2 7 0 生 物 多 样 性 B i o d i v e r s i t y S c i e n c e l 2卷

    准确性 ， 又具有 P C R的高效性等优点。本研究采用

    A F L P分子标记技术检测了元宝山冷杉种群的遗传

    多样性， 旨在了解元宝山种群的遗传变异水平， 从而

    更清楚地认识元宝山冷杉的生存潜力和濒危程度，为采取有针对性的挽救和保护措施提供科学的依

    据。

    l 材料方法

    1 . 1 取 样

    元宝山冷杉种群集中分布在元宝山的冷杉坪

    内， 迷路坪、 铁杉顶、 白石坪等地也有少量分布， 分布

    范围海拔 1 7 0 0— 2 0 5 0 m。2 0 0 1年 6月底， 在 4个相

    对独立的小地点选取元宝山冷杉高 2 m以上的植

    株， 取样个体数量取决于群体规模。取样时个体间

    距尽可能大， 以避免同宗后代。共采集 4 3株个体，并依次编号。1 —2 2号采自厘杉坪， 2 3 _2 5号采 自

    迷路坪， 2 6 —3 0号采自铁杉顶， 3 1 _ _ 4 3号采自白石

    坪。每株取一枝带幼叶的小枝条， 插于水中带回实

    验室， 取其幼叶用于 D N A提取。

    1 . 2 DN A提取

    采用 C T A B法( D o y l eD o y l e ，1 9 8 7 ) 提取基因

    组总 D N A， 但6 5 ~ C 保温时间延长到 3 h 。用玻璃奶

    纯化总 D NA。

    1 . 3 AFL P分析

    A F L P分析参照 V o s e t a 1 . ( 1 9 9 5 ) 的方法略有修

    改。基因组总D N A用两种限制性内切酶( E c o R I 和

    Ms e I ) 在3 7 ℃保温2 h ， 接着在6 5 ℃保温2 h进行双

    酶切； 限制性酶切消化后， 用 T 4 D N A连接酶在2 0 ℃

    保温 1 6 h将酶切片段连接到双链E c o R I 和Ms e I 接

    头( V o s e t a 1 . ， 1 9 9 5 ) 上； 连接产物用预扩增引物进

    行预扩增。预扩增产物稀释 1 0倍后， 进行选择性扩

    增。从 2 4对引物组合中筛选出4对引物组合： E —

    ACA M— CTr，E— AACM— CTY， E— AACM— CTG， E—

    A C A M— C A T进行正式选择性扩增， 其中E c o R I引

    物的5 端用荧光染料进行标记， 扩增时 E c o R I 引物

    和Ms e I 引物的最终浓度分别为0 . 1 f x mo l L和 0 . 5

    f x mo l L 。选择性 P C R扩增程序为： 9 4 ℃ 0 . 5 m i n，6 5 ~ C 0 . 5 m i n ， 7 2 ℃ 1 mi n， 以后每个循环退火温度

    降低0 . 7 ℃ ， 共 1 3个循环； 接 2 3个循环， 每个循环

    9 4 ℃ 0 . 5 mi n， 5 6 ~ C 0 . 5 mi n ， 7 2 ℃ 1 mi n 。选择性扩

    增产物在 6 %的变性聚丙烯酰胺凝胶上， 在 自动测

    序仪( A B I 3 7 7 ) 上分离检测， 得到 A F L P的 D N A指

    纹图谱。

    1 . 4 数据分析

    A F L P是显性标记， 同一对引物的扩增产物中，电泳迁移率一致的条带被认为具有同源性。按照在

    相同迁移位置上有扩增带记为 1 、 无带为 0的方法

    记录电泳谱带， 建立 A F L P表型数据矩阵用于进一

    步分析。用 P O P G E N E 3 2( Y e h e t a 1 . ，1 9 9 7 ) 软件

    计算分析多态位点百分比率( P P ) 、 种群基因多样

    性值 ( )( N e i ，1 9 7 3) 、 S h a n n o n多样性指数 ( ， )

    ( L e w o n t i n ， 1 9 7 2)和 亚 种 群 间遗 传 距 离 ( N e i ，1 9 7 2 ) 。用 N T S Y S — P C 2 . 1 0( R o h l f ， 1 9 9 4) 软件计算

    样品间的 N e i和 L i相似性 系数 5 n( N e i L i ，1 9 7 9 ) ， 并进行 U P G MA法聚类分析。

    2 结果

    2 . 1 遗传 多样性

    4对引物组合： E — A C A M— C T Y ， E — A A C M— C T Y ，E — A A C M— C T G， E — A C A M— C A T对元宝山冷杉种群

    内选取的4 3个样品， 分别扩增得到6 5 、 6 9 、 6 3和6 4

    条清晰的带( 共2 6 1条) ， 分子量在 5 O b p至 5 0 0 b p

    之间， 平均每对引物可扩增出 6 5 . 3个条带。其中

    1 3 3条是多态性带， 多态位点百分 比率 ( P P )=

    5 0 . 9 6 。基因多样性值( ) 为0 . 1 5 1 0 ， 种群的 S h a n —

    n o n多样性指数( ， )为0 . 1 7 3 5 。以4处采样地点作

    为亚种群进行分析， 亚种群间的遗传关系见表 1 。4

    个亚种群之间的遗传距离很小， 在0 . 0 2 8 7与0 . 0 6 3 5

    之间。另外也没有发生带型的固定， 即每一种带型

    都是4个采样地点共同具有的。从以上结果可看

    出， 在4个亚种群间没有明显的遗传分化。

    2 . 2 样品间的遗传关系

    个体间相似性系数越大， 遗传( 亲缘) 关系越

    近； 反之， 遗传关系越远。元宝山冷杉种群内抽样的

    4 3个个体之间的相似性系数值都很大， 样品间的

    N e i 和 L i 相似性系数在0 . 8 7 7— 0 . 9 9 4之间， 说明它

    们的遗传相似性程度很高， 。利用 U P G MA法对各

    样品( 4 3个个体) 基于 N e i 和 L i 相似性系数进行聚

    类分析， 得到的树状图见图 1 。U P G MA聚类可将种

    群内抽样的个体都区分开来， 因为个体之间的遗传

    相似性高， 它们没有按亚种群被聚合为4群。反映

    出元宝山冷杉的遗传多样性较低， 4个亚种群间没

    有明显的遗传分化。

    维普资讯 http:www.cqvip.com 2期 王燕等：濒危植物元宝山冷杉的遗传多样性研究

    图1 基于 N e i · L i 相似性系数的4 3个元宝山冷杉植株的 U P G MA聚类分析树状图

    Fi g . 1 A UPGMA d r a n dr o g r a m o f t he 43 i n di v i du a l s o f Ab i e s y u an b a o s h an e n s i s b as e d o r l t h e Ne i a n d Li s i mi l a r i t y c o e f f i c i e n t

    3 讨论

    反映元宝山冷杉的遗传多样性的三个指标为：

    多态性比率 P=5 0 . 9 6 %， N e i S基因多样性值 H=

    0 . 1 5 1 0 ， S h a n n o n多样性指数 ， =0 ， 1 7 3 5 。与一些裸

    子植物的R A P D或 I S S R数据资料进行间接比较( 表

    2 ) ......