叠氮活化烟草多酚氧化酶Ⅱ的机理.pdf
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2006年2月23日
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参见附件(229KB,6页)。
戴 亚等 叠氮活化烟草多酚氧化酶 I I的机理 l
烟气与化学
叠氮活化烟草多酚氧化酶 I I的机理
戴 亚 施春华 汪长国 刘清亮
摘 要
至今人们一直报道叠氮作为金属蛋 白( 特别是铜蛋 白) 的一种抑制剂, 本研究表 明叠氮也可 以作为烟草多酚氧化酶 I I ( 简称
P P OI I ) 的激活剂。在天然 P P OI I 、 叠氮一P P OI I 络合物和过氧化物一P P OI I 络合物的方波电位学研究中, 从硝基蓝四唑 ( n i t r o b l u e
t e t r a z o l i u m) 能被酶还原和 P P OI I 能被过氧化物激活的试验结果 可以看 出, 叠氮与 P P OI I的结合诱导 了天然 P P OI I活性 中心 的
C u O2 C u生成 了C u O2 2 - Cu活性中心结构。叠氮作为激活剂的原因应归因于叠氮分子与 P P OI I的络合反应导致了Cu O2 2 C u的生
成, 它恰是过氧化物一P P OI I 络合物的活性中心, 其实质是过氧负离子起到激活剂的作用。
关键词 :烟草 多酚氧化酶 叠氮 活化 铜蛋白质
中图分类号 : T S 4 1 3 文献标识码 : A 文章编号 : 1 0 0 4 —5 7 0 8 ( 2 0 0 4 ) 0 6 —0 0 0 1 —0 6
多酚氧化酶是一组铜蛋白, 它们广泛分布于从菌
类到哺乳动物的整个种族系列中I 1 ] , 他们的共 同性质
是利用分子 氧催化氧化多酚到醌[ 2 ] 。P P OI I已经从
Ni c o t i a n a烟草中成功地分离纯化出来[ 3 ] , 它的分子量
为3 5 6 0 0并且含有反铁磁性偶合的两个铜离子 , P P OI I
的最适 p H和温度分别为p H一6 . 5和 4 O ℃, 我们的试
验表明, P P OI I 不能催化氧化对苯二酚和间苯二酚, 对
多酚氯原酸仅有很低的活性[ 4 ] 。
由于叠氮分子能与许多含铜的酶形成配合物, 至
今人们一直报道它是多酚氧化酶的抑制剂[ 5 ] , 叠氮
与铜的配位可能有 3种类型的结构[ 8 ] , 即 一 1 , 3桥式;
一
1 , 1桥式和T 7 一 终端式 。 根据N。 一 不对称伸缩振动的拉
曼光谱实验得出的结论 , 十八烷基载体蛋白( 6去饱和
酶) 就是用两种方式与叠氮配位的, p H一7 . 8时的7 7 ( 1 )
终端式和 p Hi7 . 0时的 一 1 , 3桥式E g , l o ] 。叠氮与氧化
过 的 细 胞 色 素 C 氧 化 酶 ( 来 源 于 Pa r a c o c c u s
d e n t r i f i c a n s) 的相互作用表明叠氮也是以两种形式结
合 : 强亲和方式 , 叠氮结合在近于双核中心的非金属位
点上 ; 弱结合方式, ( Kd一4 . 1 mo 1 ) , 叠氮以桥式结
合 于双核 中心[ 】 “ ] 。细 胞 色素 B氧化 酶 ( 来 源 于
戴 亚, 男 , 5 7岁 , 教授 , 重庆烟草工业公司技术 中心, 重庆南岸区南
坪东路 2号宏声大厦1 8 F, 重庆 , 4 0 0 0 6 0
施春华 , 刘清亮 , 中国科学技术大学化学系, 合肥 , 2 3 0 0 2 6
汪长国, 通讯地址同第一作者。
收稿 日期 ; 2 0 0 3 — 1 1 - 2 7
Es c h e r i c h i a c o l i )也是两种结构方式结合叠氮, 在血
红素 O( 3 ) 和 C u — B之 间形成桥式 的配合物I 】 , 这与
L l i t t l e等[ 1 报道, 即叠氮以终端方式结合于 C u — B是
不同的, 从 N。 一 的F T— I R的不对称伸缩振动和 4 1 0 n m
处吸收的增加证实了它与活性中心的结合是终端式
的 。
叠氮可使金属酶中毒( 特别是铜蛋白酶) 。主要是
它与活性中心的金属离子有强的配位能力 , 并改变了
活性中心的配位数和构象, 消除了活性中心内金属离
子的活性。 在叠氮与铜氧化酶的反应中, 叠氮分子可能
阻碍了酪氨酸与铜的配合 , 从而妨碍了关键性 中间体
的生成而抑制氧化酶的活性[ “ ] , 换句话说 , 叠氮保护
了酶使其不失去C u( I ) 离子口 引。这结果可以设想在叠
氮与金属酶的相互作用中可能具有一种还不知道的功
能。事实上, 我们发现在低浓度下叠氮能激活烟草
P P OI I , 这与其他人报道叠氮总是铜蛋白的抑制剂是
不相同的。本文将讨论叠氮激活P P OI I的机理和在激
活铜蛋白的过程中叠氮的新功能。
1 材料与方法
1 . 1 材 料
新鲜烟叶( Ni c o t i a n a) 直接从烟 田摘取 , 洗涤后
在冰箱 内 4 ℃以下保存 约 2 4 h 。层析柱填料 DE AE—
S e p h a d e x A一 5 0,CM— S e p h a d e x C一 5 0和 Se p h a d e x G一
7 5是从 P h a r ma c i a C o r p o r a t i o n ( 瑞典)购买。Na t i o n
维普资讯 http:www.cqvip.com 2 中国烟草学报 2 0 0 4年 1 2月 第 1 0卷 第 6 期
溶液( 5 乙醇溶液) 从 S i g ma C o r p o r a t i o n( 美国) 购
买 。
1 . 2 蛋白质 制备
天然 P P OI I ( 以后简称 P P OI I ) 蛋白质的制备按如
下步骤进行: 丙酮萃取 , 3 0 和 8 0 硫酸胺沉淀, 然后
是 DEAE— S e p h a d e x A一 5 0 ,CM— S e p h a d e x C一 5 0 和
S e p h a d e x G一 7 5层析 柱分 离纯 化[ 3 ] , 其酶 的纯度 用
S DS P AGE和MAL DI — T OF — MS方法进行测量L 】 。 一
个单位酶活性定义为 4 2 0 n m下每mi n增加 0 . 0 1单位
的吸收。蛋 白质浓度的测定按 照B r a d f o r d方法并用
B S A作为标准蛋白口 。
1 . 3 方波电位测量
电化学测量是在L K 9 8微机控制的电化学系统上
进行的。 方波电位测量使用了一个叁电极隔离电槽, 一
个 4 mm 玻璃 电极 ( GC) 作 为工作电极 , 一个铂 电极
( P t ) 为对照电极 , 一个 Ag Ag C1 电极为参比电极。每
次试验之前 , 用金刚砂抛光GC电极表面, 二次蒸馏水
完全冲洗干净, 并在空气中干燥 。 P P OI I在GC电极上
膜的制备步骤如下: 把 3 L浓度为2 0 mg mL的P P OI I
溶液与 3 L的n a f i o n储备液( 1 5 ) 进行充分混合 , 涂
布在GC电极表面, 在空气中4 C下干燥6 h 。 1:1叠氮
一
P P OI I 和 1: 4叠氮一P P OI I 络合物样品兑去离子水
透析5 h。 把Hz O ( 1 mmo l L) ] D 人到电解液中 ......
烟气与化学
叠氮活化烟草多酚氧化酶 I I的机理
戴 亚 施春华 汪长国 刘清亮
摘 要
至今人们一直报道叠氮作为金属蛋 白( 特别是铜蛋 白) 的一种抑制剂, 本研究表 明叠氮也可 以作为烟草多酚氧化酶 I I ( 简称
P P OI I ) 的激活剂。在天然 P P OI I 、 叠氮一P P OI I 络合物和过氧化物一P P OI I 络合物的方波电位学研究中, 从硝基蓝四唑 ( n i t r o b l u e
t e t r a z o l i u m) 能被酶还原和 P P OI I 能被过氧化物激活的试验结果 可以看 出, 叠氮与 P P OI I的结合诱导 了天然 P P OI I活性 中心 的
C u O2 C u生成 了C u O2 2 - Cu活性中心结构。叠氮作为激活剂的原因应归因于叠氮分子与 P P OI I的络合反应导致了Cu O2 2 C u的生
成, 它恰是过氧化物一P P OI I 络合物的活性中心, 其实质是过氧负离子起到激活剂的作用。
关键词 :烟草 多酚氧化酶 叠氮 活化 铜蛋白质
中图分类号 : T S 4 1 3 文献标识码 : A 文章编号 : 1 0 0 4 —5 7 0 8 ( 2 0 0 4 ) 0 6 —0 0 0 1 —0 6
多酚氧化酶是一组铜蛋白, 它们广泛分布于从菌
类到哺乳动物的整个种族系列中I 1 ] , 他们的共 同性质
是利用分子 氧催化氧化多酚到醌[ 2 ] 。P P OI I已经从
Ni c o t i a n a烟草中成功地分离纯化出来[ 3 ] , 它的分子量
为3 5 6 0 0并且含有反铁磁性偶合的两个铜离子 , P P OI I
的最适 p H和温度分别为p H一6 . 5和 4 O ℃, 我们的试
验表明, P P OI I 不能催化氧化对苯二酚和间苯二酚, 对
多酚氯原酸仅有很低的活性[ 4 ] 。
由于叠氮分子能与许多含铜的酶形成配合物, 至
今人们一直报道它是多酚氧化酶的抑制剂[ 5 ] , 叠氮
与铜的配位可能有 3种类型的结构[ 8 ] , 即 一 1 , 3桥式;
一
1 , 1桥式和T 7 一 终端式 。 根据N。 一 不对称伸缩振动的拉
曼光谱实验得出的结论 , 十八烷基载体蛋白( 6去饱和
酶) 就是用两种方式与叠氮配位的, p H一7 . 8时的7 7 ( 1 )
终端式和 p Hi7 . 0时的 一 1 , 3桥式E g , l o ] 。叠氮与氧化
过 的 细 胞 色 素 C 氧 化 酶 ( 来 源 于 Pa r a c o c c u s
d e n t r i f i c a n s) 的相互作用表明叠氮也是以两种形式结
合 : 强亲和方式 , 叠氮结合在近于双核中心的非金属位
点上 ; 弱结合方式, ( Kd一4 . 1 mo 1 ) , 叠氮以桥式结
合 于双核 中心[ 】 “ ] 。细 胞 色素 B氧化 酶 ( 来 源 于
戴 亚, 男 , 5 7岁 , 教授 , 重庆烟草工业公司技术 中心, 重庆南岸区南
坪东路 2号宏声大厦1 8 F, 重庆 , 4 0 0 0 6 0
施春华 , 刘清亮 , 中国科学技术大学化学系, 合肥 , 2 3 0 0 2 6
汪长国, 通讯地址同第一作者。
收稿 日期 ; 2 0 0 3 — 1 1 - 2 7
Es c h e r i c h i a c o l i )也是两种结构方式结合叠氮, 在血
红素 O( 3 ) 和 C u — B之 间形成桥式 的配合物I 】 , 这与
L l i t t l e等[ 1 报道, 即叠氮以终端方式结合于 C u — B是
不同的, 从 N。 一 的F T— I R的不对称伸缩振动和 4 1 0 n m
处吸收的增加证实了它与活性中心的结合是终端式
的 。
叠氮可使金属酶中毒( 特别是铜蛋白酶) 。主要是
它与活性中心的金属离子有强的配位能力 , 并改变了
活性中心的配位数和构象, 消除了活性中心内金属离
子的活性。 在叠氮与铜氧化酶的反应中, 叠氮分子可能
阻碍了酪氨酸与铜的配合 , 从而妨碍了关键性 中间体
的生成而抑制氧化酶的活性[ “ ] , 换句话说 , 叠氮保护
了酶使其不失去C u( I ) 离子口 引。这结果可以设想在叠
氮与金属酶的相互作用中可能具有一种还不知道的功
能。事实上, 我们发现在低浓度下叠氮能激活烟草
P P OI I , 这与其他人报道叠氮总是铜蛋白的抑制剂是
不相同的。本文将讨论叠氮激活P P OI I的机理和在激
活铜蛋白的过程中叠氮的新功能。
1 材料与方法
1 . 1 材 料
新鲜烟叶( Ni c o t i a n a) 直接从烟 田摘取 , 洗涤后
在冰箱 内 4 ℃以下保存 约 2 4 h 。层析柱填料 DE AE—
S e p h a d e x A一 5 0,CM— S e p h a d e x C一 5 0和 Se p h a d e x G一
7 5是从 P h a r ma c i a C o r p o r a t i o n ( 瑞典)购买。Na t i o n
维普资讯 http:www.cqvip.com 2 中国烟草学报 2 0 0 4年 1 2月 第 1 0卷 第 6 期
溶液( 5 乙醇溶液) 从 S i g ma C o r p o r a t i o n( 美国) 购
买 。
1 . 2 蛋白质 制备
天然 P P OI I ( 以后简称 P P OI I ) 蛋白质的制备按如
下步骤进行: 丙酮萃取 , 3 0 和 8 0 硫酸胺沉淀, 然后
是 DEAE— S e p h a d e x A一 5 0 ,CM— S e p h a d e x C一 5 0 和
S e p h a d e x G一 7 5层析 柱分 离纯 化[ 3 ] , 其酶 的纯度 用
S DS P AGE和MAL DI — T OF — MS方法进行测量L 】 。 一
个单位酶活性定义为 4 2 0 n m下每mi n增加 0 . 0 1单位
的吸收。蛋 白质浓度的测定按 照B r a d f o r d方法并用
B S A作为标准蛋白口 。
1 . 3 方波电位测量
电化学测量是在L K 9 8微机控制的电化学系统上
进行的。 方波电位测量使用了一个叁电极隔离电槽, 一
个 4 mm 玻璃 电极 ( GC) 作 为工作电极 , 一个铂 电极
( P t ) 为对照电极 , 一个 Ag Ag C1 电极为参比电极。每
次试验之前 , 用金刚砂抛光GC电极表面, 二次蒸馏水
完全冲洗干净, 并在空气中干燥 。 P P OI I在GC电极上
膜的制备步骤如下: 把 3 L浓度为2 0 mg mL的P P OI I
溶液与 3 L的n a f i o n储备液( 1 5 ) 进行充分混合 , 涂
布在GC电极表面, 在空气中4 C下干燥6 h 。 1:1叠氮
一
P P OI I 和 1: 4叠氮一P P OI I 络合物样品兑去离子水
透析5 h。 把Hz O ( 1 mmo l L) ] D 人到电解液中 ......
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