人ALEX2部分cDNA序列的克隆与表达
Cloning and expression of fragment of the human ALEX2 cDNA
ZHANG Yong, SHI JianGuo, YAN QingGuo, WANG Li, GUO AiLin
Department of Pathology, School of Basic Medicine, Fourth Military Medical University, Xi’an 710033, China
【Abstract】 AIM: To clone fragment of the human ALEX2 gene, to construct the recombinant vector and to induce its expression. METHODS: The fragment of the human ALEX2 gene was amplified by RTPCR from human placenta brain tissue and cloned into PGEMT easy vector. After sequencing, it was subcloned into prokaryotic expression vector PGEX4T3. After induced by IPTG for 4 h, the expression of recombinant Mr417 000 ALEX2 protein was confirmed by SDSPAGE. RESULTS: The fragment of the human ALEX2 gene was cloned. The DNA sequence was identical with that published by GenBank. The recombinant plasmid PGEXALEX2 was constructed. The expressed fusion protein was about 15.5% of total bacterial protein by gel thinlayer chromatography scanning. CONCLUSION: The fragment of the human ALEX2 gene and prokaryotic expression products are obtained. It may be of great significance to the preparation of some monoclonal antibody against human ALEX2 and the study on the function of human ALEX2.
【Keywords】 ALEX2; cloning; prokaryotic expression
【摘要】 目的： 克隆人ALEX2基因部分片段的cDNA，构建重组表达载体并诱导其表达. 方法： 通过RTPCR技术从人胚胎脑组织中特异扩增出ALEX2基因部分编码序列片断(630~1058位核苷酸)，克隆入pGEMT easy载体中，测序后亚克隆于表达载体pGEX4T3中，酶切鉴定正确，转化大肠杆菌DH5α，经IPTG诱导4 h后，可表达Mr417 000的目的蛋白. 结果： 特异扩增出大小约440 bp的片断，经测序与已知序列完全一致，构建了融合蛋白的重组表达质粒PGEXALEX2，表达的融合蛋白产物经凝胶薄层扫描检测，占菌体总蛋白量的15.5%. 结论： 获得了人ALEX2部分基因编码片断及其原核表达产物，为下一步ALEX2 mAb的制备和研究其生物学功能奠定了基础.
【关键词】 ALEX2；克隆；原核表达
0引言
ALEX2 (armadillo repeat protein ALEX2)是2000年Kurochkin等克隆得到的ALEX(Arm protein lost in epithelial cancers on chromosome X)家族成员之一[1]，基因定位于染色体Xq21.33q22.2上，编码632个氨基酸，具有一个armadillo repeat结构[2]. 在正常人组织中除外周血白细胞外均有表达，但在癌组织中表达缺失，提示可能在上皮组织来源的肿瘤的发生发展中起一定的抑制作用. 同时有报道认为ALEX2在细胞间信号传导和细胞极性形成中亦起重要作用[1]. 我们利用RTPCR技术从人胚胎脑组织中特异扩增出ALEX2基因部分编码片断(630~1058位核苷酸)，克隆入载体pGEMT easy 后，再亚克隆入原核融合表达载体PGEX4T3，诱导表达该蛋白，为今后深入研究其生物学功能奠定基础.
1材料和方法
1.1材料限制性内切酶、Taq DNA聚合酶、T4 DNA连接酶及IPTG为Promega公司产品, 质粒提取试剂盒购自北京赛百盛公司，大肠杆菌DH5α为本实验室保存，克隆载体pGEMT easy vector为Promega公司产品；表达载体pGEX4T3为Pharmacia公司产品，dNTP及胶回收试剂盒为Clontech公司产品，Trizol试剂为Gibco公司产品；DNA marker购自Fermentas公司；蛋白marker购自珠海百奥生物技术公司.
1.2方法根据ALEX2 cDNA GenBank (ACCESSION No. NM_177949)已知序列在开放读框内设计引物，5′引物：AGGGATCCGTGGCATCGCCTACCG，酶切位点：BamHI 3′引物：AGCTCGAGGTCTGAATCTGACTCTGTGTCAGT，酶切位点：XhoI，由上海生工公司合成. 人胚胎脑组织来自5 mo龄儿，分小块置液氮中冻存,按照Trizol试剂盒方法从中提取总RNA，再逆转录成cDNA[3]. 用上述引物进行PCR扩增，PCR反应体系为：10×buffer 5 μL, 10 mmol/L dNTP 2 μL, DNA模板5 μL, 引物各1 μL(25 μmol/L)及Taq酶1 U，加水至50 μL. 循环参数为95℃ 5 min后，95℃ 30 s;55℃ 30 s;72℃ 30 s;共30循环，72℃延伸5 min. 用扩增产物经20 g/L琼脂糖凝胶电泳，回收DNA条带，经Clontech胶回收试剂盒回收纯化. 取纯化的PCR产物与克隆载体pGEMT easy vector连接转化,经含氨苄青霉素平板筛选，挑取阳性菌落，增菌，提取质粒，用BamHI， XhoI进行双酶切鉴定. 将经双酶切鉴定后的质粒送上海生工公司测序，所得测序结果与已知片段结果一致. 将所得正确的重组质粒命名为pGEMALEX2. 用BamHI， XhoI进行双酶切，所得片段重组到经同样双酶切的表达载体pGEX4T3中，将所得到的重组表达质粒转化感受态的大肠杆菌DH5α，随机挑选5个菌落，分别接种于5 mL含100 mg/L氨苄青霉素的LB培养液，37℃振荡培养过夜，利用赛百盛公司的质粒提取试剂盒提取质粒DNA，用BamHI， XhoI进行双酶切鉴定. 将所得正确的重组质粒命名为pGEXALEX2，挑取经重组的表达质粒转化的DH5α菌接种于含氨苄青霉素(100 mg/L)的LB培养基液中，37℃振荡培养过夜后，按1∶100转种于新鲜LB培养基中，37℃培养至A600 nm约为0.6，加入IPTG至浓度为1.0 mmol/L，诱导4 h后，离心收菌：4℃ 9000 g离心5 min收集菌体，以2×凝胶加样缓冲液50 μL悬浮，煮沸10 min，12 000 g离心10 min后，进行120 g/L SDSPAGE鉴定. 用薄层扫描仪在580 nm波长下对SDSPAGE蛋白电泳凝胶上的蛋白条带进行扫描，确定菌体总蛋白中目的蛋白的比例.
2结果
2.1PCR扩增以人胚胎脑组织cDNA为模板，以相应引物进行PCR， 取10 μL PCR产物行20 g/L琼脂糖凝胶电泳，可见一个明显的大小约440 bp的扩增片断(Fig 1)，与预期产物大小一致.
2.2ALEX2克隆载体的构建与测序回收此片断，纯化后的PCR产物与pGEMT easy vector载体，经BamHI， XhoI双酶切后，用T4 DNA连接酶连接，连接产物转化DH5α，用含氨苄青霉素的LB培养基37℃过夜培养，可观察到有若干菌落生长. 挑取菌落，用含氨苄青霉素的LB培养液37℃过夜培养，收集菌液，用质粒提取试剂盒提取重组质粒，然后用BamHI， XhoI双酶切重组质粒，取10 μL进行20 g/L琼脂糖凝胶电泳，证明PCR回收产物已成功克隆入pGEMT easy vector的BamHI/XhoI位点(Fig 2A). 为了验证克隆片断是否与文献报道的序列一致，我们将克隆成功的质粒送到上海生工公司进行测序，测序结果与报道的ALEX2的cDNA序列一致，于序列两端可见引入的BamHI， XhoI位点.
2.3表达载体的构建及ALEX2的表达以限制性内切酶切下重组质粒pGEMALEX2中的ALEX2 cDNA片断，插入经同样双酶切的载体pGEX4T3中，转化大肠杆菌DH5α，经氨苄青霉素平板筛选，提质粒酶切鉴定，证明表达载体构建成功(Fig 2B)，阳性克隆命名为pGEXALEX2. 重组质粒诱导表达，收菌，经还原处理后做SDSPAGE，考马斯亮蓝染色，与空白对照菌株比较，含pGEXALEX2的菌株在Mr 417 000处出现一条明显新生蛋白带，同预期大小相吻合(Fig 3). 经薄层扫描分析，测得重组菌表达带的蛋白量约占菌体总蛋白量的15.5%.
3讨论
1998年Nagase等[2]由人脑组织cDNA文库中筛选出一个编码632个氨基酸的cDNA片断，编号为KIAA0512. 2001年Kurochkin等[1]在寻找ALEX1基因同族基因时发现KIAA0512与ALEX1C末端具72%的相似性，且具有一个armadillo repeat 结构，因此将其命名为ALEX2. Armadillo(arm) repeat结构蛋白家族在肿瘤的发生、胚胎的形成及维持组织完整性中发挥着重要作用[4]. 其共同结构是具有由45个氨基酸组成的重复序列(arm repeat)[5]. ALEX2同ALEX家族另外两个成员ALEX1，ALEX3共同定位于染色体Xq21.33q22.2上，仅含有一个外显子，mRNA全长2863 bp，开放读框长1899 bp，编码632个氨基酸[1]. 应用TMHMM Server V.2.0软件对ALEX2氨基酸跨膜区进行分析，表明其 N末端(第1~25位氨基酸)有一疏水的跨膜区. 亚细胞定位预测ALEX2蛋白位于线粒体外的其他亚细胞结构中[6]，结合其同族的ALEX1基因定位，考虑ALEX2基因可能定位于胞膜，在细胞间通讯中发挥重要作用. Scan Prosite软件分析ALEX2氨基酸序列中，富含cAMP, cGMP依赖的蛋白磷酸激酶及酪氨酸蛋白激酶Ⅱ(CK2)等9种39个蛋白结构域结合位点[7]. Northern杂交显示ALEX2在正常人组织中除外周血白细胞外均有表达，尤其在脑、心、骨骼肌中表达量最高. 而在肺癌、前列腺癌、结肠癌等上皮组织癌中表达缺失，提示ALEX2可能在上皮组织肿瘤的发生发展中起一定的抑制作用[1].
本研究通过RTPCR技术从人胚胎脑组织中特异扩增出ALEX2基因部分编码序列片断(630~1058位核苷酸). 该部分片断编码的氨基酸序列经与ALEX家族其他成员相比较同源性低[1]，因此，可在下一步mAb的制备中，降低在ALEX家族其他成员中的交叉免疫反应，减少非特异反应. 所得序列经测序后与已知序列完全一致. 同时成功构建了PGEXALEX2融合表达载体，并实现了其蛋白的表达. 实验中，我们采用phamacia公司商品化的谷胱甘肽转移酶(GST)融合表达载体PGEX4T3，它是一种较为高效的蛋白表达载体，具有很多突出的优点，为所获得的融合蛋白的进一步分离纯化和活性鉴定提供了方便[8,9]. 实验表明，外源的人ALEX2基因在原核表达载体中能够表达GST融合蛋白，SDSPAGE显示，在装有外源基因表达载体的大肠杆菌中，与融合蛋白相应的蛋白分子量处有特异的蛋白质条带(Mr417 000处)，而GST蛋白处的蛋白质条带消失；相反，在仅含有空载体的大肠杆菌中，在Mr26 000处有GST蛋白的表达，这证明人ALEX2蛋白表达成功，为下一步mAb的制备和研究ALEX2的生物学功能奠定了基础.
【参考文献】
[1] Kurochkin IV, Yonemitsu N, Funahashi SI, et al. ALEX1, a novel human armadillo repeat protein that is expressed differentially in normal tissues and carcinomas[J]. Biochem Biophys Res Commun， 2001;280(1):340-347.
[2] Nagase T, Ishikawa K, Miyajima N, et al. Prediction of the coding sequences of unidentified human genes. IX. The complete sequences of 100 new cDNA clones from brain which can code for large proteins in vitro[J]. DNA Res， 1998; 5(1):31-39.
[3] 王立峰，张健，李莹，等. PKB/AKT调节结构域的克隆、表达及初步纯化[J]. 第四军医大学学报, 2003;24(6):481-484.
Wang LF, Zhang J, Li Y, et al. Cloning, expression and purification of human RD (regulation domain of PKB/Akt) gene in E.coli[J]. J Fourth Mil Med Univ, 2003;24(6):481-484.
[4] Hatzfeld M. The armadillo family of structural proteins [J]. Int Rev Cytol, 1999;186:179-224.
[5] Peifer M, Berg S, Reynolds AB. A repeating amino acid motif shared by proteins with diverse cellular roles[J]. Cell, 1994; 76(5):789-791.
[6] Emanuelsson O, Nielsen H, Brunak S, et al. Predicting subcellular localization of proteins based on their Nterminal amino acid sequence[J]. J Mol Biol, 2000;300(4):1005-1016.
[7] Sigrist CJ, Cerutti L, Hulo N, et al. PROSITE: A documented database using patterns and profiles as motif descriptors[J]. Brief Bioinform, 2002; 3(3):265-274.
[8] 刘勇，徐志凯，闫岩，等. 汉滩病毒S基因5′端311 bp编码蛋白的原核表达、纯化及其抗原性分析[J]. 第四军医大学学报, 2002;23(5):419-422.
Liu Y, Xu ZK, Yan Y, et al. Prokaryotic expression, purification and antigenic analysis of hantaan virus S gene 5′ terminal 311 bp fragment [J]. J Fourth Mil Med Univ, 2002;23(5):419-422.
[9] 张俊杰，吴元明，纪宗玲，等. 人Era和人EraC端蛋白在大肠杆菌中的高表达[J]. 第四军医大学学报, 2001; 22(8):759-762.
Zhang JJ, Wu YM, Ji ZL, et al. High expression of human Era and human Era Cterminal domain in E.coli[J]. J Fourth Mil Med Univ, 2001; 22(8):759-762.
作者简介：张勇(1978)，男(汉族)，内蒙古自治区呼和浩特市人. 硕士，住院医师. Tel.(029)83374544Email.pp8001@fmmu.edu.cn
(第四军医大学基础部病理学教研室，陕西 西安 710033)
编辑王雪萍, 百拇医药(张勇，师建国，闫庆国，王丽，郭爱林)
ZHANG Yong, SHI JianGuo, YAN QingGuo, WANG Li, GUO AiLin
Department of Pathology, School of Basic Medicine, Fourth Military Medical University, Xi’an 710033, China
【Abstract】 AIM: To clone fragment of the human ALEX2 gene, to construct the recombinant vector and to induce its expression. METHODS: The fragment of the human ALEX2 gene was amplified by RTPCR from human placenta brain tissue and cloned into PGEMT easy vector. After sequencing, it was subcloned into prokaryotic expression vector PGEX4T3. After induced by IPTG for 4 h, the expression of recombinant Mr417 000 ALEX2 protein was confirmed by SDSPAGE. RESULTS: The fragment of the human ALEX2 gene was cloned. The DNA sequence was identical with that published by GenBank. The recombinant plasmid PGEXALEX2 was constructed. The expressed fusion protein was about 15.5% of total bacterial protein by gel thinlayer chromatography scanning. CONCLUSION: The fragment of the human ALEX2 gene and prokaryotic expression products are obtained. It may be of great significance to the preparation of some monoclonal antibody against human ALEX2 and the study on the function of human ALEX2.
【Keywords】 ALEX2; cloning; prokaryotic expression
【摘要】 目的： 克隆人ALEX2基因部分片段的cDNA，构建重组表达载体并诱导其表达. 方法： 通过RTPCR技术从人胚胎脑组织中特异扩增出ALEX2基因部分编码序列片断(630~1058位核苷酸)，克隆入pGEMT easy载体中，测序后亚克隆于表达载体pGEX4T3中，酶切鉴定正确，转化大肠杆菌DH5α，经IPTG诱导4 h后，可表达Mr417 000的目的蛋白. 结果： 特异扩增出大小约440 bp的片断，经测序与已知序列完全一致，构建了融合蛋白的重组表达质粒PGEXALEX2，表达的融合蛋白产物经凝胶薄层扫描检测，占菌体总蛋白量的15.5%. 结论： 获得了人ALEX2部分基因编码片断及其原核表达产物，为下一步ALEX2 mAb的制备和研究其生物学功能奠定了基础.
【关键词】 ALEX2；克隆；原核表达
0引言
ALEX2 (armadillo repeat protein ALEX2)是2000年Kurochkin等克隆得到的ALEX(Arm protein lost in epithelial cancers on chromosome X)家族成员之一[1]，基因定位于染色体Xq21.33q22.2上，编码632个氨基酸，具有一个armadillo repeat结构[2]. 在正常人组织中除外周血白细胞外均有表达，但在癌组织中表达缺失，提示可能在上皮组织来源的肿瘤的发生发展中起一定的抑制作用. 同时有报道认为ALEX2在细胞间信号传导和细胞极性形成中亦起重要作用[1]. 我们利用RTPCR技术从人胚胎脑组织中特异扩增出ALEX2基因部分编码片断(630~1058位核苷酸)，克隆入载体pGEMT easy 后，再亚克隆入原核融合表达载体PGEX4T3，诱导表达该蛋白，为今后深入研究其生物学功能奠定基础.
1材料和方法
1.1材料限制性内切酶、Taq DNA聚合酶、T4 DNA连接酶及IPTG为Promega公司产品, 质粒提取试剂盒购自北京赛百盛公司，大肠杆菌DH5α为本实验室保存，克隆载体pGEMT easy vector为Promega公司产品；表达载体pGEX4T3为Pharmacia公司产品，dNTP及胶回收试剂盒为Clontech公司产品，Trizol试剂为Gibco公司产品；DNA marker购自Fermentas公司；蛋白marker购自珠海百奥生物技术公司.
1.2方法根据ALEX2 cDNA GenBank (ACCESSION No. NM_177949)已知序列在开放读框内设计引物，5′引物：AGGGATCCGTGGCATCGCCTACCG，酶切位点：BamHI 3′引物：AGCTCGAGGTCTGAATCTGACTCTGTGTCAGT，酶切位点：XhoI，由上海生工公司合成. 人胚胎脑组织来自5 mo龄儿，分小块置液氮中冻存,按照Trizol试剂盒方法从中提取总RNA，再逆转录成cDNA[3]. 用上述引物进行PCR扩增，PCR反应体系为：10×buffer 5 μL, 10 mmol/L dNTP 2 μL, DNA模板5 μL, 引物各1 μL(25 μmol/L)及Taq酶1 U，加水至50 μL. 循环参数为95℃ 5 min后，95℃ 30 s;55℃ 30 s;72℃ 30 s;共30循环，72℃延伸5 min. 用扩增产物经20 g/L琼脂糖凝胶电泳，回收DNA条带，经Clontech胶回收试剂盒回收纯化. 取纯化的PCR产物与克隆载体pGEMT easy vector连接转化,经含氨苄青霉素平板筛选，挑取阳性菌落，增菌，提取质粒，用BamHI， XhoI进行双酶切鉴定. 将经双酶切鉴定后的质粒送上海生工公司测序，所得测序结果与已知片段结果一致. 将所得正确的重组质粒命名为pGEMALEX2. 用BamHI， XhoI进行双酶切，所得片段重组到经同样双酶切的表达载体pGEX4T3中，将所得到的重组表达质粒转化感受态的大肠杆菌DH5α，随机挑选5个菌落，分别接种于5 mL含100 mg/L氨苄青霉素的LB培养液，37℃振荡培养过夜，利用赛百盛公司的质粒提取试剂盒提取质粒DNA，用BamHI， XhoI进行双酶切鉴定. 将所得正确的重组质粒命名为pGEXALEX2，挑取经重组的表达质粒转化的DH5α菌接种于含氨苄青霉素(100 mg/L)的LB培养基液中，37℃振荡培养过夜后，按1∶100转种于新鲜LB培养基中，37℃培养至A600 nm约为0.6，加入IPTG至浓度为1.0 mmol/L，诱导4 h后，离心收菌：4℃ 9000 g离心5 min收集菌体，以2×凝胶加样缓冲液50 μL悬浮，煮沸10 min，12 000 g离心10 min后，进行120 g/L SDSPAGE鉴定. 用薄层扫描仪在580 nm波长下对SDSPAGE蛋白电泳凝胶上的蛋白条带进行扫描，确定菌体总蛋白中目的蛋白的比例.
2结果
2.1PCR扩增以人胚胎脑组织cDNA为模板，以相应引物进行PCR， 取10 μL PCR产物行20 g/L琼脂糖凝胶电泳，可见一个明显的大小约440 bp的扩增片断(Fig 1)，与预期产物大小一致.
2.2ALEX2克隆载体的构建与测序回收此片断，纯化后的PCR产物与pGEMT easy vector载体，经BamHI， XhoI双酶切后，用T4 DNA连接酶连接，连接产物转化DH5α，用含氨苄青霉素的LB培养基37℃过夜培养，可观察到有若干菌落生长. 挑取菌落，用含氨苄青霉素的LB培养液37℃过夜培养，收集菌液，用质粒提取试剂盒提取重组质粒，然后用BamHI， XhoI双酶切重组质粒，取10 μL进行20 g/L琼脂糖凝胶电泳，证明PCR回收产物已成功克隆入pGEMT easy vector的BamHI/XhoI位点(Fig 2A). 为了验证克隆片断是否与文献报道的序列一致，我们将克隆成功的质粒送到上海生工公司进行测序，测序结果与报道的ALEX2的cDNA序列一致，于序列两端可见引入的BamHI， XhoI位点.
2.3表达载体的构建及ALEX2的表达以限制性内切酶切下重组质粒pGEMALEX2中的ALEX2 cDNA片断，插入经同样双酶切的载体pGEX4T3中，转化大肠杆菌DH5α，经氨苄青霉素平板筛选，提质粒酶切鉴定，证明表达载体构建成功(Fig 2B)，阳性克隆命名为pGEXALEX2. 重组质粒诱导表达，收菌，经还原处理后做SDSPAGE，考马斯亮蓝染色，与空白对照菌株比较，含pGEXALEX2的菌株在Mr 417 000处出现一条明显新生蛋白带，同预期大小相吻合(Fig 3). 经薄层扫描分析，测得重组菌表达带的蛋白量约占菌体总蛋白量的15.5%.
3讨论
1998年Nagase等[2]由人脑组织cDNA文库中筛选出一个编码632个氨基酸的cDNA片断，编号为KIAA0512. 2001年Kurochkin等[1]在寻找ALEX1基因同族基因时发现KIAA0512与ALEX1C末端具72%的相似性，且具有一个armadillo repeat 结构，因此将其命名为ALEX2. Armadillo(arm) repeat结构蛋白家族在肿瘤的发生、胚胎的形成及维持组织完整性中发挥着重要作用[4]. 其共同结构是具有由45个氨基酸组成的重复序列(arm repeat)[5]. ALEX2同ALEX家族另外两个成员ALEX1，ALEX3共同定位于染色体Xq21.33q22.2上，仅含有一个外显子，mRNA全长2863 bp，开放读框长1899 bp，编码632个氨基酸[1]. 应用TMHMM Server V.2.0软件对ALEX2氨基酸跨膜区进行分析，表明其 N末端(第1~25位氨基酸)有一疏水的跨膜区. 亚细胞定位预测ALEX2蛋白位于线粒体外的其他亚细胞结构中[6]，结合其同族的ALEX1基因定位，考虑ALEX2基因可能定位于胞膜，在细胞间通讯中发挥重要作用. Scan Prosite软件分析ALEX2氨基酸序列中，富含cAMP, cGMP依赖的蛋白磷酸激酶及酪氨酸蛋白激酶Ⅱ(CK2)等9种39个蛋白结构域结合位点[7]. Northern杂交显示ALEX2在正常人组织中除外周血白细胞外均有表达，尤其在脑、心、骨骼肌中表达量最高. 而在肺癌、前列腺癌、结肠癌等上皮组织癌中表达缺失，提示ALEX2可能在上皮组织肿瘤的发生发展中起一定的抑制作用[1].
本研究通过RTPCR技术从人胚胎脑组织中特异扩增出ALEX2基因部分编码序列片断(630~1058位核苷酸). 该部分片断编码的氨基酸序列经与ALEX家族其他成员相比较同源性低[1]，因此，可在下一步mAb的制备中，降低在ALEX家族其他成员中的交叉免疫反应，减少非特异反应. 所得序列经测序后与已知序列完全一致. 同时成功构建了PGEXALEX2融合表达载体，并实现了其蛋白的表达. 实验中，我们采用phamacia公司商品化的谷胱甘肽转移酶(GST)融合表达载体PGEX4T3，它是一种较为高效的蛋白表达载体，具有很多突出的优点，为所获得的融合蛋白的进一步分离纯化和活性鉴定提供了方便[8,9]. 实验表明，外源的人ALEX2基因在原核表达载体中能够表达GST融合蛋白，SDSPAGE显示，在装有外源基因表达载体的大肠杆菌中，与融合蛋白相应的蛋白分子量处有特异的蛋白质条带(Mr417 000处)，而GST蛋白处的蛋白质条带消失；相反，在仅含有空载体的大肠杆菌中，在Mr26 000处有GST蛋白的表达，这证明人ALEX2蛋白表达成功，为下一步mAb的制备和研究ALEX2的生物学功能奠定了基础.
【参考文献】
[1] Kurochkin IV, Yonemitsu N, Funahashi SI, et al. ALEX1, a novel human armadillo repeat protein that is expressed differentially in normal tissues and carcinomas[J]. Biochem Biophys Res Commun， 2001;280(1):340-347.
[2] Nagase T, Ishikawa K, Miyajima N, et al. Prediction of the coding sequences of unidentified human genes. IX. The complete sequences of 100 new cDNA clones from brain which can code for large proteins in vitro[J]. DNA Res， 1998; 5(1):31-39.
[3] 王立峰，张健，李莹，等. PKB/AKT调节结构域的克隆、表达及初步纯化[J]. 第四军医大学学报, 2003;24(6):481-484.
Wang LF, Zhang J, Li Y, et al. Cloning, expression and purification of human RD (regulation domain of PKB/Akt) gene in E.coli[J]. J Fourth Mil Med Univ, 2003;24(6):481-484.
[4] Hatzfeld M. The armadillo family of structural proteins [J]. Int Rev Cytol, 1999;186:179-224.
[5] Peifer M, Berg S, Reynolds AB. A repeating amino acid motif shared by proteins with diverse cellular roles[J]. Cell, 1994; 76(5):789-791.
[6] Emanuelsson O, Nielsen H, Brunak S, et al. Predicting subcellular localization of proteins based on their Nterminal amino acid sequence[J]. J Mol Biol, 2000;300(4):1005-1016.
[7] Sigrist CJ, Cerutti L, Hulo N, et al. PROSITE: A documented database using patterns and profiles as motif descriptors[J]. Brief Bioinform, 2002; 3(3):265-274.
[8] 刘勇，徐志凯，闫岩，等. 汉滩病毒S基因5′端311 bp编码蛋白的原核表达、纯化及其抗原性分析[J]. 第四军医大学学报, 2002;23(5):419-422.
Liu Y, Xu ZK, Yan Y, et al. Prokaryotic expression, purification and antigenic analysis of hantaan virus S gene 5′ terminal 311 bp fragment [J]. J Fourth Mil Med Univ, 2002;23(5):419-422.
[9] 张俊杰，吴元明，纪宗玲，等. 人Era和人EraC端蛋白在大肠杆菌中的高表达[J]. 第四军医大学学报, 2001; 22(8):759-762.
Zhang JJ, Wu YM, Ji ZL, et al. High expression of human Era and human Era Cterminal domain in E.coli[J]. J Fourth Mil Med Univ, 2001; 22(8):759-762.
作者简介：张勇(1978)，男(汉族)，内蒙古自治区呼和浩特市人. 硕士，住院医师. Tel.(029)83374544Email.pp8001@fmmu.edu.cn
(第四军医大学基础部病理学教研室，陕西 西安 710033)
编辑王雪萍, 百拇医药(张勇，师建国，闫庆国，王丽，郭爱林)