内皮细胞生长因子对人胆囊上皮细胞培养的影响
Effects of endothelial cell growth factor on human gallbladder epithelial cells culture
PAN GuangDong, XIONG XianZe, LIU JiangWen, LI ShengFu, CHENG NanSheng, YAN LüNan
1Department of General Surgery, 2Laboratory of Transplant and Immunology, West China Hospital, Sichuan University, Chengdu 610041, China
【Abstract】 AIM: To explore the effects of endothelial cell growth factor (EGF) on human gallbladder epithelial cells (HGBEC) culture in vitro. METHODS: HGBEC were cultured in DMEM medium with EGF and compared with those in control group without EGF. RESULTS: The number of HGBEC in test group was more than that in control group (4.6×107/aperture vs 2.6×107/aperture, P<0.05), so was the duration of HGBEC in test group. From the sixth to seventh day, the number of HGBEC was the highest and the longest duration was 25 d. CONCLUSION: EGF added to DMEM medium can prolong the duration of HGBEC and increase the number of HGBEC.
【Keywords】 gallbladder epithelial cells; endothelial cell growth factor; duration
【摘要】 目的: 探索内皮细胞生长因子(EGF)对人胆囊上皮(HGBEC)细胞体外培养的影响. 方法: 培养基中添加EGF进行细胞培养，与培养基中未添加EGF组进行比较. 结果: 添加EGF组胆囊上皮细胞数目(平均4.6×107个/孔)较未添加组(2.6×107个/孔)增多(P<0.05)，存活时间明显延长(从8.3 d增加到18.6 d)(P<0.05)，第6~7日细胞数达最高值，可维持10~12 d，细胞最长可存活25 d. 结论: 培养基中添加EGF可明显延长胆囊上皮细胞体外培养的存活时间.
【关键词】 胆囊上皮细胞；内皮细胞生长因子；存活时间
0引言
了解正常胆囊上皮细胞的生物学特性和病变的胆囊上皮细胞的病理生理学特征，对提示胆囊病变的发病机制、诊断和治疗具有重要意义. 虽然国内已有成功分离培养人胆囊上皮细胞(human gallbladder epithelia cells, HGBEC)的报道，但其体外存活时间短仍是影响进行深入研究的障碍. 我们在培养基中添加内皮细胞生长因子，对其培养及生物学特性的影响进行研究，探索人胆囊上皮细胞的适宜分离方法和体外最佳生长条件，为利用体外模型进行深入研究胆囊的生理功能和相关疾病的病理机制奠定基础.
1材料和方法
1.1材料
胆囊标体来自肝移植供肝切除之正常胆囊，经病理检查证明无明显炎症者，手术室中无菌操作条件下，经底部切口排除胆汁，用生理盐水多次冲洗胆囊黏膜，置UW液中低温保存送实验室. DHank’s，Hank’s及PBS液配制方法见文献[1],DMEB培养基(Sigma),IV型胶原酶(Sigma). 包被液: IV型胶原酶配成200 g/L，4℃保存. 小牛血清(Hyclon)加入培养基至终浓度200 mL/L. 内皮细胞生长因子(endothelial cell growth factor, EGF)(Sigma). CK19抗体(北京中山生物试剂公司).
1.2方法
先用小牛血清包被，37℃烘干后，再用200 g/L IV型胶原酶包被，37℃烘干后备用. 无菌条件下剪开胆囊，以Hanks缓冲液反复冲洗，无菌纱布蘸干，修剪胆囊，切除脂肪组织后置于消化液中，37℃消化，约20 min后，用刀片轻轻刮剥胆囊黏膜层，收集细胞悬液，经100目筛网过滤后1200 r/min离心10 min，再用DMEM培养基离心洗涤细胞沉淀2次. 用DMEM生长培养基(含200 mL/L)小牛血清、5 mmol 谷氨酰胺、20 mmol HEPES、青毒素1.0×103 u/L、链霉素100 mg/L)悬液洗涤后的细胞，按(5～10)×108/L的细胞密度接种于8个塑料培养皿内，37℃培养24 h以去除其中的非上皮细胞. 同时以加有10 μg/L hEGF的DMEM培养基接种培养相同皿数的细胞，作为对照. 用台盼蓝染色活细胞数>95%, 置37℃，50 mL/L CO2，饱和湿度的CO2培养箱内培养，24 h后全量换液，以后每2.5 d换液1次. 每24 h行细胞计数， 用2.5 mL/L胰蛋白酶和0.1 mL/L EDTA消化3孔作细胞计数，取均值绘制细胞生长曲线. 倒置显微镜观察细胞形态及贴壁情况. 于培养第3日取出细胞固定于载玻片上，按常规方法以上皮细胞标记角蛋白CK19的兔抗人IgG为一抗、HRP标记的羊抗兔IgG为二抗进行免疫组化染色，DAB显色、苏木素复染，观察细胞着色及纯度.
统计学处理：所测细胞数及存活时间数据以x±s表示,用t检验，显著性标准α=0.05.
2结果
2.1采用IV型胶原酶消化法效率高每个人胆囊可以分离得到(5～10)×107个胆囊上皮细胞，能满足培养的需要. 我们对陈东风等[2]之方法进行了改良，操作更简单、快捷，同样可以满足要求.
2.2HGBEC的培养①生长曲线: 各组HGBEC进行细胞计数后绘制生长曲线. 不添加EGF组，HGBEC体外培养1 wk内生长较为活跃，第6~7日细胞数达最高值， 维持2 d后开始下降，平均细胞数2.6×107个/孔，但1 wk内细胞数仍可维持较高水平，原代培养最长可达16 d，平均存活时间8.3 d. 添加上皮细胞生长因子组，细胞数及细胞存活时间均明显增加，第6~7日达最高值，平均细胞数4.6×107个/孔，可维持10~12 d，进入平台期，第20日后出现拉丝、拉网现象，胞质内出现空泡，细胞最长可存活25 d，平均存活18.6 d. 添加EGF组和未添加EGF组HGBEC细胞数及生存时间差异显著(P<0.05)，有统计学意义，说明培养基内添加EGF可以促进HGBEC生长; ②形态和生长特性变化: 经消化、刮剥，再消化，过滤及离心洗涤的HGBEC在不同的培养基中生长情况有明显不同. 在添加EGF组，在接种6 h后开始贴壁，24 h后大部分贴壁并伸展，悬浮和死亡的细胞及碎片经全量换液去除. 大多数细胞呈典型的扁平多角状，部分增生活跃的细胞呈柱状，且细胞核偏向一侧呈极性. 培养6~7 d细胞生长活跃，增殖快，可见腺管样结构(Fig 1A)，而部分增殖活跃的细胞呈柱状，且细胞核偏向一侧呈极性(Fig 1B)，以后逐渐进入平台期，培养第20日后出现拉丝、拉网现象，胞质内出现空泡，片状生长的边缘细胞逐渐脱落. 而未添加EGF组，接种1 d后出现典型核分裂相，第2日出现贴壁，贴壁生长约持续5~6 d，至第10 日细胞显著减少，13~14 d大部分细胞死亡(Fig 1C,D). ③鉴定: 培养细胞采用CK19免疫组化染色为特异性阳性反应，证明所分离培养细胞为HGBEC. 细胞多角形，无极性基(Fig 2A)，而部分细胞呈长梭形，有极性，免疫组化染色同时显示边缘新萌出的细胞仍出现较强的阳性反应(Fig 2B).
3讨论
HGBEC与胆汁直接接触，有分泌黏液和吸收功能，主要在胆汁浓缩、排泄、贮存方面起作用，对结石的形成也有很大影响，也是胆囊多发病如炎症、肿瘤、结石症和寄生虫病的靶部位， 它的分离培养是研究胆囊疾病的基础. 目前HGBEC的分离培养方法[2，3]存活时间短，相关研究的最佳时间是培养1 wk内，明显限制了相关研究的进一步进行.
添加EGF可以促进胆管上皮细胞的增生[4]. 可明显增加细胞数和延长细胞存活时间，对于较长期地观察活细胞的形态结构和生物学特性，进行细胞学、遗传学、免疫学和肿瘤学等多种研究工作，具有重要意义. 若能建立永生株，将对胆囊疾病的实验及临床研究产生积极的推动作用.
在进行细胞分离时我们采用增加消化时间，且直接在胆囊黏膜层进行擦刮，不需将其修剪成小碎片，简化了操作过程，减少了损伤，同样取得满意结果，所得细胞数量、形态均符合要求. 在培养基中添加EGF能明显延长胆囊上皮细胞体外培养的存活时间，细胞数也有较大增加. 而且简化操作过程，改良细胞分离方法，取得满意结果, 为胆囊上皮细胞生物学特性和病理生理研究提供强有力的帮助.
【参考文献】
[1] 蔡文玲，王伯沄. 实用免疫细胞化学与核酸分子杂交技术[M]. 成都：四川科学技术出版社，1994:496-497.
[2] 陈东风，刘为纹，房殿春，等. 人胆囊上皮细胞的分离. 培养与鉴定[J]. 第三军医大学学报,2001；23(9)：1109-1111.
Chen DF, Liu WW, Fang DC, et al. Isolation, culture and identification of human gallbladder epithelial cells[J]. Acta Acad Mil Med Tertiae, 2001;23(9):1109-1111.
[3] 刘革，陈东风. 狗胆囊上皮细胞的分离及原代培养[J]. 世界华人消化杂志, 2001;9(1):99-100.
Liu G, Chen DF. Isolation and primary culture of dog gallbladder epithelial cells[J]. World Chin J Digestol, 2001;9(1):99-100.
[4] 刘厚宝. 人胆管上皮细胞的体外培养及其生物学特性[J]. 肝胆胰外科杂志，1998；10(3):165-166.
Liu HB. Culture in vitro and biological feature of human bile duct epithelial cells[J]. J Hepatobiliary Pancreat Surg, 1998; 10(3):165-166.
基金项目：教育部出国留学回国人员科研启动基金[2001(345)]
通迅作者：程南生. Tel.(028)85422467 Email.pgdhx@126.com
作者简介：潘光栋(1966)，男(汉族), 广西壮族自治区北海市人. 博士生(导师严律南，程南生). Tel.13688084973Email.pgdhx@126.com
(四川大学华西医院：1普外科，2移植免疫实验室， 四川 成都 610041)
编辑甄志强, 百拇医药(潘光栋， 熊先泽，刘江文， 李胜富，程南生，严律南)
PAN GuangDong, XIONG XianZe, LIU JiangWen, LI ShengFu, CHENG NanSheng, YAN LüNan
1Department of General Surgery, 2Laboratory of Transplant and Immunology, West China Hospital, Sichuan University, Chengdu 610041, China
【Abstract】 AIM: To explore the effects of endothelial cell growth factor (EGF) on human gallbladder epithelial cells (HGBEC) culture in vitro. METHODS: HGBEC were cultured in DMEM medium with EGF and compared with those in control group without EGF. RESULTS: The number of HGBEC in test group was more than that in control group (4.6×107/aperture vs 2.6×107/aperture, P<0.05), so was the duration of HGBEC in test group. From the sixth to seventh day, the number of HGBEC was the highest and the longest duration was 25 d. CONCLUSION: EGF added to DMEM medium can prolong the duration of HGBEC and increase the number of HGBEC.
【Keywords】 gallbladder epithelial cells; endothelial cell growth factor; duration
【摘要】 目的: 探索内皮细胞生长因子(EGF)对人胆囊上皮(HGBEC)细胞体外培养的影响. 方法: 培养基中添加EGF进行细胞培养，与培养基中未添加EGF组进行比较. 结果: 添加EGF组胆囊上皮细胞数目(平均4.6×107个/孔)较未添加组(2.6×107个/孔)增多(P<0.05)，存活时间明显延长(从8.3 d增加到18.6 d)(P<0.05)，第6~7日细胞数达最高值，可维持10~12 d，细胞最长可存活25 d. 结论: 培养基中添加EGF可明显延长胆囊上皮细胞体外培养的存活时间.
【关键词】 胆囊上皮细胞；内皮细胞生长因子；存活时间
0引言
了解正常胆囊上皮细胞的生物学特性和病变的胆囊上皮细胞的病理生理学特征，对提示胆囊病变的发病机制、诊断和治疗具有重要意义. 虽然国内已有成功分离培养人胆囊上皮细胞(human gallbladder epithelia cells, HGBEC)的报道，但其体外存活时间短仍是影响进行深入研究的障碍. 我们在培养基中添加内皮细胞生长因子，对其培养及生物学特性的影响进行研究，探索人胆囊上皮细胞的适宜分离方法和体外最佳生长条件，为利用体外模型进行深入研究胆囊的生理功能和相关疾病的病理机制奠定基础.
1材料和方法
1.1材料
胆囊标体来自肝移植供肝切除之正常胆囊，经病理检查证明无明显炎症者，手术室中无菌操作条件下，经底部切口排除胆汁，用生理盐水多次冲洗胆囊黏膜，置UW液中低温保存送实验室. DHank’s，Hank’s及PBS液配制方法见文献[1],DMEB培养基(Sigma),IV型胶原酶(Sigma). 包被液: IV型胶原酶配成200 g/L，4℃保存. 小牛血清(Hyclon)加入培养基至终浓度200 mL/L. 内皮细胞生长因子(endothelial cell growth factor, EGF)(Sigma). CK19抗体(北京中山生物试剂公司).
1.2方法
先用小牛血清包被，37℃烘干后，再用200 g/L IV型胶原酶包被，37℃烘干后备用. 无菌条件下剪开胆囊，以Hanks缓冲液反复冲洗，无菌纱布蘸干，修剪胆囊，切除脂肪组织后置于消化液中，37℃消化，约20 min后，用刀片轻轻刮剥胆囊黏膜层，收集细胞悬液，经100目筛网过滤后1200 r/min离心10 min，再用DMEM培养基离心洗涤细胞沉淀2次. 用DMEM生长培养基(含200 mL/L)小牛血清、5 mmol 谷氨酰胺、20 mmol HEPES、青毒素1.0×103 u/L、链霉素100 mg/L)悬液洗涤后的细胞，按(5～10)×108/L的细胞密度接种于8个塑料培养皿内，37℃培养24 h以去除其中的非上皮细胞. 同时以加有10 μg/L hEGF的DMEM培养基接种培养相同皿数的细胞，作为对照. 用台盼蓝染色活细胞数>95%, 置37℃，50 mL/L CO2，饱和湿度的CO2培养箱内培养，24 h后全量换液，以后每2.5 d换液1次. 每24 h行细胞计数， 用2.5 mL/L胰蛋白酶和0.1 mL/L EDTA消化3孔作细胞计数，取均值绘制细胞生长曲线. 倒置显微镜观察细胞形态及贴壁情况. 于培养第3日取出细胞固定于载玻片上，按常规方法以上皮细胞标记角蛋白CK19的兔抗人IgG为一抗、HRP标记的羊抗兔IgG为二抗进行免疫组化染色，DAB显色、苏木素复染，观察细胞着色及纯度.
统计学处理：所测细胞数及存活时间数据以x±s表示,用t检验，显著性标准α=0.05.
2结果
2.1采用IV型胶原酶消化法效率高每个人胆囊可以分离得到(5～10)×107个胆囊上皮细胞，能满足培养的需要. 我们对陈东风等[2]之方法进行了改良，操作更简单、快捷，同样可以满足要求.
2.2HGBEC的培养①生长曲线: 各组HGBEC进行细胞计数后绘制生长曲线. 不添加EGF组，HGBEC体外培养1 wk内生长较为活跃，第6~7日细胞数达最高值， 维持2 d后开始下降，平均细胞数2.6×107个/孔，但1 wk内细胞数仍可维持较高水平，原代培养最长可达16 d，平均存活时间8.3 d. 添加上皮细胞生长因子组，细胞数及细胞存活时间均明显增加，第6~7日达最高值，平均细胞数4.6×107个/孔，可维持10~12 d，进入平台期，第20日后出现拉丝、拉网现象，胞质内出现空泡，细胞最长可存活25 d，平均存活18.6 d. 添加EGF组和未添加EGF组HGBEC细胞数及生存时间差异显著(P<0.05)，有统计学意义，说明培养基内添加EGF可以促进HGBEC生长; ②形态和生长特性变化: 经消化、刮剥，再消化，过滤及离心洗涤的HGBEC在不同的培养基中生长情况有明显不同. 在添加EGF组，在接种6 h后开始贴壁，24 h后大部分贴壁并伸展，悬浮和死亡的细胞及碎片经全量换液去除. 大多数细胞呈典型的扁平多角状，部分增生活跃的细胞呈柱状，且细胞核偏向一侧呈极性. 培养6~7 d细胞生长活跃，增殖快，可见腺管样结构(Fig 1A)，而部分增殖活跃的细胞呈柱状，且细胞核偏向一侧呈极性(Fig 1B)，以后逐渐进入平台期，培养第20日后出现拉丝、拉网现象，胞质内出现空泡，片状生长的边缘细胞逐渐脱落. 而未添加EGF组，接种1 d后出现典型核分裂相，第2日出现贴壁，贴壁生长约持续5~6 d，至第10 日细胞显著减少，13~14 d大部分细胞死亡(Fig 1C,D). ③鉴定: 培养细胞采用CK19免疫组化染色为特异性阳性反应，证明所分离培养细胞为HGBEC. 细胞多角形，无极性基(Fig 2A)，而部分细胞呈长梭形，有极性，免疫组化染色同时显示边缘新萌出的细胞仍出现较强的阳性反应(Fig 2B).
3讨论
HGBEC与胆汁直接接触，有分泌黏液和吸收功能，主要在胆汁浓缩、排泄、贮存方面起作用，对结石的形成也有很大影响，也是胆囊多发病如炎症、肿瘤、结石症和寄生虫病的靶部位， 它的分离培养是研究胆囊疾病的基础. 目前HGBEC的分离培养方法[2，3]存活时间短，相关研究的最佳时间是培养1 wk内，明显限制了相关研究的进一步进行.
添加EGF可以促进胆管上皮细胞的增生[4]. 可明显增加细胞数和延长细胞存活时间，对于较长期地观察活细胞的形态结构和生物学特性，进行细胞学、遗传学、免疫学和肿瘤学等多种研究工作，具有重要意义. 若能建立永生株，将对胆囊疾病的实验及临床研究产生积极的推动作用.
在进行细胞分离时我们采用增加消化时间，且直接在胆囊黏膜层进行擦刮，不需将其修剪成小碎片，简化了操作过程，减少了损伤，同样取得满意结果，所得细胞数量、形态均符合要求. 在培养基中添加EGF能明显延长胆囊上皮细胞体外培养的存活时间，细胞数也有较大增加. 而且简化操作过程，改良细胞分离方法，取得满意结果, 为胆囊上皮细胞生物学特性和病理生理研究提供强有力的帮助.
【参考文献】
[1] 蔡文玲，王伯沄. 实用免疫细胞化学与核酸分子杂交技术[M]. 成都：四川科学技术出版社，1994:496-497.
[2] 陈东风，刘为纹，房殿春，等. 人胆囊上皮细胞的分离. 培养与鉴定[J]. 第三军医大学学报,2001；23(9)：1109-1111.
Chen DF, Liu WW, Fang DC, et al. Isolation, culture and identification of human gallbladder epithelial cells[J]. Acta Acad Mil Med Tertiae, 2001;23(9):1109-1111.
[3] 刘革，陈东风. 狗胆囊上皮细胞的分离及原代培养[J]. 世界华人消化杂志, 2001;9(1):99-100.
Liu G, Chen DF. Isolation and primary culture of dog gallbladder epithelial cells[J]. World Chin J Digestol, 2001;9(1):99-100.
[4] 刘厚宝. 人胆管上皮细胞的体外培养及其生物学特性[J]. 肝胆胰外科杂志，1998；10(3):165-166.
Liu HB. Culture in vitro and biological feature of human bile duct epithelial cells[J]. J Hepatobiliary Pancreat Surg, 1998; 10(3):165-166.
基金项目：教育部出国留学回国人员科研启动基金[2001(345)]
通迅作者：程南生. Tel.(028)85422467 Email.pgdhx@126.com
作者简介：潘光栋(1966)，男(汉族), 广西壮族自治区北海市人. 博士生(导师严律南，程南生). Tel.13688084973Email.pgdhx@126.com
(四川大学华西医院：1普外科，2移植免疫实验室， 四川 成都 610041)
编辑甄志强, 百拇医药(潘光栋， 熊先泽，刘江文， 李胜富，程南生，严律南)