摸索新途径 提高靶向性——脂质体与配体偶联方法一览
脂质体最早是在1965年被英国学者Bangham等作为研究生物膜的模型提出的。它是由脂质双分子层组成，内部为水相的闭合囊泡。脂质体的大小从几十纳米到几十微米，在脂质体的水相和膜内可以包裹多种物质。脂质体一经发现，就引起了生物学家、药学家的兴趣。人们开始应用脂质体作为药物的载体控制药物的释放，提高药物靶向性，以减少药物的毒副作用，提高药物疗效。目前，脂质体的研究主要集中在四个领域：模拟膜的研究；药物的可控释放和体内的靶向给药；皮肤及化妆品等日用工业品的基质；基因及其他生理活性物质向细胞内的转运。
脂质体的靶向性分为主动靶向、被动靶向和物理化学靶向三种。其中，主动靶向是修饰脂质体如微粒与配体(如单克隆抗体、缩氨酸、蛋白质等)偶联，以提高药物微粒的靶向性和与靶组织的结合亲和力，增加药物在靶组织中的沉积量。目前，脂质体与配体偶联的方法较多，科研人员也在不断加以改进，以提高药物的靶向性。
非共价偶联方法尚存不足
, 百拇医药
配体与脂质体偶联主要有两种方式：共价键与非共价键偶联。其中，直接将配体加到磷脂中，通过混合制备脂质体的方法称为非共价偶联法。它具有不需偶联剂、制备简单的优点，但配体与脂质体的结合率相对较低(4%~40%)，脂质体容易发生聚集，难以控制配体在脂质体上的数量、分布以及配体结合位点等，且配体与脂质体易分离。将半抗原与配体结合可提高配体与脂质体的结合率，但仍未解决脂质体与配体结合力弱、配体在脂质体表面随机分布等问题。
共价偶联方法较为看好
而以共价键偶联的方法较为常用，即将脂质体上疏水基团与配体以共价键结合。常用的疏水基团供体有长链脂肪酸(如棕榈酸)和磷脂[如磷脂酰乙醇胺(PE)和磷脂酰纤维醇(PI)]。配体与脂质体共价偶联的方法有两种：配体与偶联剂反应，再与脂质体反应，形成配体修饰脂质体；偶联剂与脂质体反应，再与配体反应，将配体连接到脂质体表面。
▲配体胫侍逡粤蛎鸭剂?br> 蛋白质中常含有巯基，巯基可与偶联剂顺丁烯二酰亚胺形成稳定的硫醚键，借此蛋白质配体与脂质体偶联。但有些蛋白质上巯基缺乏或数量不足，需进行修饰，以增加巯基的数量。N-羟基琥珀酰亚胺3-(2-吡啶二硫代基)丙酸酯(SPDP)和琥珀酰亚胺-S-乙酰基硫代乙酸酯(SATA)便是常被用于增加巯基的化合物，它们含有一个伯氨基和被保护的巯基，其伯氨基先与配体蛋白质结合后，采用二硫代苏糖醇(DTT)或其他还原剂将被保护的巯基转化成巯基，再与顺丁烯二酰亚胺反应，形成硫醚键，使蛋白质配体偶联到脂质体上。国外研究人员采用半胱氨酸修饰scFv抗体，增加配体的巯基，经顺丁烯二酰亚胺与脂质体偶联，形成scFv抗体修饰免疫脂质体，可与肿瘤组织产生的ED-B纤维结合蛋白特异性结合。
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▲配体与脂质体以二硫键偶联
配体与脂质体以二硫键偶联是较容易的方法，但二硫键在血液中易被还原，使配体与脂质体又分解。为了使配体与脂质体形成稳定的二硫键偶联，可增加配体上的巯基，以此来增加二硫键，提高配体与脂质体偶联的稳定性。增加配体巯基的方法可将原有的二硫键还原成巯基或通过SATA、SPDP在配体上引入巯基。配体上的巯基与脂质体上的磷脂酰乙醇胺-吡啶二硫代丙酰胺(PE-PDP)偶联剂反应，即可形成配体-脂质体的二硫键偶联。国外研究人员采用该技术成功地将单克隆抗体[抗-GD(2)]Fab’片段与阿霉素脂质体通过二硫键偶联，制成的配体-脂质体具有人成神经管细胞瘤靶向性。
▲配体伯胺与脂质体羧酸交叉偶联
配体上的伯胺可通过与脂质体上偶联剂末端的羧基反应形成酰胺键偶联。脂质体上偶联剂末端的羧基先与1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)碳二酰亚胺(EDAC)反应，再与配体上的伯胺反应形成酰胺键。常用的偶联剂为二硬脂酸-N-[羧基丙酰基-(聚乙烯乙二醇)-琥珀酰]磷脂酰乙醇胺(DSPE-PEG-COOH)，其末端羧基有一定长度，空间位阻小，易与配体反应，且可避免配体变性而丧失抗原特异性。国外人员采用该方法制备的铁传递蛋白(TF)-脂质体可与小鼠结肠癌细胞靶向结合，并在受体介导下被有效内吞。另外，有人采用N-戊二基磷脂酰乙醇胺(NGPE)制备抗肌浆球蛋白抗体(AM)Fab’-脂质体，Fab’片段与脂质体的结合率为65%~75%，体内实验表明，AMFab’-脂质体可选择性地沉积在血管梗死的心肌细胞上。
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▲配体与脂质体羧基酯化偶联
配体上的羟基可与脂质体聚乙二醇(PEG)衍生物链末端羧基通过酯化偶联。国内科研人员将末端带羧基的二棕榈酰磷脂酰乙醇胺(DPPE)PEG衍生物(DPPE-PEG3000-COOH)结合于脂质体中，制成长循环脂质体，再通过其羧基与配体上羟基的酯化作用，将膀胱癌单克隆抗体BDI-1或小鼠免疫球蛋白G(IgG)与脂质体表面偶联，制成免疫脂质体。体外靶细胞杀伤活性检测和小鼠组织分布试验表明，该免疫脂质体可选择性杀伤人膀胱癌细胞EJ，减少脂质体在肝、脾中的分布，延长血中滞留时间。
▲配体与脂质体以腙键偶联
配体上的醛基可通过与脂质体上酰肼基反应以腙键偶联到脂质体表面。为了避免配体失去免疫活性，可采用半乳糖氧化酶或高碘酸在温和的条件下，将配体即免疫球蛋白长链上特定区域的糖基氧化成醛基，直接与脂质体上的月桂酸酰肼反应，形成立体稳定的靶向脂质体。国外有人采用该方法制备了含抗癌前药5-氟-2’-去氧尿嘧啶的大鼠结肠腺癌单克隆抗体(抗-CC531)免疫脂质体。它可选择性地转运到癌细胞表面，并内吞入溶菌酶间质。
, 百拇医药
▲抗生物素蛋白-生物素配体与脂质体偶联
抗生物素蛋白-生物素技术是制备药物配体靶向制剂的一个非常有用的方法，它可分步将抗生物素蛋白和生物素偶联到脂质体上。偶联后的抗生物素蛋白或生物素抗体仍具有免疫活性，且在短时间内不被吞噬，能多途径与靶细胞结合，增加靶向性。有研究人员首先制备了含生物素-氨基-乙酰基双十六酰基磷脂酰乙醇胺的脂质体，然后分别与生物素CA-125(CancerAntigen125)抗体和生物素蛋白链菌素抗体偶联，形成免疫脂质体。体外实验表明，它可选择性地结合到高表达CA-125抗原的OVCAR-3细胞上。
在过去的几十年，靶向脂质体的研究成为先进递药技术的热点。无论从活性基团的选择、修饰方法的发明、靶向作用的检测，还是体内药代、药效研究和临床应用都取得了非常可喜的成绩，特别是对于基因药物制剂有着其他方法不可替代的优点。可以预见，经过人们的不断努力和探索，将来一定可以做到定点、定时、定量控释给药，为临床治疗不同疾病提供更好的选择。
(张亚红 朱照静), 百拇医药(张亚红；朱照静)
脂质体的靶向性分为主动靶向、被动靶向和物理化学靶向三种。其中，主动靶向是修饰脂质体如微粒与配体(如单克隆抗体、缩氨酸、蛋白质等)偶联，以提高药物微粒的靶向性和与靶组织的结合亲和力，增加药物在靶组织中的沉积量。目前，脂质体与配体偶联的方法较多，科研人员也在不断加以改进，以提高药物的靶向性。
非共价偶联方法尚存不足
, 百拇医药
配体与脂质体偶联主要有两种方式：共价键与非共价键偶联。其中，直接将配体加到磷脂中，通过混合制备脂质体的方法称为非共价偶联法。它具有不需偶联剂、制备简单的优点，但配体与脂质体的结合率相对较低(4%~40%)，脂质体容易发生聚集，难以控制配体在脂质体上的数量、分布以及配体结合位点等，且配体与脂质体易分离。将半抗原与配体结合可提高配体与脂质体的结合率，但仍未解决脂质体与配体结合力弱、配体在脂质体表面随机分布等问题。
共价偶联方法较为看好
而以共价键偶联的方法较为常用，即将脂质体上疏水基团与配体以共价键结合。常用的疏水基团供体有长链脂肪酸(如棕榈酸)和磷脂[如磷脂酰乙醇胺(PE)和磷脂酰纤维醇(PI)]。配体与脂质体共价偶联的方法有两种：配体与偶联剂反应，再与脂质体反应，形成配体修饰脂质体；偶联剂与脂质体反应，再与配体反应，将配体连接到脂质体表面。
▲配体胫侍逡粤蛎鸭剂?br> 蛋白质中常含有巯基，巯基可与偶联剂顺丁烯二酰亚胺形成稳定的硫醚键，借此蛋白质配体与脂质体偶联。但有些蛋白质上巯基缺乏或数量不足，需进行修饰，以增加巯基的数量。N-羟基琥珀酰亚胺3-(2-吡啶二硫代基)丙酸酯(SPDP)和琥珀酰亚胺-S-乙酰基硫代乙酸酯(SATA)便是常被用于增加巯基的化合物，它们含有一个伯氨基和被保护的巯基，其伯氨基先与配体蛋白质结合后，采用二硫代苏糖醇(DTT)或其他还原剂将被保护的巯基转化成巯基，再与顺丁烯二酰亚胺反应，形成硫醚键，使蛋白质配体偶联到脂质体上。国外研究人员采用半胱氨酸修饰scFv抗体，增加配体的巯基，经顺丁烯二酰亚胺与脂质体偶联，形成scFv抗体修饰免疫脂质体，可与肿瘤组织产生的ED-B纤维结合蛋白特异性结合。
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▲配体与脂质体以二硫键偶联
配体与脂质体以二硫键偶联是较容易的方法，但二硫键在血液中易被还原，使配体与脂质体又分解。为了使配体与脂质体形成稳定的二硫键偶联，可增加配体上的巯基，以此来增加二硫键，提高配体与脂质体偶联的稳定性。增加配体巯基的方法可将原有的二硫键还原成巯基或通过SATA、SPDP在配体上引入巯基。配体上的巯基与脂质体上的磷脂酰乙醇胺-吡啶二硫代丙酰胺(PE-PDP)偶联剂反应，即可形成配体-脂质体的二硫键偶联。国外研究人员采用该技术成功地将单克隆抗体[抗-GD(2)]Fab’片段与阿霉素脂质体通过二硫键偶联，制成的配体-脂质体具有人成神经管细胞瘤靶向性。
▲配体伯胺与脂质体羧酸交叉偶联
配体上的伯胺可通过与脂质体上偶联剂末端的羧基反应形成酰胺键偶联。脂质体上偶联剂末端的羧基先与1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)碳二酰亚胺(EDAC)反应，再与配体上的伯胺反应形成酰胺键。常用的偶联剂为二硬脂酸-N-[羧基丙酰基-(聚乙烯乙二醇)-琥珀酰]磷脂酰乙醇胺(DSPE-PEG-COOH)，其末端羧基有一定长度，空间位阻小，易与配体反应，且可避免配体变性而丧失抗原特异性。国外人员采用该方法制备的铁传递蛋白(TF)-脂质体可与小鼠结肠癌细胞靶向结合，并在受体介导下被有效内吞。另外，有人采用N-戊二基磷脂酰乙醇胺(NGPE)制备抗肌浆球蛋白抗体(AM)Fab’-脂质体，Fab’片段与脂质体的结合率为65%~75%，体内实验表明，AMFab’-脂质体可选择性地沉积在血管梗死的心肌细胞上。
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▲配体与脂质体羧基酯化偶联
配体上的羟基可与脂质体聚乙二醇(PEG)衍生物链末端羧基通过酯化偶联。国内科研人员将末端带羧基的二棕榈酰磷脂酰乙醇胺(DPPE)PEG衍生物(DPPE-PEG3000-COOH)结合于脂质体中，制成长循环脂质体，再通过其羧基与配体上羟基的酯化作用，将膀胱癌单克隆抗体BDI-1或小鼠免疫球蛋白G(IgG)与脂质体表面偶联，制成免疫脂质体。体外靶细胞杀伤活性检测和小鼠组织分布试验表明，该免疫脂质体可选择性杀伤人膀胱癌细胞EJ，减少脂质体在肝、脾中的分布，延长血中滞留时间。
▲配体与脂质体以腙键偶联
配体上的醛基可通过与脂质体上酰肼基反应以腙键偶联到脂质体表面。为了避免配体失去免疫活性，可采用半乳糖氧化酶或高碘酸在温和的条件下，将配体即免疫球蛋白长链上特定区域的糖基氧化成醛基，直接与脂质体上的月桂酸酰肼反应，形成立体稳定的靶向脂质体。国外有人采用该方法制备了含抗癌前药5-氟-2’-去氧尿嘧啶的大鼠结肠腺癌单克隆抗体(抗-CC531)免疫脂质体。它可选择性地转运到癌细胞表面，并内吞入溶菌酶间质。
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▲抗生物素蛋白-生物素配体与脂质体偶联
抗生物素蛋白-生物素技术是制备药物配体靶向制剂的一个非常有用的方法，它可分步将抗生物素蛋白和生物素偶联到脂质体上。偶联后的抗生物素蛋白或生物素抗体仍具有免疫活性，且在短时间内不被吞噬，能多途径与靶细胞结合，增加靶向性。有研究人员首先制备了含生物素-氨基-乙酰基双十六酰基磷脂酰乙醇胺的脂质体，然后分别与生物素CA-125(CancerAntigen125)抗体和生物素蛋白链菌素抗体偶联，形成免疫脂质体。体外实验表明，它可选择性地结合到高表达CA-125抗原的OVCAR-3细胞上。
在过去的几十年，靶向脂质体的研究成为先进递药技术的热点。无论从活性基团的选择、修饰方法的发明、靶向作用的检测，还是体内药代、药效研究和临床应用都取得了非常可喜的成绩，特别是对于基因药物制剂有着其他方法不可替代的优点。可以预见，经过人们的不断努力和探索，将来一定可以做到定点、定时、定量控释给药，为临床治疗不同疾病提供更好的选择。
(张亚红 朱照静), 百拇医药(张亚红；朱照静)