第29卷

    2001年7月 分析化学 (FENXI HUAXUE) 研究报告

    Chinese Journal of Analytical Chemistry

    第7期

    755～759

    L2扁桃体酸脱氢酶的电化学特性

    刘慧宏3 1

    , Hill , H. A. O.

    2

    ,Chapman , S. K.

    3

    1

    (襄樊学院化学化工系 , 襄樊 441053)

    2

    ( Inorganic Chemistry Laboratory , University of Oxford , South Parks Road , Oxford OX1 3QR , UK )

    3

    (Department of Chemistry , University of Edinburgh , West Mains Road , Edinburgh EH9 3JJ , Scotland , UK )

    摘 要 应用电化学方法研究了基因工程酶( L2扁桃体酸脱氢酶)的电化学性质 ,探讨了

    其催化机理。以聚赖氨酸为促进剂 ,L2扁桃体酸脱氢酶黄素微区在裂解石墨棱面( EPG,edge2plane pyrolytic graphite)电极上有两对氧化还原峰( - 0. 481 V和 - 0. 605 V vs. SCE ,Tris

    缓冲溶液pH 7. 5 ,扫描速度20 mV s) ,显示出酶的辅基黄素单核苷酸(FMN)与电极之间的

    电子传递过程。在此条件下 ,L2扁桃体酸脱氢酶黄素微区不能催化 L2扁桃体酸脱氢 ,但

    用二茂铁甲酸和细胞色素 C作为媒介体 ,能促进酶催化反应有效地进行。

    关键词 基因工程酶 , L2扁桃体酸脱氢酶 , 电化学

    2000208212收稿;2001202212接受

    本文系湖北省教委科研基金项目(98B35)

    1 引 言

    生物电化学传感器的研制及应用中 ,存在着下列一些问题: (1)有些酶非电化学活性; (2)较难用于

    活体研究; (3)检测灵敏度不高; (4)较难用于多组分的同时测定。引入电子传递的媒介体或促进剂对酶

    进行化学修饰;应用基因工程手段 ,改变酶的性质 ,提高酶对底物的选择性和灵敏度等将给生物电化学

    传感器的研制注入活力〔 1 ,2〕。

    氧化还原蛋白质参与的电子传递过程是生物体系代谢过程不可缺少的环节。黄素细胞色素 b2 是

    研究这一过程的理想代表。它的三维结构显示每一单元具有两个微区:一是黄素脱氢酶微区 ,含有黄素

    单核苷酸(FMN) ;二是细胞色素微区 ,含有原血红素 IX。两微区之间由聚合肽键连接起来。该酶参与

    的催化过程:首先底物使黄素微区的黄素单核苷酸还原 ,然后黄素单核苷酸将电子传递给细胞色素微区

    的血红素 ,最后血红素将电子传递给生物体中的电子接受体 ,如细胞色素 C等。

    从 Sacharomyces cerevisiae 中分离出来的黄素细胞色素 b2 是 L2乳酸脱氢酶 ,通过基因工程技术处理 ,改变其中的两个氨基酸(108丙氨酸 →甘氨酸 ,230 亮氨酸 →丙氨酸) ,则改变了黄素脱氢酶微区的活性

    点 ,使该酶对 L2扁桃体酸具有催化脱氢作用〔 3〕。

    我们用聚赖氨酸等作为促进剂 ,研究了 L2扁桃体酸脱氢酶的黄素微区与电极之间的直接电化学 ,用二茂铁甲酸和细胞色素 C作为媒介体 ,实现了酶修饰电极对 L2扁桃体酸的催化脱氢。

    2 实验部分

    211 试剂和仪器

    L2扁桃体酸脱氢酶的黄素微区(flavodedrohydrogenase domain of L2mandelate dehydrogenase ,FDH)由文

    献〔 3〕方法制备。黄素单核苷酸钠盐(flavin mononucluotide ,FMN) ;聚2L2赖氨酸(poly2L2lysine ,PLL) ; L2扁

    桃体酸 ( L2mandelic acid ,LMA) ; D2扁桃体酸; DL2乳酸;马心细胞色素 C (Cyt . C) ;二茂铁甲酸 (fer2

    rocenemonocarboxylic acid ,FMCA) 购自 Signa 公司; 氯化镁和亚铁氰化钾购自 BDH 公司 ,AQ229D ( East2

    man) 。其它的试剂均为分析纯。缓冲溶液为0. 01 mol L Tris (pH 7. 5 , I = 0. 10) ;FDH、 FMN、 Cyt . c 的浓度

    用UV光度计确定 ,其摩尔吸光系数分别:FDH: ε 450 = 11100 ;FMN : ε 450 = 12300 ;Cyt . C: ε 550 = 29500。

    电化学池由参比电极池和电化学反应池(体积约 400μ L)两部分构成 ,其间由鲁金(Lugging)毛细管

    连接。参比电极为饱和甘汞电极( vs . SCE K401 ,Radiometer) 。铂丝网为辅助电极 ,工作电极为 EPG(Le

    Carbone2 Lorraine) ,电化学面积由 Randles2Sevcik方程求得为 0. 075 cm2。每次实验前 ,EPG电极用金相砂纸磨平 ,在人造毛绒上以α 2Al2O3 (粒度0. 015 μm , BDH)悬浊液抛光成镜面。超声波震荡清洗后 ,进行电

    极修饰。实验过程中在支持电解质溶液中通N2 除O2。

    212 电极修饰

    电极修饰采用醮涂法。(1) PLL 修饰电极(PLL EPG) :将1滴(2μ L)的1 %PLL 溶液滴至 EPG电极表

    面 ,空气干燥; (2) FDH、 FMN修饰电极(PLL FDH EPG和 PLL FMN EPG) :先将1滴(6 μ L)的1 %PLL 溶液

    滴至电极表面 ,干燥后 ,再滴加 FDH(177μmol L)或者FMN(167μmol L)溶液(2μ L) ,干燥后 ,再滴加一层

    1 %PLL 溶液; (3) FMCA修饰酶电极(AQ229D FMCA FDH EPG) : 取6 μ L 含0. 04 mol L FMCA的AQ229D

    (1 %W V)溶液滴至电极表面 ,干燥后滴加 6μ L FDH(177μmol L)溶液 ,干燥后 ,再加 AQ229D 保护层.

    (4) Cyt . C修饰酶电极(PLL Cyt . C FDH EPG) :首先将1滴 Cyt . C(156μmol L)溶液滴至 EPG电极表面 ,干燥后加一滴 FDH ,尔后加 PLL 保护层。

    3 结果和讨论

    311 L2扁桃体酸脱氢酶黄素微区( FDH)的直接电化学

    实验表明:FDH与未修饰的 EPG电极之间无电子传递。原因是经抛光的 EPG电极表面产生许多含

    氧负离子基团。它能选择性地识别和结合带正电荷的蛋白质 ,而排斥带负电荷的蛋白质〔 4〕。一般说来 ,为了有效地促进蛋白质与电极之间的电子传递 ,在电极表面有必要引入基团 ,这些基团能可逆地结合带

    负电荷的蛋白质 ,如本实验中的FDH。将PLL 加在溶液中或者修饰在电极表面 ,它能克服荷负蛋白质与

    EPG电极之间的排斥作用 ,促进蛋白质与电极之间的电子传递〔 5〕 ......