2005年 4月 重庆大学学报 (自然科学版 ) Ap r . 2005

    第 28卷第 4期 Journal of Chongqing University (Natural Science Editi on) Vol . 28 No . 4

    文章编号: 1000 - 582X (2005) 04 - 0126 - 05

    苜蓿转基因研究进展3

    周 兴 龙1

    ,杨 青 川2

    ,王 凭 青1

    ,吴 明 生1

    ,谢 伟 伟1

    (1 .重庆大学 生物工程学院 生物力学与组织工程教育部重点实验室 ,重庆 400030;

    2 .中国农业科学院 畜牧研究所 ,北京 100094)

    摘 要:植物遗传转化是指利用分子生物学的手段将外源基因导入受体植物 ,使其获得新的性状。

    传统的育种方法进展缓慢 ,周期长 ,而且短期内性状表现不明显。转基因技术比传统的育种方法能快速

    有效地定向培育植物新品种 ,获得的新性状比较明显。因此 ,它已成为植物育种研究领域热点。目前常

    用的植物遗传转化法包括农杆菌介导 ,基因枪直接转化等方法 ,但农杆菌介导法由于外源基因整合的拷

    贝数少 ,重排程度低 ,转化效率高 ,是最常用的苜蓿遗传转化法。现在通过农杆菌介导法已获得了抗逆,抗除草剂和品质改良等新性状转基因苜蓿 ,为苜蓿遗传育种开辟了一条新的途径。

    关键词:苜蓿;遗传转化;研究进展

    中图分类号: S188 文献标识码: A

    紫花苜蓿是世界上分布最广的一种多年生豆科牧

    草 ,也是我国最重要的豆科牧草之一[ 1 ]

    ,它不仅产量

    高而且营养丰富。然而 ,随着草场盐碱化程度的加重 ,草场生态环境的破坏及草场植被的严重退化 ,需要培

    育大量的抗逆性紫花苜蓿新品种 ,来满足草地畜牧业

    对牧草产量日益增加的需要。采用传统的育种方式培

    育抗盐碱、 抗旱和抗病虫害的新品种存在着周期长、 见

    效慢等缺点。利用转基因技术培养紫花苜蓿抗逆性新

    品种是目前牧草育种中最有效的手段。1986年 ,首例

    由农杆菌介导的苜蓿转化获得成功 ,在此后的 10多年

    时间里 ,苜蓿转基因研究取得了很大进展 ,下面就近

    20年来苜蓿转基因研究做一综述。

    1 苜蓿转基因技术研究现状

    1 . 1 农杆菌介导的基因转化法

    1977年, Chilt on等人证明根癌农杆菌的 Ti质粒的

    一部分可以转入植物细胞,并插入植物的基因组中。Ti

    质粒是细胞核外的双链环状 DNA分子,长度约 200 kb,其中致病区和 T - DNA边界序列是 Ti质粒将外源

    DNA片段转移到植物细胞所必须的两个序列,插入 T -

    DNA两个边界序列之间的外源 DNA序列就有可能被

    转移到植物基因组中。

    Webb用 5种农杆菌对 6种豆科牧草 (包括紫花

    苜蓿 )进行遗传转化 ,发现有的农杆菌不能使紫花苜

    蓿的茎和叶柄致瘤 ,即农杆菌介导的转化方法在紫花

    苜蓿中具有寄主局限性[ 2 ]。虽然如此 ,根癌农杆菌的

    Ti质粒系统仍是目前研究最多 ,理论基础最清楚 ,技

    术方法最成熟的苜蓿基因转化途径[ 3 ]。

    农杆菌介导法转化受体时 ,外源基因整合的拷贝

    数少 ,重排程度低 ,转化效率高[ 3 ]。因此 ,目前苜蓿基

    因转化大都采用此方法。

    1 . 2 直接转化法

    直接转化法是通过物理或化学方法将外源基因导

    入植物细胞或原生质体 ,由此获得转基因植株的方

    法[ 3 ]。在苜蓿转基因研究早期阶段 ,常采用直接转化

    法。1986年 , Reich等用显微注射法将 Ti质粒导入紫

    花苜蓿原生质体 ,得到转化的愈伤组织[ 4 ]。1990年 ,Kuchuke等用直接基因转移法将外源基因导入苜蓿属

    另一个物种 M edicago borealis的叶肉原生质体获得转

    基因植株[ 5 ]。国内 ,黄绍兴等以紫花苜蓿根原生质体

    为材料 ,采用电击法将 Gus基因直接导入紫花苜蓿原

    3 收稿日期: 2004 - 12 - 11

    基金项目:国家“863” 重大项目 (2002AA241101)

    作者简介:周兴龙 (1979 - ) ,男 ,内蒙古阿荣旗人 ,重庆大学硕士研究生 ,从事生物工程研究。

    ? 1995-2005 Tsinghua Tongfang Optical Disc Co., Ltd. All rights reserved.生质体中 ,产生转基因植株 ,转化频率为 6 . 5%[ 1 ]

    ,为

    紫花苜蓿的品质改良、 抗逆性的提高等提供了一个有

    效的途径。

    直接转化法大都不受组织类型限制 ,而且避开了

    组织培养和再生的困难 ,但该法转入的基因拷贝数是

    随机的 ,导入的外源基因易沉默 ,因而转化效率低。

    2 苜蓿遗传转化研究进展

    2 . 1 转抗寒及抗旱基因苜蓿

    低温是限制植物地理分布及生物产量的重要因

    素 ,也是危害农业生产的主要自然灾害之一;干旱则是

    限制牧草生长的最重要因素。近年来 ,随着植物生理、细胞和分子生物学理论和方法的日益完善 ,植物冷驯

    化和抗寒、 抗旱分子机理的研究取得了显著进展[ 6 ]。

    在冷害、 干旱条件下 ,苜蓿细胞中会积累大量的活

    性氧 ,从而导致蛋白质、 膜质、 DNA及其它细胞组分的

    严重损伤 ,而苜蓿体内的各种酶促和非酶促抗氧化系

    统可有效清除活性氧 ,其中超氧化物歧化酶 ( SOD)是

    目前通过转基因方法提高植物抗寒、 抗旱性研究最为

    积极的对象。在高等植物中, SOD根据其辅基部位结

    合的不同金属离子分为 3类:Mn - SOD, Fe - SOD, Cu

    Zn - S OD,其中 Mn - SOD主要位于线粒体中 ,从 Fe -

    SOD的一些生化指标及前导序列推测 ,该酶存在于叶

    绿体中。Mn - SOD与 Fe - SOD具有序列相似性 ,并

    且含有完全相同的特征结构域。几种 SOD cDNA已从

    植物中得到克隆并用来转化不同的植物 ,最终获得

    SOD活性增强的转基因植株。在转基因苜蓿中 ,叶绿

    体 SOD的过量表达 ,提高了它们对氧化胁迫的耐受

    性; SOD在苜蓿线粒体中的过量表达 ,也具有同样的

    效果;转基因苜蓿 ChlSOD的过量表达 ,提高了植株对

    冻害的耐受性[ 7 ]。

    1989年 ,Bowler把烟草的 Mn - S OD cDNA导入苜

    蓿中 ,发现转基因植物 SOD活性增强。Hight ower等也

    将 Mn - SOD cDNA导入苜蓿。3年田间试验表明,干

    旱胁迫下转基因苜蓿的产量和存活率明显提高[ 8 ]。

    Mckersie等将烟草中克隆的 Mn - SOD的 cDNA置于

    35S启动子下转化苜蓿 (M edicago sativa) ,构建的质粒

    载体 pMitSOD包含一段转运肽序列 ,携带 Mn - SOD

    蛋白酶进入线粒体 ,而另一载体 pChiSOD编码的合成

    蛋白定位至叶绿体 ,结果转化植株表现对除草剂二苯

    乙醚的抗性增强 ,低温胁迫生长抑制明显减轻 ,但不同

    细胞器 (线粒体 ,叶绿体 )定位的 Mn - S OD转基因间

    植株抗性差异不大.经两个冬季的田间试验比较标明 ,转基因苜蓿越冬成活率大于未转移植株 ,平均提高产

    品质量 25%[ 9 ]。

    2 . 2 转耐盐碱基因苜蓿

    土壤盐碱化是影响农业和畜牧业生产的严重问

    题 ,全世界的盐碱地约占陆地面积的 1 3,我国也有大

    面积的盐碱地 ,且有逐年上升的趋势 ......