心脑梗死患者凝血因子XIIIA基因Val34Leu多态性及血浆水平
FXIIIA gene Val34Leu polymorphism and plasma FXIII level in patients with myocardial or brain infarction
DUAN BaoMin, LI XiaYun, LU JinTao, WANG WeiMin, LI Bing
Emergency Department, Kaifeng First People’s Hospital of Henan, Kaifeng 475000, China
【Abstract】 AIM: To explore the clinical significance of the polymorphism of coagulation factor XⅢ A subunit gene (Val 34/Leu), and FXⅢ antigen and activity in plasma of patients with myocardial infarction or brain infarction. METHODS: The plasma level of FXⅢ antigen in patients and the healthy controls were measured by sandwich enzyme linked immunosorbent assay and the activity of FXⅢ was detected by Biotinlabeled assay. Allelespecific PCR was used to detect the FXⅢA subunit genotypes. RESULTS: The frequency of Leu34 genotype in patients with myocardial or brain infarction was 0.018 and 0.029 respectively, a little higher than that of controls, but no difference was found between them (P>0.05). There was no difference in the activity of FXⅢ between different genotypes though it was slightly higher in patients with Leu34 variant than in patients with Val 34 variant. No difference was found in FXⅢA subunit gene, FXII antigen and its activity between the controls and patients with myocardial infarction or brain infarction. CONCLUSION: There is no definitely correlation between FXⅢA gene Val34Leu polymorphism, plasma FXⅢ level and myocardial or brain infarction.
【Keywords】 myocardial infarction; brain infarction; FXⅢ Val34/Leu polymorphism; FXⅢ antigen and activity
【摘要】 目的：探讨凝血因子FXIIIA基因Val34Leu多态性、血浆FXIII抗原及活性水平在心肌梗死与脑梗死患者中的临床意义. 方法：采用双抗体夹心ELISA法检测心肌梗死、脑梗死患者及健康对照者血浆FXIII抗原；生物素标记法检测血浆FXIII活性；等位基因特异PCR检测FXIIIA基因V34/L的基因型. 结果：心肌梗死组和脑梗死组FXIIIA基因Leu34基因频率分别为0.018和0.029，较健康人群偏高，但三组之间无显著差异(P>0.05)，且含Leu者的FXIII活性偏高，但与Val者无差异(P>0.05). 心肌梗死组和脑梗死组血浆FXIIIA亚基和B亚基抗原含量、FXIII活性与健康对照组比较无显著差异(P>0.05). 结论：中国人群FXIIIA基因Val34Leu多态性、血浆FXIII抗原和活性与心肌梗死及脑梗死患病危险性无明确相关性.
【关键词】 心肌梗死;脑梗死;FXIIIA基因多态性;FXIII抗原和活性
0引言
FXIIIA基因多态性与心脑血管血栓性疾病有关，其中Val34Leu引起研究者广泛的兴趣，这一多态性位点距凝血酶的酶切部位仅3个氨基酸，可影响FXIII的激活过程. 英国、芬兰和奥地利人群中Val34的存在可降低动脉闭塞性疾病如心肌梗死(MI)、脑梗死，但来自西班牙和法国南部的研究未发现有此相关性. 我们对中国汉族人群进行了相关的探索.
1对象和方法
1.1对象
2002/2004年来自河南省汉族人群，经心电图、心肌酶谱及CT确诊心肌梗死112(男66，女46)例，年龄39~72(平均58.2)岁；脑梗死122(男58，女62)例，年龄45~84(平均64.7)岁；健康对照200(男120，女80)例为同期健康体检者，年龄18~65 (平均50.8) 岁.
1.2方法
采用双抗体夹心法检测FXIIIA:Ag和FXIIIB:Ag，其中FXIIIA抗体和FXIIIB抗体分别作为包被抗体. 将FXIIIB抗体作为酶标抗体，用HRP进行标记，分别检测FXIIIA:Ag和FXIIIB:Ag. FXIII经凝血酶激活后，FXIIIA可催化蛋白分子间和分子内γ谷氨酰胺基和ε赖氨酸氨基之间的脱氨反应，FXIIIA的活性与掺入的生物素化戊胺成正比. 纤维蛋白原包板；10 g/L BSA封闭；加入5 mmol/L biotinpentylamine，标准品或样品，凝血酶(50 kU/L)，50 mmol/L CaCl2，37℃，20 min；加0.2 mol/L EDTA终止反应；加avidinHRP 37℃, 30 min，显色1～2 min，ELX800酶标仪测490 nm的A值. 标准品FXIII分5个浓度建立标准曲线. 以正常标准血浆为标准，检测各样本FXIII:C. 等位基因特异PCR(allelespecific PCR)检测FXIIIA基因V34/L的基因型. 针对Val34位点设计3′端特异的上游引物5′CACAGTGGAGCTTCAGGGCG3′和5′CACAGTGGAGCTTCAGGGCT3′，下游引物5′CAGAGGATGTTTACCTGCAG3′. 片段长度为133 bp，反应总体积为25 μL，95℃变性5 min，95℃ 1 min, 62℃ 30 s，72℃ 30 s，共35循环，72℃延伸10 min，降至4℃，在15 g/L琼脂糖凝胶上电泳检测FXIII基因V34L多态性.
统计学分析: 数据以x±s表示,应用方差分析及q检验处理数据.
2结果
2.1FXIII活性、抗原水平及FXIII A基因型频率各组年龄及性别的构成比无差别. 健康人群FXIIIA基因Leu的基因型频率仅为0.01. 而MI组和脑梗死组分别为0.018和0.029，较正常者偏高，但经统计学分析3组间无显著差异(P>0.05). MI组和脑梗死组血浆FXIIIA亚基和B亚基抗原含量与健康对照组比较无显著差异(P>0.05)，均在健康对照组范围中. FXIII活性亦在3组间无差别(Tab 1).表1各组FXIII活性、抗原水平及FXIII基因型频率(略)
2.2FXIIIA基因型与FXIII抗原及活性的关系FXIIIA各基因型FXIII A亚基与B亚基抗原的含量无显著差异，Leu者的FXIII活性偏高，但与Val者无差异(P>0.05，Tab 2).表2FXIIIA基因型与FXIII抗原及活性的关系(略)
3讨论
Val34和Leu34的基因频率在不同种族和地区的人群中有较大差异. 本结果显示,健康人群FXIIIA基因Leu的基因型频率仅为0.01，提示中国人FXIII A Leu34基因频率与日本人群相近. Val34Leu多态性所致的FXIII生化特性变化目前仍不清楚，可能影响血浆FXIII水平(通过改变细胞内表达、稳定性及分泌)、FXIII活化的不同阶段以及FXIIIA的特异活性等. FXIIIALeu34活性肽段的释放及FXIII活化蛋白出现速度明显高于FXIIIAVal34[1]，但这种更快速的纤维蛋白交联如何与动脉血栓保护作用相关目前尚不清楚. 由于FXIII促进纤维凝块形成，因此在形成血栓及纤溶过程中起重要的作用. 鉴于以上研究，FXIII不同基因型对FXIII活性产生的差别，如果动、静脉血栓与FXIII活性增加有关，那么Leu34与动、静脉血栓相关，但目前临床研究结果并非如此. 深部静脉血栓与FXIIIA基因型似相关，Leu34虽有较高的FXIII活性，但对其有轻微的保护作用[2]. Endler等[3]对718例缺血性中风和369例健康对照进行研究结果并未发现FXIII各基因型在两组间有差异，并且与年龄性别以及其他血管危险因子等不相关. Mills等[4]在对患有严重冠脉疾病患者的健康亲属中未发现与FXIIIA基因的不同基因型之间有差异. 最近，新加坡的一项报道FXIIIALeu34在CAD与对照之间无显著差别[5]，本研究结果与以上结果基本一致，提示中国人FXIIIA基因这一多态性在动脉血栓性疾病发生中的作用不大. 因此FXIIIA基因多态性与血栓性疾病的关系可能存在微妙机制，应作深入广泛的研究.
【参考文献】
[1] Lee IH, Chung SI, Lee SY. Effects of Val34Leu and Val35Leu polymorphism on the enzyme activity of the coagulation factor XIIIA[J]. Exp Mol Med, 2002;34(5):385-390.
[2] Van Hylckama Vlieg A, Komanasin N, Ariens RA, et al. Factor XIII Val34Leu polymorphism, factor XIII antigen levels and activity and the risk of deep venous thrombosis[J]. Br J Haematol, 2002; 119(1):169-175.
[3] Endler G, Funk M, Haering D, et al. Is the factor XIII 34Val/Leu polymorphism a protective factor for cerebrovascular disease[J]? Br J Haematol, 2003;120(2):310-314.
[4] Mills JD, Mansfield MW, Grant PJ. Factor XIIIcirculating levels and the Val34Leu polymorphism in the healthy male relatives of patients with severe coronary artery disease[J]. Thromb Haemost, 2002; 87(3):409-414.
[5] Heng CK, Lal S, Saha N, et al. The impact of factor XIIIa V34L polymorphism on plasma factor XIII activity in the Chinese and Asian Indians from Singapore[J]. Hum Genet, 2004;114(2):186-191.
作者简介：段宝民(1967)，男(汉族)，河南省开封市人. 主治医师. Tel.13837854004Email.dbm1@163.com
(河南省开封市第一人民医院急诊科，河南 开封 475000)
编辑潘伯荣, http://www.100md.com(段宝民,李夏昀,逯锦涛,王卫民,李兵)
DUAN BaoMin, LI XiaYun, LU JinTao, WANG WeiMin, LI Bing
Emergency Department, Kaifeng First People’s Hospital of Henan, Kaifeng 475000, China
【Abstract】 AIM: To explore the clinical significance of the polymorphism of coagulation factor XⅢ A subunit gene (Val 34/Leu), and FXⅢ antigen and activity in plasma of patients with myocardial infarction or brain infarction. METHODS: The plasma level of FXⅢ antigen in patients and the healthy controls were measured by sandwich enzyme linked immunosorbent assay and the activity of FXⅢ was detected by Biotinlabeled assay. Allelespecific PCR was used to detect the FXⅢA subunit genotypes. RESULTS: The frequency of Leu34 genotype in patients with myocardial or brain infarction was 0.018 and 0.029 respectively, a little higher than that of controls, but no difference was found between them (P>0.05). There was no difference in the activity of FXⅢ between different genotypes though it was slightly higher in patients with Leu34 variant than in patients with Val 34 variant. No difference was found in FXⅢA subunit gene, FXII antigen and its activity between the controls and patients with myocardial infarction or brain infarction. CONCLUSION: There is no definitely correlation between FXⅢA gene Val34Leu polymorphism, plasma FXⅢ level and myocardial or brain infarction.
【Keywords】 myocardial infarction; brain infarction; FXⅢ Val34/Leu polymorphism; FXⅢ antigen and activity
【摘要】 目的：探讨凝血因子FXIIIA基因Val34Leu多态性、血浆FXIII抗原及活性水平在心肌梗死与脑梗死患者中的临床意义. 方法：采用双抗体夹心ELISA法检测心肌梗死、脑梗死患者及健康对照者血浆FXIII抗原；生物素标记法检测血浆FXIII活性；等位基因特异PCR检测FXIIIA基因V34/L的基因型. 结果：心肌梗死组和脑梗死组FXIIIA基因Leu34基因频率分别为0.018和0.029，较健康人群偏高，但三组之间无显著差异(P>0.05)，且含Leu者的FXIII活性偏高，但与Val者无差异(P>0.05). 心肌梗死组和脑梗死组血浆FXIIIA亚基和B亚基抗原含量、FXIII活性与健康对照组比较无显著差异(P>0.05). 结论：中国人群FXIIIA基因Val34Leu多态性、血浆FXIII抗原和活性与心肌梗死及脑梗死患病危险性无明确相关性.
【关键词】 心肌梗死;脑梗死;FXIIIA基因多态性;FXIII抗原和活性
0引言
FXIIIA基因多态性与心脑血管血栓性疾病有关，其中Val34Leu引起研究者广泛的兴趣，这一多态性位点距凝血酶的酶切部位仅3个氨基酸，可影响FXIII的激活过程. 英国、芬兰和奥地利人群中Val34的存在可降低动脉闭塞性疾病如心肌梗死(MI)、脑梗死，但来自西班牙和法国南部的研究未发现有此相关性. 我们对中国汉族人群进行了相关的探索.
1对象和方法
1.1对象
2002/2004年来自河南省汉族人群，经心电图、心肌酶谱及CT确诊心肌梗死112(男66，女46)例，年龄39~72(平均58.2)岁；脑梗死122(男58，女62)例，年龄45~84(平均64.7)岁；健康对照200(男120，女80)例为同期健康体检者，年龄18~65 (平均50.8) 岁.
1.2方法
采用双抗体夹心法检测FXIIIA:Ag和FXIIIB:Ag，其中FXIIIA抗体和FXIIIB抗体分别作为包被抗体. 将FXIIIB抗体作为酶标抗体，用HRP进行标记，分别检测FXIIIA:Ag和FXIIIB:Ag. FXIII经凝血酶激活后，FXIIIA可催化蛋白分子间和分子内γ谷氨酰胺基和ε赖氨酸氨基之间的脱氨反应，FXIIIA的活性与掺入的生物素化戊胺成正比. 纤维蛋白原包板；10 g/L BSA封闭；加入5 mmol/L biotinpentylamine，标准品或样品，凝血酶(50 kU/L)，50 mmol/L CaCl2，37℃，20 min；加0.2 mol/L EDTA终止反应；加avidinHRP 37℃, 30 min，显色1～2 min，ELX800酶标仪测490 nm的A值. 标准品FXIII分5个浓度建立标准曲线. 以正常标准血浆为标准，检测各样本FXIII:C. 等位基因特异PCR(allelespecific PCR)检测FXIIIA基因V34/L的基因型. 针对Val34位点设计3′端特异的上游引物5′CACAGTGGAGCTTCAGGGCG3′和5′CACAGTGGAGCTTCAGGGCT3′，下游引物5′CAGAGGATGTTTACCTGCAG3′. 片段长度为133 bp，反应总体积为25 μL，95℃变性5 min，95℃ 1 min, 62℃ 30 s，72℃ 30 s，共35循环，72℃延伸10 min，降至4℃，在15 g/L琼脂糖凝胶上电泳检测FXIII基因V34L多态性.
统计学分析: 数据以x±s表示,应用方差分析及q检验处理数据.
2结果
2.1FXIII活性、抗原水平及FXIII A基因型频率各组年龄及性别的构成比无差别. 健康人群FXIIIA基因Leu的基因型频率仅为0.01. 而MI组和脑梗死组分别为0.018和0.029，较正常者偏高，但经统计学分析3组间无显著差异(P>0.05). MI组和脑梗死组血浆FXIIIA亚基和B亚基抗原含量与健康对照组比较无显著差异(P>0.05)，均在健康对照组范围中. FXIII活性亦在3组间无差别(Tab 1).表1各组FXIII活性、抗原水平及FXIII基因型频率(略)
2.2FXIIIA基因型与FXIII抗原及活性的关系FXIIIA各基因型FXIII A亚基与B亚基抗原的含量无显著差异，Leu者的FXIII活性偏高，但与Val者无差异(P>0.05，Tab 2).表2FXIIIA基因型与FXIII抗原及活性的关系(略)
3讨论
Val34和Leu34的基因频率在不同种族和地区的人群中有较大差异. 本结果显示,健康人群FXIIIA基因Leu的基因型频率仅为0.01，提示中国人FXIII A Leu34基因频率与日本人群相近. Val34Leu多态性所致的FXIII生化特性变化目前仍不清楚，可能影响血浆FXIII水平(通过改变细胞内表达、稳定性及分泌)、FXIII活化的不同阶段以及FXIIIA的特异活性等. FXIIIALeu34活性肽段的释放及FXIII活化蛋白出现速度明显高于FXIIIAVal34[1]，但这种更快速的纤维蛋白交联如何与动脉血栓保护作用相关目前尚不清楚. 由于FXIII促进纤维凝块形成，因此在形成血栓及纤溶过程中起重要的作用. 鉴于以上研究，FXIII不同基因型对FXIII活性产生的差别，如果动、静脉血栓与FXIII活性增加有关，那么Leu34与动、静脉血栓相关，但目前临床研究结果并非如此. 深部静脉血栓与FXIIIA基因型似相关，Leu34虽有较高的FXIII活性，但对其有轻微的保护作用[2]. Endler等[3]对718例缺血性中风和369例健康对照进行研究结果并未发现FXIII各基因型在两组间有差异，并且与年龄性别以及其他血管危险因子等不相关. Mills等[4]在对患有严重冠脉疾病患者的健康亲属中未发现与FXIIIA基因的不同基因型之间有差异. 最近，新加坡的一项报道FXIIIALeu34在CAD与对照之间无显著差别[5]，本研究结果与以上结果基本一致，提示中国人FXIIIA基因这一多态性在动脉血栓性疾病发生中的作用不大. 因此FXIIIA基因多态性与血栓性疾病的关系可能存在微妙机制，应作深入广泛的研究.
【参考文献】
[1] Lee IH, Chung SI, Lee SY. Effects of Val34Leu and Val35Leu polymorphism on the enzyme activity of the coagulation factor XIIIA[J]. Exp Mol Med, 2002;34(5):385-390.
[2] Van Hylckama Vlieg A, Komanasin N, Ariens RA, et al. Factor XIII Val34Leu polymorphism, factor XIII antigen levels and activity and the risk of deep venous thrombosis[J]. Br J Haematol, 2002; 119(1):169-175.
[3] Endler G, Funk M, Haering D, et al. Is the factor XIII 34Val/Leu polymorphism a protective factor for cerebrovascular disease[J]? Br J Haematol, 2003;120(2):310-314.
[4] Mills JD, Mansfield MW, Grant PJ. Factor XIIIcirculating levels and the Val34Leu polymorphism in the healthy male relatives of patients with severe coronary artery disease[J]. Thromb Haemost, 2002; 87(3):409-414.
[5] Heng CK, Lal S, Saha N, et al. The impact of factor XIIIa V34L polymorphism on plasma factor XIII activity in the Chinese and Asian Indians from Singapore[J]. Hum Genet, 2004;114(2):186-191.
作者简介：段宝民(1967)，男(汉族)，河南省开封市人. 主治医师. Tel.13837854004Email.dbm1@163.com
(河南省开封市第一人民医院急诊科，河南 开封 475000)
编辑潘伯荣, http://www.100md.com(段宝民,李夏昀,逯锦涛,王卫民,李兵)