2001 年5 月 Journal of Zhengzhou College of Animal Husbandry Engineering May 2001

    收稿日期:2000 - 09 - 18

    苜蓿组织培养研究进展

    李先芳1

    王文静1

    董学智2

    (1 郑州牧业工程高等专科学校畜牧工程系 ,河南郑州 450008 ;

    2 陕县畜牧局 ,河南陕县 472000)

    中图分类号:S812. 4 文献标识码:A 文章编号:1008 - 3111(2001) 02 - 00105 - 04

    苜蓿( Medicago sat iva)在世界上广为种植 ,北

    起北纬 69°斯堪的纳维亚半岛 ,南至南纬 55°阿根廷

    和智利。全球栽培面积约为 3302 万 hm2

    ,主要分布

    于美国、阿根廷、前苏联、加拿大和中国。

    尽管苜蓿优点甚多 ,但也存在种子细小、产量

    低、种子硬实率较高、花叶病危害大及反刍动物大量

    采食易得臌胀病等不足之处 ,给苜蓿产业化生产带

    来许多不便。1972 年 ,美国学者 Saunders等人从未

    成熟的苜蓿花药、子房、子叶愈伤组织分化再生苜蓿

    植株成功 ,标志着苜蓿组织培养研究的开始 ,自此大

    量有关苜蓿组织培养的研究工作得以开展。

    1 苜蓿组织培养中的外植体

    外植体是指由活体植物组织分离下来用于培养

    的那一块植物。苜蓿组织培养研究开展近 30 年来 ,国内外研究报告中所采用的外植体种类繁多 ,几乎

    苜蓿所有器官或组织都可作为外植体 ,如茎尖、叶

    片、茎段、幼芽、子叶、下胚轴、上胚轴、花药、花粉、子

    房、胚珠、根、叶柄等。Cheyne 和 Dale (1980)用苜蓿

    茎尖作为外植体 ,离体培养在添加 NAA 的 B5 培养

    基上 ,植株得到再生 ,且再生率高低很大程度上受茎

    尖大小影响 ,其中以 2 - 4mm 较为适宜 ,再生率达

    80 %以上。Navak 和 Konecna (1982)用叶柄诱导形

    成体细胞并分化出植株 ,且叶柄体细胞形成胚和植

    株再生能力强。在改良的 Blaydes 培养基上 ,未成

    熟的胚珠、花药、上胚轴也分化出完整植株。李聪等

    (1989)用苜蓿子叶接种 ,使 14 个苜蓿品种分化出

    苗 ,再生率为 10 % - 74 %。何茂泰等(1988)利用野

    生黄花苜蓿的花药分化出完整植株 ,用时 110d 左

    右。时永杰(1997)等对苜蓿子叶、下胚轴、茎、花茎、叶、花序、子房、花药等进行离体培养 ,诱导分化成

    苗。Johnson等和 Kao 等(1981)利用苜蓿幼芽获得

    原生质体形成体细胞胚产生植株。Xu (1982)用苜

    蓿根尖细胞原生质体得到再生植株。一般形成脱毒

    苗时常以茎尖作为外植体 ,可高度保持种性;形成胚

    性愈伤组织时可选叶柄、子叶、上胚轴、下胚轴、幼芽

    等作为外植体 ,污染小 ,材料易得、方便;快繁可选茎

    段、花茎、叶片、花序等作为外植体 ,操作简单、取材

    容易;单倍体选择应采用花药、花粉、胚珠、子房等为

    外植体 ,但组织培养难度较大。

    2 苜蓿组织培养途径

    2. 1 直接分化再生途径 是指由外植体细胞越过

    脱分化产生愈伤组织阶段直接分化出不定芽获得再

    生的方式 ,具有再生周期短、遗传变异小 ,尤其是茎

    尖分生组织细胞的遗传稳定性更好 ,但转化频率较

    低 ,易产生嵌合体。这种转化在组织培养中常见于

    快繁及种质保存。苜蓿茎段、花茎、叶片、花序、茎尖

    等外植体可在添加适当BA 和 NAA 的 MS培养基

    上直接成苗 ,成苗率达 30 % - 70 %。

    2. 2 愈伤组织再生途径 是指外植体经脱分化形

    成愈伤组织 ,并通过再分化形成植株。这是苜蓿组

    织培养及快繁应用的主要方式。很多人对苜蓿的子

    叶、下胚轴、上胚轴、茎段、花茎、叶片、花序、子房、花

    药、叶柄节间组织等进行了诱导愈伤及再分化的研

    究 ,均取得再生植株 ,但再生率高低不一 ,应该与品

    种基因型及外植体种类、培养基的不同有关。此转

    化方式的特点是:扩繁量大 ,转化率高;外植体取材

    广泛 ,苜蓿多种器官及组织能实现再生;遗传变异

    大、不稳定;嵌合体多 ,随着愈伤组织培养继代延长 ,嵌合体比例增加。因此对于优良苜蓿品种采用愈伤

    再分化途径快繁时 ,应注意对再生植株进行形态学、遗传学鉴定 ,以保持优良种性 ,并在组培中获得好的

    遗传变异。

    第21 卷第2 期 郑州牧业工程高等专科学校学报 Vol . 21 No. 2

    ? 1995-2005 Tsinghua Tongfang Optical Disc Co., Ltd. All rights reserved.2. 3 原生质体再生途径 是指通过分离原生质体

    进行培养经愈伤组织分化出再生植株。其主要特点

    是:外源DNA 摄取更加有效;嵌合体少;遗传变异

    更大 ,稳定性更差;培养周期长、难度大;植株分化率

    低。苜蓿花药、叶肉、根尖、茎尖、子叶、幼芽等外植

    体已成功地建立原生质体培养系 ,为苜蓿种内、属间

    实现体细胞杂交奠定良好基础 ,为外源基因的导入

    提供有效保障。中国农科院草原研究所和北京畜牧

    所分别在 90 年代培养黄花苜蓿和紫花苜蓿原生质

    体成功。Kao 和 Michayluk 用苜蓿叶肉分离原生质

    体并诱导成苗 ,苜蓿同一品种不同单株分离原生质

    体在分裂频率及胚状体形成上有差异。Santos等以

    30 - 35 日龄幼苗叶片分离原生质体形成植株 ,但苗

    龄超过 35 日龄时 ,分离的原生质体不能分裂。许智

    宏等用无菌萌发的种子幼根分离原生质体培养成

    功。在苜蓿叶肉组织、幼苗、子叶及幼根的原生质体

    培养中 ,植板率子叶 >叶片 >幼根;而由根原生质体

    形成胚状体时间最短 ,子叶次之 ,叶肉原生质体最

    长。杨茁荫和徐子勤(1997 ,2000)均报道用苜蓿和

    红豆草的原生质体培养系进行体细胞杂交 ,获得异

    核体。

    2. 4 胚状体再生途径 在组织培养离体状态条件

    下 ,任何体细胞均可诱导胚胎形成 ,在形态结构和功

    能上类似于有性胚的结构被称为体细胞胚或胚状

    体。研究基因转化中这是最理想方法。特点是转化

    率高、嵌合体少、双极结构能同时分化出根和芽、遗

    传一致。是人工种子及种质保存的理想材料。以苜

    蓿的茎尖、叶柄、花药、下胚轴、子叶、幼叶等外植体

    在 MS、 SH等培养基上均有分化体细胞胚并再生植

    株的报道。李聪(1989)对 22 个苜蓿品种的子叶进

    行诱导 ,鱼雷状胚诱导成苗率高者可达 74 %。

    2. 5 生殖细胞受体途径 主要采取两种方式 ,一是

    利用组织培养技术进行小孢子和卵细胞的单倍体培

    养 ,诱导出胚性细胞和愈伤组织细胞 ,分化出单倍体

    植株 ,进行有性或体细胞杂交 ,产生多倍体杂种;另

    一个是利用花粉管导入法、花粉粒浸泡法、子房微针

    注射法等将外源基因导入受体植物细胞内。前者苜

    蓿上研究较多 ,后者有关报道甚少。

    3 苜蓿组织培养中培养基的选择

    培养基是活体植物组织体外保存、生长发育的

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