固相萃取高效液相色谱法测定水中痕量微囊藻毒素

    张维昊 徐小清3

    (中国科学院水生生物研究所 , 武汉 430072)

    摘 要 微囊藻毒素是有害的蓝藻水华释放的有毒代谢物 ,对人类及环境具有很大危害性。建立了固

    相萃取2高效液相色谱测定水中痕量藻毒素的方法。该法对两种常见微囊藻毒素MC2 LR、 MC2RR的检测

    限为0. 02～0. 05μg L ,线性定量范围为0. 1～50μg L。应用该法分析了天然水样,表明方法具有实用性。

    关键词 微囊藻毒素 ,固相萃取 ,高效液相色谱

    2000207203收稿;2001201215接受

    本文系国家科技部与云南省政府资助课题(课题号:DCH201)

    1 引 言

    随着环境污染和富营养化的加剧而引起内陆水体中有害蓝藻水华(harmful algal bloom ,HAB)的频繁

    发生已成为国内外普遍关注的环境问题〔 1〕。微囊藻毒素(microcystins ,MC)即为有害的蓝藻水华释放的

    一类具有强烈促癌作用的肝毒素 ,已发现60多种异构体。蓝藻水华及其毒素已列为微生物和有机污染

    物的检测项目〔 2〕。并已有国家推荐水中微囊藻毒素的安全浓度为 1μg L。我国自 80 年代就对微囊藻

    毒素的毒性做过研究〔 3〕,而对于水体中微囊藻毒素的检测 ,由于含量低、干扰大 ,目前还未有可靠的定性

    和定量检测方法的报道。本文在综合国外文献〔 3～9〕 的基础上 ,结合国情 ,建立了固相萃取(SPE)高效液

    相色谱(HPLC)检测水环境中痕量藻毒素的分析方法 ,并用于实际样品分析 ,取得满意结果。

    2 实验部分

    2. 1 仪器和试剂

    LC2890A型高效液相色谱仪(北京星达技术公司) ,配有 S 23702 型紫外2可见光检测器(日本相马公

    司) ,LC2850型柱室恒温箱;色谱数据工作站 ,Hypersil BDS C18分析色谱柱(4. 6 ×250 mm ,5μm) ,C18 保

    护预柱 ,C18固相萃取柱(100 g L)均为中国科学院大连化学物理研究所提供。

    RE252A型旋转蒸发器(上海亚荣生化仪器厂) , 250 mL 杯式滤器 ,0. 45μm混合纤维素酯微孔滤膜

    和0. 45μm针头过滤器。

    微囊藻毒素标样为MC2 LR ,MC2RR(Sigma 公司) ,三氟乙酸(化学纯 ,上海化学试剂公司) ,甲醇(色谱

    纯 ,上海化学试剂研究所) ,双蒸水。

    2. 2 色谱分析条件

    流动相为含0. 1 %三氟乙酸的水溶液∶甲醇 = 30∶ 70 ( V V) ,流速 1 mL min ,进样量 10μ L ,色谱柱恒

    温箱设为25 ℃,紫外检测波长为238 nm ,实验依据保留时间定性 ,外标法定量。

    2. 3 储备液和标准液配制

    分别将0. 500 mg微囊藻标准品溶于2. 00 mL 甲醇中 ,作为储备液。用前再以甲醇稀释配制成标准

    系列。

    2. 4 样品制备

    取水样500 mL ,于杯式滤器中经0. 45μm滤膜减压过滤。滤液中加 10 mL 甲醇调节后过 C18 反相

    固相萃取柱。C18反相固相萃取柱用前以 10 mL 甲醇活化并用 20 mL 双蒸水调整。将水样以 5～10

    mL min的流速流过固相萃取柱进行富集浓缩。装样完毕后 ,用5 %甲醇水溶液 10 mL 淋洗以净化样品 ,待固相萃取柱吹干后 ,以4 mL 甲醇将微囊藻毒素洗脱并经针头过滤器过滤后收集于浓缩瓶内。洗脱液

    用旋转蒸发器蒸发至0. 2～0. 5 mL ,氮气吹干后于 - 20 ℃冷冻保存。分析前用甲醇溶解 ,定容为 0. 20

    第29卷

    2001年5月 分析化学 (FENXI HUAXUE) 研究报告

    Chinese Journal of Analytical Chemistry

    第5期

    522～525mL。

    3 结果与讨论

    3. 1 流动相的选择

    国外文献中流动相通常用乙腈及磷酸盐缓冲液 ,并进行梯度洗脱 ,不仅毒性大、成本高 ,且容易堵塞

    色谱柱 ,对仪器要求高。本文以甲醇2水配制流动相 ,以三氟乙酸调节pH值并进行等度洗脱 ,降低了分

    析成本 ,实验后色谱柱易清洗 ,并减少了对操作人员的危害。

    3. 2 线性范围和检测限

    将MC2 LR和MC2RR标准品逐级稀释配制成0. 25、 0. 50、 1. 25、 2. 50 和 25. 0 mg L 系列质量浓度 ,在

    色谱分析条件下依次测定 ,以峰面积( X , μV· s)对相应的进样量( Y , μg)进行线性回归 ,回归方程、线性范

    围及相关系数列于表1。在信噪比( S N)为3的要求下 ,绝对量检测限可达1 ng。

    表1 校准曲线回归方程及其参数( n = 5)

    Table 1 Regressien equations of the calibration curves and its factors( n = 5)

    毒素 Toxins

    浓度范围 Concentration (g mL)

    回归方程 Regression equation

    相关系数 Correlation coefficient ( r)

    Macrocystins (MC)2 LR 2. 5× 10 - 7

    ～2. 5× 10 - 5

    Y = 1. 17 X - 0. 03 0. 9987

    MC2CR 2. 5× 10 - 7

    ～2. 5× 10 - 5

    Y = 0. 88 X - 0. 33 0. 9983

    313 样品处理的优化

    3. 3. 1 SPE柱的选择 对比了不同品牌 C18 反相固相萃取柱(德国 Chromabond C18f ,美国 Bound Elut

    J r. C18和大连化学物理研究所提供的ODS C18)对微囊藻毒素的提取率 ,发现它们之间的差异较小 ,平

    均提取率均超过90 % ......