荧光偏振方法快速检测HPV16 E7第29位密码子点突变
Rapid detection of HPV16 E7 point mutation at codon 29 with fluorescence polarization
CHEN ZhongCan， ZHANG Ju， GAO YanE， XIA Lin， BAI YuJie， YAN XiaoJun
1Institute of Genetic Diagnosis， Fourth Military Medical University， Xi’ an 710033， China， 2Department of Obstetrics and Gynecology， Second Hospital， Xi’an Jiaotong University， Xi’an 710004， China
【Abstract】 AIM: To investigate the relationship between the mutation and the cervical carcinoma by detecting the nucleotide missense mutation A→G at codon 29 in E7 gene of HPV16 in the cervical carcinoma tissues and to establish a new method for detecting HPV point mutation. METHODS: Totally 53 cases were examined. HPV16 E7 was first amplified by Polymerase Chain Reaction and then TDIFP was adopted to detect the types of the labeled ddNTP, by which the genotype was determined. The results were analyzed by statistics. RESULTS: The mutation rate was 43.48% (10 of 23) in invasive cervical cancer and point mutations were found in cervical tissues from 13 of the 33 case patients (39.39%), and from 2 of the 20 control subjects (10.00%). The point mutation was found statistically significantly more often in case patients than in control subjects (P<0.05). The coherence with sequencing result was 100%. CONCLUSION: The rate of point mutation of HPV16 E7 gene in this study displays a significant geographic difference from other areas. HPV16 with the point mutation appears to be more oncogenic and may contribute to the high incidence of cervical cancer. These observations suggest that TDIFP assay of HPV point mutation is an easy, fast and high throughput method for gene mutation detection.
【Keywords】 human papillomavirus；mutation；cervical carcinoma；fluorescence polarization
【摘要】 目的: 通过TDIFP方法检测宫颈病变组织中HPV16 E7基因第29位密码子突变(A→G)并探讨其与宫颈癌的相关性，同时建立一种HPV点突变检测的新方法. 方法: 以53例HPV16阳性宫颈组织为研究对象.首先PCR扩增含待检测位点的靶基因片段，然后用TDIFP方法检测荧光素碱基的掺入情况，判断所研究位点的基因型. 结果: 宫颈浸润癌组织中HPV16 E7第29位密码子的突变率为43.48%(10/23)，对照组为10.00%(2/20)，病例组为39.39%(13/33)，组间突变率差异有显著性(P<0.05).该法与随机抽查标本测序结果一致率为100%. 结论: 本研究中HPV16病毒发生E7第29位密码子突变的情况与其他地区相比存在差异；HPV点突变TDIFP检测方法是一种快速简便、高通量的基因突变检测技术.
【关键词】 人乳头瘤病毒；突变；宫颈癌；荧光偏振
0引言
人乳头瘤病毒(human papillomavirus，HPV)属于DNA病毒，其中HPV16, 18被认为是宫颈癌的高危因子.特别是HPV16型，在宫颈癌组织中的检出率超过50%，在宫颈癌的发生中起着重要作用. HPV16 E7蛋白是肿瘤细胞转化的主要癌蛋白，通过结合并失活肿瘤抑制蛋白Rb而发挥转化作用. HPV DNA有许多天然存在的变异，自然状态下发生的HPV16 E7变异的生物学特性有较大差异，其中E7基因第29位密码子(HPV16第647位核苷酸)A→G错义突变是一重要的基因变异，对宫颈癌的诊断、预后判断可能具有重要意义[1]，我国内地人群中此突变与宫颈病变的关系还未见报道.目前大多数基因点突研究方法不同程度地存在方法复杂、通量低及成本高等不足.本研究利用快速、高通量、敏感的基因突变检测新方法初步分析了宫颈病变中该突变的发生情况，该方法的建立为深入研究HPV DNA的突变与宫颈癌的关系奠定了方法学基础.
1材料和方法
1.1材料
选取本实验室用HPV荧光偏振分型方法[2]确定的53例HPV16阳性宫颈组织标本为研究对象，由第四军医大学西京医院和西安交通大学第二医院提供，均经病理确诊.分为对照组20例(良性病变7例和低度鳞状上皮内病变13例)与病例组33例 (高度鳞状上皮内病变10例和浸润癌23例).Taq DNA聚合酶购自Promega公司；T4 DNA连接酶购自TaKaRa公司；pGEM(r)T Easy载体购自Invitrogen公司；大肠杆菌DH5α由本实验室保存；异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)、XGal购自华美公司；PCR扩增仪购自美国Elmerkin公司；384微孔板(MJ Research)；荧光偏振检测所用试剂盒(含PCR产物消化液与R110、TAMRA荧光标记的终止子、聚合酶)和荧光偏振检测仪Victor2购自美国PerkinElmer公司.根据GenBank中HPV16参考序列设计突变所在区域的上下游扩增引物和TDI引物,扩增片段长168 bp. P1：5′TTAGATTTGCAACCAGAGACA3′；P2：5′ACTCTACGCTTCGGTTGTGC3′；TDI引物 5′TGACAGCTCAGAGGAGGAG3′，由北京赛百胜公司合成.
1.2方法
1.2.1TDIFP检测点突变①PCR扩增HPV16 E7基因扩增反应总体积25 μL，上下游引物0.25 μmol/L,10×PCR缓冲液2.5 μL, MgCl2 2 mmol/L,dNTPs分别为150 μmol/L,Taq DNA聚合酶1.0 U，5～10 ng基因组DNA作模板.条件: 95℃预变性3 min,然后94℃ 40 s，53℃ 30 s，72℃ 40 s，25个循环后72℃延伸5 min.取5 μL PCR扩增产物用浓度15 g/L琼脂糖凝胶进行电泳，溴化乙锭染色.由含未突变与突变的E7重组质粒作对照.②扩增产物的纯化5 μL PCR产物中加入2 μL 10×消化酶(核酸外切酶Ⅰ和虾碱性磷酸酶)，37℃温育1 h消除游离的引物和剩余dNTPs，80℃加热20 min灭活消化酶.③TDI掺入反应向消化后的PCR产物中加入13 μL由0.05 μL AcycloPol聚合酶、2 μL 10×reaction buffer、0.5 μL 10 μmol/L TDI引物、1 μL R110acyCTP/TAMRAacyTTP终止子及9.45 μL去离子水组成的混合物.95℃预变性2 min后, 94℃ 15 s,54℃ 30 s，共30个循环，最后15℃延伸10 min. ④荧光偏振检测将反应产物加入384微孔板中用wallac1420 Victor2仪器检测样品的荧光偏振值(FP)，测得的原始数据调入EXCEL 由专用相关软件分析突变基因型.
1.2.2统计学分析及测序验证采用χ2检验比较对照和病例组基因突变率的差别，P<0.05表示差异显著，由SPSS 10.0统计分析软件包处理.随机选择突变与未突变标本各5例，将其PCR产物经琼脂糖凝胶电泳后，将回收目的片段与克隆载体pGEMT Easy连接，构建HPV16 E7pGEMT重组质粒，转化CaCl2法制备的大肠杆菌DH5α感受态细胞.在含有IPTG, Xgal的氨苄青霉素阳性LB平皿中蓝白筛选，随机挑取3个白色单菌落扩增培养，按Wizard Plus Minipreps DNA 纯化试剂盒说明提取重组质粒，并进行PCR鉴定.选含有168 bp外源DNA片段阳性克隆，送上海Sangon生物工程公司测序，对测序结果用BLAST进行同源性分析.
2结果
2.1HPV16 E7 PCR扩增结果标本PCR产物电泳后可见168 bp的预期片段(Fig 1).
2.2HPV 16 E7第29位密码子点突变检测结果与验证根据TDIFP原理，R110acyCTP和TAMRAacyTTP掺入时其各代表的FP将增高.经检测有15例标本结果位于散点图右下象限，表示R110acyCTP掺入，即A→G突变；38例标本结果位于左上象限表示有TAMRAacyTTP掺入，无突变；重组质粒对照分别在左上和右下象限；空白对照结果位于左下象限，表示无终止子掺入(Fig 2). 病例组与对照组间突变率统计学差异显著(Tab 1).其中各级别病变组织的突变率分别为浸润癌43.48%(10/23)，高度鳞状上皮内病变30.0%(3/10)，低度鳞状上皮内病变15.38%(2/13)及良性病变(0/7). 表1HPV16 E7基因第29位密码子点突变的分布(略)
随机挑选的10例标本的TDIFP检测结果与测序结果相比较，5例发生突变，5例未突变，结果全部一致.
3讨论
全世界大约每年有50万新发宫颈癌病例，其中80%发生在发展中国家.我国是HPV感染比较严重的地区之一，每年新发病例约15万，占世界的1/3.我国人群宫颈癌感染也以HPV16为主，其各早晚期基因均存在不同形式的突变[3,4].其中HPV16 E7蛋白N端区包括pRb结合位点和CKⅡ磷酸化位点，具有强抗原性，16～37位氨基酸含两个独立的结构域，其中21～29位氨基酸介导pRb抑癌蛋白的结合，是与pRb结合的最关键位点.E7和Rb蛋白之间的相互作用是恶性转化的最重要机制.HPV16 E7基因第29位密码子突变导致氨基酸由天门冬酰胺变为丝氨酸(Asn→Ser)，丝氨酸被磷酸化，蛋白质构象和极性可能发生改变，从而改变生物学功能如结合pRb的能力，影响HPV的转化作用和免疫原性等生物学特性[5].
目前对HPV16 E7基因的第29位密码子突变与宫颈癌相关性无统一的结论.韩国的一项研究中[1]发现70%的宫颈浸润癌中存在该突变，与对照组相比有差异，提示E7癌蛋白的这种变异改变了其生物学活性.Stephen等[6]对四川地区的宫颈癌组织仅得到其突变率而未做进一步的对照分析.我国内地HPV16此点突变与宫颈癌的关系尚无系统研究.我们利用TDIFP新技术对宫颈病变中HPV16 E7第29位密码子点突变进行了检测，结果本研究样本浸润癌的突变率为43.48%，不同与其他地区；突变率随病变程度的升高而增加，提示该突变可能是HPV致癌的一个高危因素.另外如果E7蛋白的氨基酸改变位于免疫识别的关键区，针对一种变异病毒型的疫苗可能对其他的变异型的效果会降低.因此还需要结合前瞻性队列研究的大规模人群检测来探讨自然发生的E7基因变异的生物学和临床意义.
建立在扩增基础上的基因点突变检测方法有传统的PCRRFLP、等位基因特异性寡核苷酸分析法(ASO)、寡核苷酸链接检测法(OLA)及新发展的反向限制性位点突变分析(iRSM)、等位基因特异性扩增技术(ASPCR)及基因芯片等检测方法，最直接的方法是基因测序[2].这些方法不同程度地存在通量低、成本高、技术操作复杂及污染等不足，不易推广和大规模应用.本研究建立了HPV16 E7基因点突变TDIFP [7]检测方法，该方法是一种通量高、实用性强的基因分析技术，首先PCR扩增含有待检测位点的HPV基因区域，然后对PCR产物进行纯化，再用突变位点上游互补的TDI引物和模板反应，TDI引物的3′末端掺入与待检测碱基互补的荧光标记终止子：双脱氧R110acyCTP或TAMRAacyTTP.荧光标记的双脱氧核苷酸掺入引物后其分子旋转速度将减小，相应波长偏振光激发后所得偏振值(单位为mP)将明显增高，由此可知加入碱基的种类，并依据碱基互补原则判断突变位点的核苷酸种类.
TDIFP的优点是：①不需要任何标记的引物，试剂和设备价格低；②单碱基掺入反应(TDI)条件容易优化；③用荧光偏振做为检测方式，FP值大小与荧光强度无关；④偏振值检测直接在溶液中进行，不需要分离未结合的标记ddNTPs；⑤TDIFP方法能够满足从小规模的实验研究到全自动高通量的大规模临床检测需要[8].本方法已经广泛应用于包括单核苷酸多态性(SNPs)[9]和单倍型在内的基因变异研究，从标本中随机选择10例标本用测序的方法进行对比，符合率为100%，与TDIFP技术在其他基因变异研究中结果相一致[10].该方法同样可应用于其他HPV位点的突变检测，有望为今后大规模研究HPV基因变异和HPV相关肿瘤诊断试剂的开发、预防及治疗性疫苗的研制提供十分有用的技术平台.
【参考文献】
[1] Song YS, Kee SH, Kim JW, et al. Major sequence variants in E7 gene of human papillomavirus type 16 from cervical cancerous and noncancerous lesions of Korean women[J]. Gynecol Oncol, 1997; 66:275-281.
[2] 张菊，高艳娥，阎小君，等. 高通量人乳头瘤病毒分型基因诊断方法的研究[J]. 中华检验医学杂志，2003;26(3) :145-147.
Zhang J, Gao YE, Yan XJ, et al. A high throughput assay for human papillomavirus genotypes with fluorescence polarization[J]. Chin J Lab Med, 2003；26(3): 145-147.
[3] Vaeteewoottacharn K, Jearanaikoon P, Ponglikitmongkol M. Comutation of HPV16 E6 and E7 genes in Thai squamous cervical carcinomas[J]. Anticancer Res, 2003;23:1927-1931.
[4] 陈蕤，张菊，阎小君，等. 人乳头瘤病毒16型主要衣壳蛋白L1基因的克隆及序列分析[J]. 第四军医大学学报，2002;23(7)：593-595.
Chen R, Zhang J, Yan XJ, et al. Cloning and sequence analysis of L1 major capsid protein gene of human papillomavirus type 16[J]. J Fourth Mil Med Univ, 2002;23(7):593-595.
[5] Edmonds C, Vousden KH. A point mutational analysis of human papillomavirus type 16 E7 protein[J]. J Virol, 1989; 63: 2650-2656.
[6] Stephen AL, Thompson Ch, Tattersall MH, et al. Analysis of mutations in URR and E6/E7E oncogenes of HPV16 cervical cancer isolates from central China[J]. Int J Cancer, 2000;86:695-701.
[7] Hsu TM, Chen X, Duan S, et al. Universal SNP genotyping assay with fluorescence polarization detection[J]. Biotechniques, 2001; 31:560-570.
[8] Kwok PY, Chen X. Detection of single nucleotide polymorphisms[J]. Curr Issues Mol Biol, 2003;5:43-60.
[9] Freeman BD, Buchman TG, McGrath S, et al. Templatedirected dyeterminator incorporation with fluorescence polarization detection for analysis of single nucleotide polymorphisms implicated in sepsis[J]. J Mol Diagn, 2002; 4:209-215.
[10] Hsu TM, Law SM, Duan S, et al. Genotyping singlenucleotide polymorphisms by the invader assay with dualcolor fluorescence polarization detection[J]. Clin Chem, 2001; 47:1373-1377.
作者简介:陈中灿(1976),男(汉族),河南省开封市人. 硕士生(导师阎小君). Tel.(029)83374771Email.chenzhongcan@163.com
(1第四军医大学基因诊断技术研究所,陕西 西安 710033, 2西安交通大学第二医院妇产科,陕西 西安 710004)
编辑许昌泰, http://www.100md.com(陈中灿，张菊，高艳娥，夏琳，白玉杰，阎小君)
CHEN ZhongCan， ZHANG Ju， GAO YanE， XIA Lin， BAI YuJie， YAN XiaoJun
1Institute of Genetic Diagnosis， Fourth Military Medical University， Xi’ an 710033， China， 2Department of Obstetrics and Gynecology， Second Hospital， Xi’an Jiaotong University， Xi’an 710004， China
【Abstract】 AIM: To investigate the relationship between the mutation and the cervical carcinoma by detecting the nucleotide missense mutation A→G at codon 29 in E7 gene of HPV16 in the cervical carcinoma tissues and to establish a new method for detecting HPV point mutation. METHODS: Totally 53 cases were examined. HPV16 E7 was first amplified by Polymerase Chain Reaction and then TDIFP was adopted to detect the types of the labeled ddNTP, by which the genotype was determined. The results were analyzed by statistics. RESULTS: The mutation rate was 43.48% (10 of 23) in invasive cervical cancer and point mutations were found in cervical tissues from 13 of the 33 case patients (39.39%), and from 2 of the 20 control subjects (10.00%). The point mutation was found statistically significantly more often in case patients than in control subjects (P<0.05). The coherence with sequencing result was 100%. CONCLUSION: The rate of point mutation of HPV16 E7 gene in this study displays a significant geographic difference from other areas. HPV16 with the point mutation appears to be more oncogenic and may contribute to the high incidence of cervical cancer. These observations suggest that TDIFP assay of HPV point mutation is an easy, fast and high throughput method for gene mutation detection.
【Keywords】 human papillomavirus；mutation；cervical carcinoma；fluorescence polarization
【摘要】 目的: 通过TDIFP方法检测宫颈病变组织中HPV16 E7基因第29位密码子突变(A→G)并探讨其与宫颈癌的相关性，同时建立一种HPV点突变检测的新方法. 方法: 以53例HPV16阳性宫颈组织为研究对象.首先PCR扩增含待检测位点的靶基因片段，然后用TDIFP方法检测荧光素碱基的掺入情况，判断所研究位点的基因型. 结果: 宫颈浸润癌组织中HPV16 E7第29位密码子的突变率为43.48%(10/23)，对照组为10.00%(2/20)，病例组为39.39%(13/33)，组间突变率差异有显著性(P<0.05).该法与随机抽查标本测序结果一致率为100%. 结论: 本研究中HPV16病毒发生E7第29位密码子突变的情况与其他地区相比存在差异；HPV点突变TDIFP检测方法是一种快速简便、高通量的基因突变检测技术.
【关键词】 人乳头瘤病毒；突变；宫颈癌；荧光偏振
0引言
人乳头瘤病毒(human papillomavirus，HPV)属于DNA病毒，其中HPV16, 18被认为是宫颈癌的高危因子.特别是HPV16型，在宫颈癌组织中的检出率超过50%，在宫颈癌的发生中起着重要作用. HPV16 E7蛋白是肿瘤细胞转化的主要癌蛋白，通过结合并失活肿瘤抑制蛋白Rb而发挥转化作用. HPV DNA有许多天然存在的变异，自然状态下发生的HPV16 E7变异的生物学特性有较大差异，其中E7基因第29位密码子(HPV16第647位核苷酸)A→G错义突变是一重要的基因变异，对宫颈癌的诊断、预后判断可能具有重要意义[1]，我国内地人群中此突变与宫颈病变的关系还未见报道.目前大多数基因点突研究方法不同程度地存在方法复杂、通量低及成本高等不足.本研究利用快速、高通量、敏感的基因突变检测新方法初步分析了宫颈病变中该突变的发生情况，该方法的建立为深入研究HPV DNA的突变与宫颈癌的关系奠定了方法学基础.
1材料和方法
1.1材料
选取本实验室用HPV荧光偏振分型方法[2]确定的53例HPV16阳性宫颈组织标本为研究对象，由第四军医大学西京医院和西安交通大学第二医院提供，均经病理确诊.分为对照组20例(良性病变7例和低度鳞状上皮内病变13例)与病例组33例 (高度鳞状上皮内病变10例和浸润癌23例).Taq DNA聚合酶购自Promega公司；T4 DNA连接酶购自TaKaRa公司；pGEM(r)T Easy载体购自Invitrogen公司；大肠杆菌DH5α由本实验室保存；异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)、XGal购自华美公司；PCR扩增仪购自美国Elmerkin公司；384微孔板(MJ Research)；荧光偏振检测所用试剂盒(含PCR产物消化液与R110、TAMRA荧光标记的终止子、聚合酶)和荧光偏振检测仪Victor2购自美国PerkinElmer公司.根据GenBank中HPV16参考序列设计突变所在区域的上下游扩增引物和TDI引物,扩增片段长168 bp. P1：5′TTAGATTTGCAACCAGAGACA3′；P2：5′ACTCTACGCTTCGGTTGTGC3′；TDI引物 5′TGACAGCTCAGAGGAGGAG3′，由北京赛百胜公司合成.
1.2方法
1.2.1TDIFP检测点突变①PCR扩增HPV16 E7基因扩增反应总体积25 μL，上下游引物0.25 μmol/L,10×PCR缓冲液2.5 μL, MgCl2 2 mmol/L,dNTPs分别为150 μmol/L,Taq DNA聚合酶1.0 U，5～10 ng基因组DNA作模板.条件: 95℃预变性3 min,然后94℃ 40 s，53℃ 30 s，72℃ 40 s，25个循环后72℃延伸5 min.取5 μL PCR扩增产物用浓度15 g/L琼脂糖凝胶进行电泳，溴化乙锭染色.由含未突变与突变的E7重组质粒作对照.②扩增产物的纯化5 μL PCR产物中加入2 μL 10×消化酶(核酸外切酶Ⅰ和虾碱性磷酸酶)，37℃温育1 h消除游离的引物和剩余dNTPs，80℃加热20 min灭活消化酶.③TDI掺入反应向消化后的PCR产物中加入13 μL由0.05 μL AcycloPol聚合酶、2 μL 10×reaction buffer、0.5 μL 10 μmol/L TDI引物、1 μL R110acyCTP/TAMRAacyTTP终止子及9.45 μL去离子水组成的混合物.95℃预变性2 min后, 94℃ 15 s,54℃ 30 s，共30个循环，最后15℃延伸10 min. ④荧光偏振检测将反应产物加入384微孔板中用wallac1420 Victor2仪器检测样品的荧光偏振值(FP)，测得的原始数据调入EXCEL 由专用相关软件分析突变基因型.
1.2.2统计学分析及测序验证采用χ2检验比较对照和病例组基因突变率的差别，P<0.05表示差异显著，由SPSS 10.0统计分析软件包处理.随机选择突变与未突变标本各5例，将其PCR产物经琼脂糖凝胶电泳后，将回收目的片段与克隆载体pGEMT Easy连接，构建HPV16 E7pGEMT重组质粒，转化CaCl2法制备的大肠杆菌DH5α感受态细胞.在含有IPTG, Xgal的氨苄青霉素阳性LB平皿中蓝白筛选，随机挑取3个白色单菌落扩增培养，按Wizard Plus Minipreps DNA 纯化试剂盒说明提取重组质粒，并进行PCR鉴定.选含有168 bp外源DNA片段阳性克隆，送上海Sangon生物工程公司测序，对测序结果用BLAST进行同源性分析.
2结果
2.1HPV16 E7 PCR扩增结果标本PCR产物电泳后可见168 bp的预期片段(Fig 1).
2.2HPV 16 E7第29位密码子点突变检测结果与验证根据TDIFP原理，R110acyCTP和TAMRAacyTTP掺入时其各代表的FP将增高.经检测有15例标本结果位于散点图右下象限，表示R110acyCTP掺入，即A→G突变；38例标本结果位于左上象限表示有TAMRAacyTTP掺入，无突变；重组质粒对照分别在左上和右下象限；空白对照结果位于左下象限，表示无终止子掺入(Fig 2). 病例组与对照组间突变率统计学差异显著(Tab 1).其中各级别病变组织的突变率分别为浸润癌43.48%(10/23)，高度鳞状上皮内病变30.0%(3/10)，低度鳞状上皮内病变15.38%(2/13)及良性病变(0/7). 表1HPV16 E7基因第29位密码子点突变的分布(略)
随机挑选的10例标本的TDIFP检测结果与测序结果相比较，5例发生突变，5例未突变，结果全部一致.
3讨论
全世界大约每年有50万新发宫颈癌病例，其中80%发生在发展中国家.我国是HPV感染比较严重的地区之一，每年新发病例约15万，占世界的1/3.我国人群宫颈癌感染也以HPV16为主，其各早晚期基因均存在不同形式的突变[3,4].其中HPV16 E7蛋白N端区包括pRb结合位点和CKⅡ磷酸化位点，具有强抗原性，16～37位氨基酸含两个独立的结构域，其中21～29位氨基酸介导pRb抑癌蛋白的结合，是与pRb结合的最关键位点.E7和Rb蛋白之间的相互作用是恶性转化的最重要机制.HPV16 E7基因第29位密码子突变导致氨基酸由天门冬酰胺变为丝氨酸(Asn→Ser)，丝氨酸被磷酸化，蛋白质构象和极性可能发生改变，从而改变生物学功能如结合pRb的能力，影响HPV的转化作用和免疫原性等生物学特性[5].
目前对HPV16 E7基因的第29位密码子突变与宫颈癌相关性无统一的结论.韩国的一项研究中[1]发现70%的宫颈浸润癌中存在该突变，与对照组相比有差异，提示E7癌蛋白的这种变异改变了其生物学活性.Stephen等[6]对四川地区的宫颈癌组织仅得到其突变率而未做进一步的对照分析.我国内地HPV16此点突变与宫颈癌的关系尚无系统研究.我们利用TDIFP新技术对宫颈病变中HPV16 E7第29位密码子点突变进行了检测，结果本研究样本浸润癌的突变率为43.48%，不同与其他地区；突变率随病变程度的升高而增加，提示该突变可能是HPV致癌的一个高危因素.另外如果E7蛋白的氨基酸改变位于免疫识别的关键区，针对一种变异病毒型的疫苗可能对其他的变异型的效果会降低.因此还需要结合前瞻性队列研究的大规模人群检测来探讨自然发生的E7基因变异的生物学和临床意义.
建立在扩增基础上的基因点突变检测方法有传统的PCRRFLP、等位基因特异性寡核苷酸分析法(ASO)、寡核苷酸链接检测法(OLA)及新发展的反向限制性位点突变分析(iRSM)、等位基因特异性扩增技术(ASPCR)及基因芯片等检测方法，最直接的方法是基因测序[2].这些方法不同程度地存在通量低、成本高、技术操作复杂及污染等不足，不易推广和大规模应用.本研究建立了HPV16 E7基因点突变TDIFP [7]检测方法，该方法是一种通量高、实用性强的基因分析技术，首先PCR扩增含有待检测位点的HPV基因区域，然后对PCR产物进行纯化，再用突变位点上游互补的TDI引物和模板反应，TDI引物的3′末端掺入与待检测碱基互补的荧光标记终止子：双脱氧R110acyCTP或TAMRAacyTTP.荧光标记的双脱氧核苷酸掺入引物后其分子旋转速度将减小，相应波长偏振光激发后所得偏振值(单位为mP)将明显增高，由此可知加入碱基的种类，并依据碱基互补原则判断突变位点的核苷酸种类.
TDIFP的优点是：①不需要任何标记的引物，试剂和设备价格低；②单碱基掺入反应(TDI)条件容易优化；③用荧光偏振做为检测方式，FP值大小与荧光强度无关；④偏振值检测直接在溶液中进行，不需要分离未结合的标记ddNTPs；⑤TDIFP方法能够满足从小规模的实验研究到全自动高通量的大规模临床检测需要[8].本方法已经广泛应用于包括单核苷酸多态性(SNPs)[9]和单倍型在内的基因变异研究，从标本中随机选择10例标本用测序的方法进行对比，符合率为100%，与TDIFP技术在其他基因变异研究中结果相一致[10].该方法同样可应用于其他HPV位点的突变检测，有望为今后大规模研究HPV基因变异和HPV相关肿瘤诊断试剂的开发、预防及治疗性疫苗的研制提供十分有用的技术平台.
【参考文献】
[1] Song YS, Kee SH, Kim JW, et al. Major sequence variants in E7 gene of human papillomavirus type 16 from cervical cancerous and noncancerous lesions of Korean women[J]. Gynecol Oncol, 1997; 66:275-281.
[2] 张菊，高艳娥，阎小君，等. 高通量人乳头瘤病毒分型基因诊断方法的研究[J]. 中华检验医学杂志，2003;26(3) :145-147.
Zhang J, Gao YE, Yan XJ, et al. A high throughput assay for human papillomavirus genotypes with fluorescence polarization[J]. Chin J Lab Med, 2003；26(3): 145-147.
[3] Vaeteewoottacharn K, Jearanaikoon P, Ponglikitmongkol M. Comutation of HPV16 E6 and E7 genes in Thai squamous cervical carcinomas[J]. Anticancer Res, 2003;23:1927-1931.
[4] 陈蕤，张菊，阎小君，等. 人乳头瘤病毒16型主要衣壳蛋白L1基因的克隆及序列分析[J]. 第四军医大学学报，2002;23(7)：593-595.
Chen R, Zhang J, Yan XJ, et al. Cloning and sequence analysis of L1 major capsid protein gene of human papillomavirus type 16[J]. J Fourth Mil Med Univ, 2002;23(7):593-595.
[5] Edmonds C, Vousden KH. A point mutational analysis of human papillomavirus type 16 E7 protein[J]. J Virol, 1989; 63: 2650-2656.
[6] Stephen AL, Thompson Ch, Tattersall MH, et al. Analysis of mutations in URR and E6/E7E oncogenes of HPV16 cervical cancer isolates from central China[J]. Int J Cancer, 2000;86:695-701.
[7] Hsu TM, Chen X, Duan S, et al. Universal SNP genotyping assay with fluorescence polarization detection[J]. Biotechniques, 2001; 31:560-570.
[8] Kwok PY, Chen X. Detection of single nucleotide polymorphisms[J]. Curr Issues Mol Biol, 2003;5:43-60.
[9] Freeman BD, Buchman TG, McGrath S, et al. Templatedirected dyeterminator incorporation with fluorescence polarization detection for analysis of single nucleotide polymorphisms implicated in sepsis[J]. J Mol Diagn, 2002; 4:209-215.
[10] Hsu TM, Law SM, Duan S, et al. Genotyping singlenucleotide polymorphisms by the invader assay with dualcolor fluorescence polarization detection[J]. Clin Chem, 2001; 47:1373-1377.
作者简介:陈中灿(1976),男(汉族),河南省开封市人. 硕士生(导师阎小君). Tel.(029)83374771Email.chenzhongcan@163.com
(1第四军医大学基因诊断技术研究所,陕西 西安 710033, 2西安交通大学第二医院妇产科,陕西 西安 710004)
编辑许昌泰, http://www.100md.com(陈中灿，张菊，高艳娥，夏琳，白玉杰，阎小君)