辣根过氧化物酶在表面活性剂膜中的直接电化学

    刘慧宏3

    陈显堂 李 俊 Hill H. A. O.

    (襄樊学院化学化工系 ,襄樊 441053) (牛津大学无机化学实验室 ,英国牛津)

    摘 要 利用3种表面活性剂分别将辣根过氧化氢酶固定在裂解石墨棱面(edge2plane pyrolytic graphite ,EPG)电极表面 ,研究了辣根过氧化物酶(HRP)中 Fe D Fe C电对与电极之间的直接电子传递过程以及酶

    催化双氧水还原过程。实验结果表明: (1)表面活性剂是一种固定酶的理想材料; (2)这种体系可能构造

    第三代生物传感器 ,对解释生物体代谢过程具有理论意义 ,对制备第三代生物传感器具有应用价值。

    关键词 辣根过氧化物酶 ,表面活性剂 ,直接电化学 ,化学修饰电极

    2000206226收稿;2000212210接受

    本文系湖北省教委资助课题

    1 引 言

    研究氧化还原蛋白质与电极之间的电子传递过程具有重要意义。一方面它为理解生物电化学和生

    物代谢过程提供有价值的信息 ,另一方面 ,利用电极探讨氧化还原蛋白质与底物分子之间的电子传递过

    程 ,为制备生物传感器提供实验基础〔 1 ,2〕。

    HRP含有辅基血红素 ,它是研究过氧化物酶的结构、动力学和热力学性质的代表。另外 ,HRP修饰

    电极广泛运用于分析过氧化氢、有机过氧化物、酚类化合物、芳香化合物以及一些环境污染物〔 3〕。近几

    年 ,利用各种材料的电极对 HRP的直接电子传递过程及催化性能进行了深入的研究 ,但 HRP修饰电极

    的催化电子传递机理仍存在着争议〔 4 ,5〕。而且只有少数文献描述了酶中 Fe ( Ⅲ) Fe C氧化还原对的电

    化学行为〔 6〕。原因是 HRP中的电活性中心与电极之间的电子传递速度很慢。因此 ,研究酶的固定化材

    料和方法、使酶具有适宜的环境、保持其活性、具有良好的取向以加速电子传递过程是当前十分活跃的

    研究课题。表面活性剂膜具有与生物体磷酯膜十分近似的结构。因而可能成为研究蛋白质的电化学提

    供良好的微环境 ,为构造生物传感器提供新型材料〔 7 ,8〕。

    本文研究了在表面活性剂膜内的 HRP的电化学性质。实验结果证明: (1)表面活性剂是一种固定

    酶的理想材料; (2)这种体系可能构造第三代生物传感器。

    2 实验部分

    2. 1 试剂和仪器

    HRP(Grade Ⅱ,德国Boehringer公司) ,使用时未经提纯。双十二碳烯基溴化二甲基铵(DDAB ,Aldrich

    公司) ,双十四酰基磷酯酰胆碱(DMPC ,Signa公司) ,双十六烷基磷酸(DHP ,Fluka 公司) 。其它化学试剂

    均为分析纯 ,所有溶液用Milli2Q水配制而成。缓冲溶液(离子强度为0. 1)配制:酒石酸盐 pH 3. 0～6. 0 ;

    磷酸盐pH 7. 0～8. 0 ;硼砂pH = 9. 0～10. 0 ;磷酸盐:pH = 11. 0。电化学测量使用计算机控制的 Autolab

    电化学系统(荷兰 Eco. Chemie公司) 。

    2. 2 实验方法

    2. 2. 1 电极的修饰 表面活性剂DDAB(10 mmol L) ,DMPC(10 mmol L)和DHP(2. 5 mmol L)的悬浊液 ,超声波振荡形成分散液。等体积的表面活性剂分散液和 HRP(165 g L)的磷酸盐溶液混合。取10μ L 该

    混合液平铺于电极表面 ,空气干燥约12 h。制得的修饰电极分别表示为:DDAB HRP ,DMPC HRP ,DHP

    HRP。

    2. 2. 2 电化学测量 电化学池由参比电极池和电化学反应池(体积约400μ L)两部分构成 ,其间由鲁金

    (Lugging)毛细管连接。参比电极为饱和甘汞电极( vs . SCE K401 ,Radiometer) 。铂丝网为辅助电极 ,工作

    电极为 EPG(Le Carbone2 Lorraine) ,电化学面积由 Randles2Sevcik方程求得为0. 075 cm2。每次实验前 ,EPG

    第29卷

    2001年5月 分析化学 (FENXI HUAXUE) 研究报告

    Chinese Journal of Analytical Chemistry

    第5期

    511～515电极用金相砂纸磨平 ,在人造毛绒上以Al2O3 (粒度0. 015μm , BDH)悬浊液抛光成镜面。超声波震荡清

    洗后 ,进行电极修饰。实验过程中在支持电解质溶液中通N2 除O2。

    3 结果及讨论

    3. 1 辣根过氧化物酶的直接电化学

    DDAB HRP ,DMPC HRP ,DHP HRP膜修饰电极于磷酸盐缓冲溶液(pH = 7. 0)中测得的 CV 曲线为

    图1所示。均呈现一对氧化还原峰。峰的形状基本对称而且氧化和还原峰高大致相等。而不含 HRP

    的表面活性剂膜电极不产生法拉第电流。所以此氧化还原峰是 HRP的电活性中心与电极之间进行电

    子交换的结果。

    图1 酶修饰电极的循环伏安图

    Fig. 1 Cyclic voltammograms of HRP modified edge 2plane pyrolytic graphite (EPG) electrode

    (a)DDAB HRP ; (b) DMPC HRP ; (c) DHP HRP , v = 2V s , PBS pH 7. 0。

    半波电位(表1)与用电势法测定 HRP血红素 Fe ( Ⅲ) Fe C氧化还原对的电位值( E = - 0. 271V ,PBS

    pH 7. 0 , T = 30 ℃)相近〔 9〕。随着扫描速度的增加 ,阳极峰与阴极峰的电位差值(ΔEp )有微小的改变。

    ΔEp 大于表面过程的理论值(ΔEp = 0 mV) 。这种结果的产生可以归于 HRP的构象效应。即:HRP分子

    较大且形状不太规则 ,电活性点埋藏较深。另外电场力的影响 ,导致在电位扫描过程中 ,引起电荷分布

    和空间位置的变化 ,使ΔEp 偏离理论的估算值。但当扫描速度高于1 V s时 ,其峰电流与扫描速度成正

    比例 ,线性方程分别为:阴极峰电流: y = - 0. 779 + 9. 687 x , r = 0. 9837 ; 阳极峰电流: y = - 0. 642 +

    91628 x , r = 0. 9739。表明该电化学反应为吸附在电极表面的 HRP与电极之间的电子交换过程。

    表1 HRP氧化还原峰的性质

    Table 1 The redox properties of horseradish peroxidase (HRP) in three surfactant film (PBS pH 7. 0 ,ν= 2V s)

    化学修饰电极 CME

    膜净电荷 Film net charge

    E1 2 (V) ΔEp (mV) ipc ipa

    DDAB HRP CME 1 - 0. 212 45 0. 83

    DMPC HRP CME 0 - 0. 330 48 1. 18

    DHP HRP CME - 1 - 0. 381 68 1. 39

    CME:chemically modified electrod ; DHP :dihexadcylphosphate ;DDAB :didodecyldimethylammonium; DMPC:dimyristol phosphatidycholine ......