紫草愈伤组织培养中紫草素形成的影响因素

    严海燕, 曹日强 (南京大学 生物系, 江苏 南京 210008)

    摘要: 采用两阶段培养法研究不同培养基、激素的种类、浓度和各种营养成分对愈伤组织生长

    及紫草素形成的影响。结果表明 , 改良B5 培养基为适宜的营养生长培养基。细胞分裂素和生长

    素均为紫草素形成所必需的。62BA 110 mg· L - 1

    , IAA 011 mg· L - 1

    为较佳配比。生长培养基中

    CaCl2 浓度为 250 mg· L - 1

    , MgSO4 为 500 mg· L - 1

    时 , 愈伤组织生长和紫草素形成均较佳。紫草

    素形成培养基中 CuSO4 为 M9 浓度的 3 倍时 , 紫草素产量较高。紫草素形成培养基中添加 VB2

    及更高的 FeSO4 对紫草素产量的提高没有效果。研究过程中优化了紫草细胞培养形成紫草素的

    方法 , 为建立完整的组培生产紫草素体系提供了基础数据。

    关键词: 硬紫草; 紫草素; 细胞培养

    中图分类号: S567 文献标识码: A 文章编号:1000 - 7091 (2002) 02 - 0116 - 05

    紫草素及其衍生物具有抗菌、抗病毒、抗真菌、抗肿瘤、解热、消炎等生理作用 , 可治

    疗多种疾病 , 如烫伤、痔疮、肝炎、过敏性紫癜、秃疮、虫伤、湿疹、皮炎〔 1〕等等; 还可

    用作化妆品 , 如口红的原料; 我国古代用之染丝绸。天然紫草资源有限 , 生长周期长达几

    年。利用组织培养技术由紫草细胞直接生产紫草素 , 周期短 , 产量高 , 国外已经实现工业化

    生产。国内工业化生产依然存在许多问题 , 如产量不稳定等。这些问题需要通过研究组织培

    养中细胞生长发育与紫草素形成及其代谢机理 , 以及各种因子在这些过程中的作用来解决。

    我们在建立紫草愈伤组织培养紫草素生产体系的同时 , 对培养基种类、各种激素等因子进行

    了研究 , 以期提供一些参考。

    1 材料和方法

    材料: 硬紫草( L i thospermum erythrorizon)采自山东 , 取茎尖诱导愈伤组织。

    方法: 愈伤组织诱导培养基为LS + IAA 015 mg· L - 1

    + 2 , 42D 0135 mg· L - 1。

    紫草素生产采用两步法: 营养生长阶段和紫草素形成阶段。除了进行培养基种类的对比

    实验外 , 营养生长阶段采用改良 B5 培养基 , 其中 KNO3 为 3 000 mg· L - 1

    , MgSO4 为 500

    mg· L - 1。紫草素形成阶段采用改良 M9 培养基 , 其钙盐减半。M9 培养基来自 Fujita 等人的

    方法〔 2〕。在此基础上调节激素及各无机元素的含量。所有培养物都在含有 30 mL 培养基的

    100 mL 三角瓶中 , 25 ℃下培养 , 接种量均为 2 g。营养生长在光下进行 , 紫草素形成在暗

    中进行。所有处理为 3 个重复。

    收稿日期: 2001 - 10 - 11

    基金项目: 国家基金委七五攻关项目(39570018)

    作者简介: 严海燕(1961 - ) ,女, 博士, 副教授, 主要从事植物基因工程方面的研究。现在郑州大学生物工程系工作。

    华北农学报2002 ,17 (2) :116～120

    Acta Agriculturae Boreali - Sinica

    ? 1995-2005 Tsinghua Tongfang Optical Disc Co., Ltd. All rights reserved. 紫草素含量测定: 材料在 60 ℃下烘干 , 研磨 , 用石油醚反复提取至无色。提取液在

    520 nm下测光吸收。之后在标准曲线上查出浓度 , 求出材料的紫草素含量(g g) 。

    2 结果与分析

    211 培养基种类对愈伤组织生长及紫草素形成的影响

    用不同培养基对硬紫草愈伤组织进行培养 , 结果发现在改良B5 培养基中 , 愈伤组织呈

    白色带微绿 , 有类似甘草气味 , 生长最旺盛 , 持续继代也一直保持旺盛的生长 , 将愈伤组织

    转入紫草素形成培养基后 , 紫草素形成效果较好; 在LS , MS , White 培养基中 , 愈伤组织

    呈白色透明 , 松软易散 , 多次继代后不易成活。而紫草素形成培养基中 , M9 效果最好 , 但

    愈伤组织生长较差(表 1) 。所以 , 我们选择改良B5 作为生长培养基 , M9 作为紫草素形成培

    养基。

    表 1 不同培养基中愈伤组织的生长及紫草素形成

    培养基 改良B5 LS MS White M9

    愈伤生长状况 旺盛 良 良 良 较差

    紫草素形成情况 极少 无 无 较少 大部分红

    继代效果 佳 不良 不良

    212 M9 培养基中细胞分裂素对紫草素形成的影响

    在含有 011 mg· L - 1

    IAA 的 M9 培

    养基 , 添加不同浓度 KT或BA 对紫草

    素形成的影响如表 2 所示。

    BA 在浓度为 015 和 1 mg· L - 1

    时 ,紫草素产量较高 , 当 BA 浓度高于 115

    mg· L - 1

    时紫草素形成量减少。而 KT

    为315 mg· L - 1

    时紫草素的产量高于较

    低浓度处理 , 类似于BA 015 mg· L - 1

    时

    的紫草素形成量。在低浓度下 , BA 对

    紫草素形成的促进作用好于 KT (表 2 ,图1) 。可见细胞分裂素对紫草素的形

    成具有显著的促进作用(图 1) 。

    213 M9 中生长素种类及浓度对紫草

    素形成的影响

    图1 的结果还表明 , IAA 在一定范

    围内对紫草素的形成有促进作用 ......