺病毒载体中.
2.4同源重组后293细胞系的病理变化同源重组后第5日，293细胞开始出现病变：细胞肿胀，细胞质浑浊. 细胞培养至第7日，上述变化进一步明显并成片出现，细胞大量死亡(Fig 4).
2.5重组腺病毒载体对ASMC的增殖抑制作用AntisenseAd作用大鼠ASMC 5 d，细胞生长减缓，与对照组比较有明显差异. SenseAd对细胞生长少有影响(Fig 5).
2.6重组腺病毒载体对cMyc表达的抑制作用AntisenseAd作用于细胞5 d，cMyc表达减少(Fig 6).
3讨论
基因治疗的最重要手段之一是将目的基因克隆于载体中，然后导入细胞，其中以克隆于病毒载体最为有效. 腺病毒是双链DNA病毒，其中E1区和E3区可被外源基因替代，E1区缺失的腺病毒可在293细胞中复制，这一细胞系是用Ad5的E1区转化人胚肾上皮细胞而获得的，可表达E1蛋白. E1区缺失腺病毒与含目的基因的穿梭质粒可在293细胞内进行同源重组，获得重组腺病毒.
腺病毒载体作为基因转染的有效手段具有以下优点：腺病毒的基因结构已经比较清楚，可插入的外源基因片段可达7.5 kb；腺病毒颗粒无外膜，在结构上比较稳定，对补体介导的灭活也不敏感；4, 7型野生型腺病毒可感染人体呼吸道上皮，但不引起明显症状，并无致瘤性；腺病毒无基因整合的证据. 腺病毒载体最大缺点是个别病例的严重免疫反应以及无选择性. 本实验在成功构建反义cmyc腺病毒载体后，很方便就可将腺病毒转染到大鼠ASMC内，显示了腺病毒载体容易操作及转染效率高的特点.
大鼠ASMC转染反义cmyc腺病毒载体后4 d，细胞生长较对照组及正义cmyc腺病毒载体组明显减慢，说明反义cmyc腺病毒载体可抑制ASMC增殖；免疫组织化学染色显示反义cmyc腺病毒载体可抑制cMyc蛋白的表达，表明反义cmyc腺病毒载体的确可干扰cmyc的转录和(或)翻译.
相关的研究显示反义cmyc重组腺病毒载体可抑制人肝癌及胃癌细胞系生长，抑制cMyc的表达并阻滞细胞周期于G1期，反义cmyc重组腺病毒载体同时诱导了人肝癌及胃癌细胞系的凋亡[2, 3]. 反义cmyc重组腺病毒载体还可抑制人宫颈癌细胞系cMyc的表达并抑制细胞生长，但当宫颈癌细胞高表达Bcl2时，其抑制作用明显降低[4]. 反义cmyc重组腺病毒载体可降低人肺腺癌细胞系cmyc的表达，抑制细胞于G1期，同时降低周期素D1, Bcl2及Bax的表达[5]. 另有研究显示正义cmyc重组腺病毒载体可刺激细胞进入S期，而刺激细胞分裂，反义cmyc重组腺病毒载体可降低S期细胞的数量，从而延长细胞周期[6]. 当然，细胞的生长和分化受众多因素调控，而且这些因素相互作用，相互影响，cmyc只是其中的一个，抑制cMyc的表达不可能完全抑制细胞的生长和分化. 研究表明Smad, Mad等均参与细胞生长，且与cmyc相互作用[7-9].
动物腹腔注射反义cmyc重组腺病毒载体后腺病毒主要分布于肝脏、脾脏和胃，并无明显炎症出现，表明反义cmyc重组腺病毒载体是安全的[10]. 腺病毒做为基因转染载体具有高效、方便等特点. 但其安全性及无选择性仍使其在临床的应用受到一定限制.
【参考文献】
[1] 刘颖格，戚好文，李焕章，等. 反义cmyc寡核苷酸抑制大鼠气道平滑肌细胞增殖[J]. 第四军医大学学报, 2002;23(13):1191-1194.
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Zhang HZ, Shao YF, Lin C, et al. Experimental therapy of adenovirus transferred antisense cmyc on hepatocellular cancer cell [J]. Natl Med J Chin, 2001;81(11):673-676.
[3] Chen JP, Lin C, Xu CP, et al. Molecular therapy with recombinant antisense cmyc adenovirus for human gastric carcinoma cells in vitro and in vivo [J]. J Gastroenterol Hepatol, 2001; 16(1): 22-28.
[4] 陈洁平，林晨，邓友平，等. 重组RA538、反义cmyc腺病毒对bcl2高表达细胞系的作用及分子机制[J]. 中华肿瘤杂志, 2000; 22(4): 279-282.
Chen JP，Lin C，Deng YP， et al. The effect of RA538 and antisense cmyc on cervical cancer cell lines with hight expression of bcl2 gene [J]. Chin J Oncol, 2000; 22(4): 279-282.
[5] 隗王月，林晨，张雪艳，等. 腺病毒介导的反义cmyc选择性诱导肿瘤细胞G1期阻滞和凋亡的研究[J]. 中华医学杂志，1999; 79(8): 617-620.
Wei Y, Lin C, Zhang XY, et al. Adenovirus transferred antisense cmyc selectively induces tumor cell cycle arrest and apoptosis [J]. Natl Med J Chin, 1999; 79(8): 617-620.
[6] Kolli S, Buchmann AM, Williams J, et al. Antisensemediated depletion of p300 in human cells leads to premature G1 exit and upregulation of cMYC [J]. Proc Natl Acad Sci USA, 2001; 98(8): 4646-4651.
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基金项目：国家自然科学基金(39370325)
通讯作者：戚好文. Tel.(029)83375577 Email.qihaowen@fmmu.edu.cn
作者简介：刘颖格(1968)，男(汉族)，陕西省户县人. 博士，主治医师. Tel.(029)83375237Email.liuyingge@fmmu.edu.cn
(第四军医大学西京医院:1呼吸内科，2检验科，陕西 西安 710033)
编辑王雪萍, http://www.100md.com(刘颖格，戚好文，李焕章，苏明权，于文彬，马越云)