大鼠β细胞素基因的克隆及其在大肠杆菌中的表达
Cloning of rat betacellulin gene and its expression in E.coli
AN JiaZe, SONG ZhenShun, DOU KeFeng, LI KaiZong, HAN Hua
1Department of Hepatobiliary Surgery, Xijing Hospital, 2Department of Medical Genetics and Developmental Biology, School of Basic Medicine, Fourth Military Medical University, Xi’an 710033, China
【Abstract】 AIM: To obtain large amount of rat betacellulin so as to explore the function of the protein and prepare the antibody against this protein. METHODS: A 544 bp of rat betacellulin gene fragment was amplified by PCR method from rat kidney and cloned into pET28a(+)vector, an E.coli expression vector, to construct a recombinant plasmid pET28arBTC. The plasmid was transformed into E.coli BL21 (DE3) and induced to express betacellulin with IPTG. The expression of betacellulin was detected by SDSPAGE electrophoresis and Western blot. RESULTS: A novel protein with expected molecular weight was expressed upon induction with IPTG. The expressed product showed good reactivity to antiHis tag antibody, and was most in inclusion body sections. CONCLUSION: Cloning and expression of betacellulin gene lay a basis for the further study on the function of this protein and pancreatic stem cell differentiation.
【Keywords】 Betacellulin; gene clone; gene expression, pET vector
【摘要】 目的: 获得大量重组大鼠β细胞素(BTC)，为研究β细胞素的功能及制备其抗体奠定基础. 方法: 利用PCR方法从大鼠肾组织扩增出544 bp的β细胞素基因片段并按读框克隆到原核表达载体pET28a(+)上，得到重组质粒pET28arBTC,转化大肠杆菌BL21(DE3)菌株，IPTG诱导β细胞素蛋白表达，SDSPAGE 和Western blot检测. 结果: 经IPTG诱导后，有明显的目的蛋白表达，分子量符合β细胞素；表达的蛋白主要以包涵体形式存在；表达量约占菌体蛋白总量的20%~30%；目的蛋白与抗His标签抗体具有良好的反应原性. 结论: 大鼠β细胞素基因的克隆与表达为进一步开展β细胞素蛋白功能和胰腺干细胞的研究奠定了基础.
【关键词】 β细胞素；基因克隆; 基因表达；pET载体
0引言
β细胞素(betacellulin, BTC)是表皮细胞生长因子家族成员之一，在多器官系统的正常发育过程中起重要作用，尤其高表达于胰腺组织中，提示β细胞素可能在胰腺发育和胰腺干细胞的分化中发挥重要作用. 我们利用基因工程技术克隆了β细胞素基因，并利用pET原核系统进行高效表达，为进一步开展β细胞素蛋白功能和胰腺干细胞分化的研究奠定了基础.
1材料和方法
1.1材料
T载体PMD18T (Takara公司); pET28a(+)(Novagen产品); 大肠杆菌BL21及XL10(第四军医大学医学遗传学与发育生物学教研室提供); 限制性内切酶、Solution I，标准分子量DNA，蛋白质Marker，PCR试剂盒，IPTG等(Takara公司); 质粒纯化、DNA回收试剂盒(华舜公司); Hybond ECL硝酸纤维膜(Pharmacia公司产品); ECL发光试剂(PIERCE公司).
1.2方法
1.2.1β细胞素基因的扩增及序列测定①引物设计合成：根据GenBank中大鼠β细胞素基因序列，设计引物，上游引物序列为：5′ACACAGCACGGTTGATGG3′(18 bp)，下游引物：5′CCAGCTTGTGGTAACTTTAT3′(20 bp)，其中上、下游引物的5′端分别引入EcoR I和Sal I酶切位点. ②目的基因的扩增及序列测定：应用PCR试剂盒扩增目的基因，总反应体积为50 μL，循环参数为：95℃ 4 min; 95℃ 30 s, 55℃ 30 s, 72℃ 1 min，35个循环，再于72℃延伸7 min. ③目的基因的序列测定：将PCR扩增产物克隆入载体pMD18T中, 构建pMD18TrBTC，酶切鉴定正确后，交由上海生工公司进行DNA序列测定.
1.2.2β细胞素原核表达载体的构建以EcoR I和Sal I双酶切经测序正确的PMD18TrBTC，获取β细胞素基因. 以EcoR I和Sal I双酶切pET28a(+)载体，分别回收β细胞素基因和pET28a(+)载体片段，Solution I连接上述基因和载体片段，构建β细胞素原核表达载体pET28(a+)rBTC，转化E.coli XL10感受态细胞，用含卡那霉素的LB平板筛选阳性克隆，小量提取质粒并酶切鉴定.
1.2.3β细胞素的原核表达及检测以β细胞素原核表达载体pET28(a+)rBTC转化E.coli BL21感受态细胞，挑取用含卡那霉素的LB平板筛选的阳性克隆于LB培养基中，37℃振摇过夜，按1∶100转接到LB培养基2 mL中，37℃振摇约3 h，使A600 nm约0.6(0.4~1.0)，加入终浓度0.5 mmol/L的IPTG继续培养诱导3 h. 于4℃离心15 000 g×1 min，收集菌体并裂解，4℃离心15 000 g×10 min，分别取上清及沉淀(包涵体)，进行SDSPAGE 和Western blot检测.
2结果
2.1β细胞素基因的扩增、克隆及序列测定β细胞素基因的PCR产物10 g/L琼脂糖凝胶电泳可见544 bp特异性条带(Fig 1)，回收片段后插入pMD18T，形成pMD18TrBTC，酶切鉴定得到正确克隆，以M13+/M13-为引物进行序列测定. 测序结果与GenBank中大鼠β细胞素基因序列比对无突变.
2.2大鼠β细胞素原核表达载体pET28arBTC构建用EcoR I和Sal I双酶切pMD18TrBTC，回收片段后与经过相同酶切的pET28a(+)片断连接，转化E.coli XL10感受态细胞，用含卡那霉素的LB平板筛选阳性克隆，挑单克隆扩增小量提取质粒并酶切鉴定. EcoR I和Sal I双酶切得到的片段，与预期的大小一致.
2.3pET28arBTC的原核表达及鉴定将原核表达载体pET28arBTC转化到E.coli BL21感受态细胞中，经IPTG诱导后，可见Mr为20 000的融合蛋白，主要以包涵体形式表达. 以antiHis一抗做Western blot，可检测到表达的融合蛋白(Fig 2,3).
3讨论
干细胞的发育受多种内在机制和微环境因素的影响. 在干细胞的分化过程中，细胞因子发挥了重要作用. β细胞素可能参与了胰腺的发育和胰腺干细胞的分化等过程[1].
β细胞素不仅具有多种生物学功能，如促进各种正常细胞和肿瘤细胞的增殖，而且能够将胰腺分泌淀粉酶的细胞转变为胰岛素分泌细胞[2,3]. 有研究表明，将大鼠胰腺切除90%后，立即给大鼠尾静脉注射β细胞素(0.5 μg/g)，10 d后大鼠糖尿病状态有所缓解，β细胞素治疗组大鼠血糖水平显著低于对照组，而血浆胰岛素水平显著高于非治疗组，持续时间长达4 wk，治疗30 d后病理学检查证实β细胞素组大鼠胰岛β细胞团较对照组的大，胰岛样细胞团的数目明显增多，糖耐量试验表明β细胞素治疗的大鼠对糖刺激有很好的反应性[4]；用链脲霉素制成的糖尿病小鼠注射β细胞素后，也取得了同样的效果[5]，由此可以推断，β细胞素可能促进了β细胞的增殖或者是促进了胰腺干细胞增殖分化为β细胞，分泌胰岛素达到降低血糖的作用.
β细胞素的多重生物学作用日益引起人们的重视，它作为信号分子在组织器官的发育、干细胞的增殖与分化以及在肿瘤的发生发展中的作用都有待研究，我们完成了大鼠β细胞素的基因克隆并成功地构建β细胞素的原核表达载体，通过Western blot证实能够在大肠杆菌中表达. 为进一步研究其功能以及在胰腺干细胞分化中的作用机制奠定了基础.
【参考文献】
[1] Dunbar AJ, Goddard C. Structurefunction and biological role of betacellulin[J]. Int J Biochem Cell Biol, 2000;32(8):805-815.
[2] Li L, Yi Z, Seno M, et al. Activin A and betacellulin: Effect on regeneration of pancreatic betacells in neonatal streptozotocintreated rats[J]. Diabetes, 2004;53(3):608-615.
[3] Yamamoto T, Akisue T, Marui T, et al. Expression of betacellulin, heparinbinding epidermal growth factor and epiregulin in human malignant fibrous histiocytoma[J]. Anticancer Res, 2004;24(3b):2007-2010.
[4] Li L, Seno M, Yamada H, et al. Promotion of betacell regeneration by betacellulin in ninety percentpancreatectomized rats[J]. Endocrinology, 2001;142(12):5379-5385.
[5] Li L, Seno M, Yamada H, et al. Betacellulin improves glucose metabolism by promoting conversion of intraislet precursor cells to betacells in streptozotocintreated mice[J]. Am J Physiol Endocrinol Metab, 2003;285(3):E577-E583.
基金项目：国家自然科学基金(434516276)
通讯作者：宋振顺. Tel.(029)83373564 Email.zhenshunsong@yahoo.com.cn
作者简介：安家泽(1968)，男(汉族)，山西省河津市人. 博士生(导师李开宗)，主治医师，讲师. Tel.(029)83375259Email.anchen@fmmu.edu.cn
(第四军医大学：1西京医院肝胆外科，2基础部医学遗传学与发育生物学教研室，陕西 西安 710033)
编辑袁天峰, 百拇医药(安家泽，宋振顺，窦科峰，李开宗，韩骅)
AN JiaZe, SONG ZhenShun, DOU KeFeng, LI KaiZong, HAN Hua
1Department of Hepatobiliary Surgery, Xijing Hospital, 2Department of Medical Genetics and Developmental Biology, School of Basic Medicine, Fourth Military Medical University, Xi’an 710033, China
【Abstract】 AIM: To obtain large amount of rat betacellulin so as to explore the function of the protein and prepare the antibody against this protein. METHODS: A 544 bp of rat betacellulin gene fragment was amplified by PCR method from rat kidney and cloned into pET28a(+)vector, an E.coli expression vector, to construct a recombinant plasmid pET28arBTC. The plasmid was transformed into E.coli BL21 (DE3) and induced to express betacellulin with IPTG. The expression of betacellulin was detected by SDSPAGE electrophoresis and Western blot. RESULTS: A novel protein with expected molecular weight was expressed upon induction with IPTG. The expressed product showed good reactivity to antiHis tag antibody, and was most in inclusion body sections. CONCLUSION: Cloning and expression of betacellulin gene lay a basis for the further study on the function of this protein and pancreatic stem cell differentiation.
【Keywords】 Betacellulin; gene clone; gene expression, pET vector
【摘要】 目的: 获得大量重组大鼠β细胞素(BTC)，为研究β细胞素的功能及制备其抗体奠定基础. 方法: 利用PCR方法从大鼠肾组织扩增出544 bp的β细胞素基因片段并按读框克隆到原核表达载体pET28a(+)上，得到重组质粒pET28arBTC,转化大肠杆菌BL21(DE3)菌株，IPTG诱导β细胞素蛋白表达，SDSPAGE 和Western blot检测. 结果: 经IPTG诱导后，有明显的目的蛋白表达，分子量符合β细胞素；表达的蛋白主要以包涵体形式存在；表达量约占菌体蛋白总量的20%~30%；目的蛋白与抗His标签抗体具有良好的反应原性. 结论: 大鼠β细胞素基因的克隆与表达为进一步开展β细胞素蛋白功能和胰腺干细胞的研究奠定了基础.
【关键词】 β细胞素；基因克隆; 基因表达；pET载体
0引言
β细胞素(betacellulin, BTC)是表皮细胞生长因子家族成员之一，在多器官系统的正常发育过程中起重要作用，尤其高表达于胰腺组织中，提示β细胞素可能在胰腺发育和胰腺干细胞的分化中发挥重要作用. 我们利用基因工程技术克隆了β细胞素基因，并利用pET原核系统进行高效表达，为进一步开展β细胞素蛋白功能和胰腺干细胞分化的研究奠定了基础.
1材料和方法
1.1材料
T载体PMD18T (Takara公司); pET28a(+)(Novagen产品); 大肠杆菌BL21及XL10(第四军医大学医学遗传学与发育生物学教研室提供); 限制性内切酶、Solution I，标准分子量DNA，蛋白质Marker，PCR试剂盒，IPTG等(Takara公司); 质粒纯化、DNA回收试剂盒(华舜公司); Hybond ECL硝酸纤维膜(Pharmacia公司产品); ECL发光试剂(PIERCE公司).
1.2方法
1.2.1β细胞素基因的扩增及序列测定①引物设计合成：根据GenBank中大鼠β细胞素基因序列，设计引物，上游引物序列为：5′ACACAGCACGGTTGATGG3′(18 bp)，下游引物：5′CCAGCTTGTGGTAACTTTAT3′(20 bp)，其中上、下游引物的5′端分别引入EcoR I和Sal I酶切位点. ②目的基因的扩增及序列测定：应用PCR试剂盒扩增目的基因，总反应体积为50 μL，循环参数为：95℃ 4 min; 95℃ 30 s, 55℃ 30 s, 72℃ 1 min，35个循环，再于72℃延伸7 min. ③目的基因的序列测定：将PCR扩增产物克隆入载体pMD18T中, 构建pMD18TrBTC，酶切鉴定正确后，交由上海生工公司进行DNA序列测定.
1.2.2β细胞素原核表达载体的构建以EcoR I和Sal I双酶切经测序正确的PMD18TrBTC，获取β细胞素基因. 以EcoR I和Sal I双酶切pET28a(+)载体，分别回收β细胞素基因和pET28a(+)载体片段，Solution I连接上述基因和载体片段，构建β细胞素原核表达载体pET28(a+)rBTC，转化E.coli XL10感受态细胞，用含卡那霉素的LB平板筛选阳性克隆，小量提取质粒并酶切鉴定.
1.2.3β细胞素的原核表达及检测以β细胞素原核表达载体pET28(a+)rBTC转化E.coli BL21感受态细胞，挑取用含卡那霉素的LB平板筛选的阳性克隆于LB培养基中，37℃振摇过夜，按1∶100转接到LB培养基2 mL中，37℃振摇约3 h，使A600 nm约0.6(0.4~1.0)，加入终浓度0.5 mmol/L的IPTG继续培养诱导3 h. 于4℃离心15 000 g×1 min，收集菌体并裂解，4℃离心15 000 g×10 min，分别取上清及沉淀(包涵体)，进行SDSPAGE 和Western blot检测.
2结果
2.1β细胞素基因的扩增、克隆及序列测定β细胞素基因的PCR产物10 g/L琼脂糖凝胶电泳可见544 bp特异性条带(Fig 1)，回收片段后插入pMD18T，形成pMD18TrBTC，酶切鉴定得到正确克隆，以M13+/M13-为引物进行序列测定. 测序结果与GenBank中大鼠β细胞素基因序列比对无突变.
2.2大鼠β细胞素原核表达载体pET28arBTC构建用EcoR I和Sal I双酶切pMD18TrBTC，回收片段后与经过相同酶切的pET28a(+)片断连接，转化E.coli XL10感受态细胞，用含卡那霉素的LB平板筛选阳性克隆，挑单克隆扩增小量提取质粒并酶切鉴定. EcoR I和Sal I双酶切得到的片段，与预期的大小一致.
2.3pET28arBTC的原核表达及鉴定将原核表达载体pET28arBTC转化到E.coli BL21感受态细胞中，经IPTG诱导后，可见Mr为20 000的融合蛋白，主要以包涵体形式表达. 以antiHis一抗做Western blot，可检测到表达的融合蛋白(Fig 2,3).
3讨论
干细胞的发育受多种内在机制和微环境因素的影响. 在干细胞的分化过程中，细胞因子发挥了重要作用. β细胞素可能参与了胰腺的发育和胰腺干细胞的分化等过程[1].
β细胞素不仅具有多种生物学功能，如促进各种正常细胞和肿瘤细胞的增殖，而且能够将胰腺分泌淀粉酶的细胞转变为胰岛素分泌细胞[2,3]. 有研究表明，将大鼠胰腺切除90%后，立即给大鼠尾静脉注射β细胞素(0.5 μg/g)，10 d后大鼠糖尿病状态有所缓解，β细胞素治疗组大鼠血糖水平显著低于对照组，而血浆胰岛素水平显著高于非治疗组，持续时间长达4 wk，治疗30 d后病理学检查证实β细胞素组大鼠胰岛β细胞团较对照组的大，胰岛样细胞团的数目明显增多，糖耐量试验表明β细胞素治疗的大鼠对糖刺激有很好的反应性[4]；用链脲霉素制成的糖尿病小鼠注射β细胞素后，也取得了同样的效果[5]，由此可以推断，β细胞素可能促进了β细胞的增殖或者是促进了胰腺干细胞增殖分化为β细胞，分泌胰岛素达到降低血糖的作用.
β细胞素的多重生物学作用日益引起人们的重视，它作为信号分子在组织器官的发育、干细胞的增殖与分化以及在肿瘤的发生发展中的作用都有待研究，我们完成了大鼠β细胞素的基因克隆并成功地构建β细胞素的原核表达载体，通过Western blot证实能够在大肠杆菌中表达. 为进一步研究其功能以及在胰腺干细胞分化中的作用机制奠定了基础.
【参考文献】
[1] Dunbar AJ, Goddard C. Structurefunction and biological role of betacellulin[J]. Int J Biochem Cell Biol, 2000;32(8):805-815.
[2] Li L, Yi Z, Seno M, et al. Activin A and betacellulin: Effect on regeneration of pancreatic betacells in neonatal streptozotocintreated rats[J]. Diabetes, 2004;53(3):608-615.
[3] Yamamoto T, Akisue T, Marui T, et al. Expression of betacellulin, heparinbinding epidermal growth factor and epiregulin in human malignant fibrous histiocytoma[J]. Anticancer Res, 2004;24(3b):2007-2010.
[4] Li L, Seno M, Yamada H, et al. Promotion of betacell regeneration by betacellulin in ninety percentpancreatectomized rats[J]. Endocrinology, 2001;142(12):5379-5385.
[5] Li L, Seno M, Yamada H, et al. Betacellulin improves glucose metabolism by promoting conversion of intraislet precursor cells to betacells in streptozotocintreated mice[J]. Am J Physiol Endocrinol Metab, 2003;285(3):E577-E583.
基金项目：国家自然科学基金(434516276)
通讯作者：宋振顺. Tel.(029)83373564 Email.zhenshunsong@yahoo.com.cn
作者简介：安家泽(1968)，男(汉族)，山西省河津市人. 博士生(导师李开宗)，主治医师，讲师. Tel.(029)83375259Email.anchen@fmmu.edu.cn
(第四军医大学：1西京医院肝胆外科，2基础部医学遗传学与发育生物学教研室，陕西 西安 710033)
编辑袁天峰, 百拇医药(安家泽，宋振顺，窦科峰，李开宗，韩骅)