第 2 0卷 第 2期

    1 9 9 9年 6爿

    吉首 大学 学报 ( 自然科 学版 】

    J o u r na l o f J i s h o u u 嗍 竹 ( N a m商 s c c e E d i t i ~)

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    J I I -l 9 9 9

    细胞培 养法增殖油桐 尺蠖 NP V工艺条件 ‘

    一

    陈义光 谢 天恩

    ( 吉首大学生物学与环境科学系 吉首 4 1 ( ~ 0 0 )

    ( 中国科学院武汉病毒研究所 武汉 4 3 0 0 7 2 )

    毛 |

    【 摘要 】 探讨 了用油桐足蠖成虫卵巢细胞 系( B 5 4 8 4细胞系) 增殖油桐足蠖楮型 多南体病毒( B 吕 N P v ) 的若

    干工艺条件。结果显示 . 晶虫血淋巴在不同温度奈件下保存 . 4 o c 一个月内， 一2 0 o c 和液氮中4～6个月内， 病

    毒仍具有实用水平的活性 ； 感染詹的细胞培 养物 ， 用超声波破碎优 于斑氮冻融法； 感染后 的细胞培 养物培 养

    2 4

    破

    个细胞系， 并用于核型多角体病毒( N P V ) 的感染试验以来， 用“ 昆虫病毒一细胞系” 离体系统培

    养和研究昆虫病毒 ， 尤其是 N ， 已成为一条很重要的途径_ 2 0 J 。在生物防治方面， 人们已尝

    试用细胞系培养昆虫病毒做为杀虫剂和病毒源。

    油桐尺蠖( r r n跚 —s m ) 核型多角体病毒( B s N ~ V) 是 7 0年代末在我国发现的， _ 6 它对

    茶树的主要害虫之一——油桐尺蠖有高教的感染和致死作用。 H 我国工作者已对这种病毒进

    行了详尽的研究 ， 并建立了对 B s N I W高度敏感的油桐尺蠖成虫卵巢细胞系( B 9 4 8 4细胞系) J 。

    在此基础上 ， 研制出了人工饲料养虫 、 以 B s N P V - -B s 4 8 4离体系统增殖 B s N P V提供毒源生产

    B s N P V杀虫剂的新工艺_ 9 - 。李盂津- 的工作还表明此离体系统有望做为外源基因的表达系

    统 。

    为了进一步完善 B s N P V - - B s 4 8 4离体系统， 使之稳定高教 ， 操作标准化 ， 笔者特从病毒感染

    及收获工艺方面做了一些探讨 ， 现将结果报导如下。

    1 材料与方法

    1 . 1 细胞来源及培养基

    细胞 由中科院武汉病毒研究所昆虫病毒室提供 ， C O 培养箱 2 6℃静止培养 ， 取对数生

    长期细胞做感染试验 。

    培养基 8 5 %T C - - 1 0 0基础液【 ” ； I O %小牛血清 ； 5 %蓖麻蚕血清； 1 0 0单位 · m 1 青霉素 、链霉素。

    I . 2 病毒来源

    原始毒源为武汉病毒所提纯的多角体( B s N P B ) 。

    收稿 日期 [ 9 9 9—0 3 —2 2

    湖北省教委 自然科学基金资助课题

    维普资讯 http:www.cqvip.com 吉首大学学报( 自然科学版) 第 加 卷

    病虫血淋巴的获得： 选 4龄健康幼虫 ， 饥饿 O . 5 d ， 按每头 l 个多角体的量将 B s N P B喷洒

    在人工饲料上， 添食感染 5 d ， 然后剪尾足取血淋巴( 冰浴 ， 加少量饱和苯基硫脲) ，用无血清培

    养基稀释 1 0倍， 8 0—2型离心器 3 0 0 0 r p m离心 3 0r a i n . 上清液经 o 、 4 5 微孔滤膜过滤除菌

    低温保存备用。

    1 . 3 病毒滴走方法 、按 R e e d—Mu e n c h法 J 测算 T C I D s o ( 使半数组织培养物发生感染 的病毒 剂量， 5 0% t is s u e

    c u l t u r ei n f e c t i o n d o s e ) ， 以 1 0 d为观察截止期 ， 以在光镜下看到细胞核被多角体充满作为细胞病

    变标准。反应板用进 口2 4孔塑料培养板， 每孔培养细胞 1 ， 每个病毒稀释梯度感染 5个孔，每孔用病毒液 o . 1 ， 吸附 4 h 。

    1 . 4 超声波处理器

    J C一3型( 通化市超声波设备厂 ) 。

    2 结果与分析 .

    2 . 1 病虫血淋巴保存方法研究

    采取病虫血淋 巴， 测 Ⅱ 为每 1 . Oxl ～。在 4℃， 一2 0℃和液氮( 一1 9 7℃) 中，各保

    存5 个样品， 每个样品 1 m l 。存八方法为直接投入法， 解冻在 2 6℃水浴中进行，1 0r ai n 。每 隔 一

    定时间取保存样品测 T C I D ~ o ， 结果见表 1 。

    表 1 病虫血 淋巴在不同温度条件下保存对病毒活性的影响

    保 存 温 度 4 ℃ 一加℃ 液 氨

    保存 时间 d 1 5 3 o 6 0 3 o 6 0 1 加 l 8 o 3 1 ) 6 0 1 加

    Ⅱ · I I d 一 5 . 6 B 5 . 7 5 3 . 5 0 5 . 5 o 5 . 1 7 4商 4 . 3 8 5 . 8 3 5 . 5 o 4 . 盯

    以 1 c 【 D ∞ 对时间作图表示如图 1 。

    B

    0 3 O 6 0 9 0 J 2 0 1 5 0 J 8 0 Ti m~d

    A. 4℃保存， B. 2 0℃保存， c 液氮保存

    图 1 病虫血淋巴滴度与时间的关系

    0

    I gTCI Ds o

    图 2 细胞感染物病 毒滴度与培养时间关系

    7 6 5 4 3 2

    8 7 6 l ^ 4 3

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    结果表明 ......