毛细管区带电泳监测牛胰岛素的去折叠过程

    董 标 董方霆 王京兰 钱小红3

    (军事医学科学院国家生物医学分析中心 ,北京 100850)

    摘 要 用毛细管区带电泳监测了二硫苏糖醇作用下二硫键还原引起的牛胰岛素去折叠全过程 ,同时

    用离线的基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱配合确证。从毛细管电泳谱图能直接观察胰岛素去折

    叠过程中发生的变化 ,获得蛋白质去折叠信息。结果表明 ,毛细管区带电泳作为监测蛋白质构象变化的

    一种有效手段 ,方法简便、快速、灵敏度高、样品消耗量少。

    关键词 毛细管区带电泳 ,牛胰岛素 ,基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱 ,蛋白质去折叠

    2000205230收稿;2000210212接受

    本文系国家自然科学基金资助项目(No. 29705003)

    1 引 言

    蛋白质的空间结构、肽链的折叠与其生物学功能的关系 ,是结构生物学领域的核心和前沿问题之

    一〔 1〕。对于含有二硫键的蛋白质 ,还原剂的加入引起二硫键的断裂可导致蛋白质发生去折叠。二硫键

    的形成对稳定蛋白质或多肽的三维空间结构起重要作用 ,若被还原 ,则引起其天然构象的改变和生物活

    性丧失〔 2〕。研究蛋白质构象变化常用的紫外差光谱、荧光光谱、园二色性方法〔 3〕 虽能从不同侧面揭示蛋

    白质变性时的构象变化 ,但因未经分离 ,只是反映各种变体的加和特性。毛细管区带电泳(capillary zone

    electrophoresis , CZE)是毛细管电泳中应用最广、最基本的操作模式 ,分离原理基于被分析物的荷质比不

    同。CZE用于蛋白质构象变化的研究有其独特的优点:由于毛细管电泳具有高效分离能力 ,可根据被分

    析物的内在性质(如电荷、氨基酸组成及其顺序、分子大小、空间结构等)的不同对其进行分离。当蛋白

    质构象发生变化时 ,其表面电荷的性质发生改变 ,通过毛细管电泳参数(迁移时间 ,电泳峰形或峰的数

    目)的改变直观反映出来。CZE对蛋白质折叠中的不同折叠状态进行高效分离 ,亦从另一个角度提供分

    子结构信息。基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(matrix2assisted laser desorption ionization time of flight

    mass spectrometry , MALDI 2TOF2MS)是80年代后期发展起来一种新的生物质谱技术 ,由于测定的分子质

    量范围宽(高达20万道尔顿) 、灵敏度高(pmol) 、准确度好(误差 ±0. 01 %) ,特别适合于生物大分子的分

    子量测定和结构分析〔 4〕。本实验以牛胰岛素为模型蛋白 ,采用 CZE方法动态监测牛胰岛素在二硫苏糖

    醇(DTT)作用下二硫键还原引起的蛋白质去折叠过程 ,并同时用离线的MALDI 2TOF2MS进行确证。

    2 实验部分

    211 仪器与试剂

    P ACE5000型毛细管电泳仪(美国 Beckman 公司) ,Tof Spec 型飞行时间质谱仪(英国 Micromass 公

    司) 。石英毛细管柱50μm( I.D. ) × 37 cm(有效长度30 cm) (河北永年光纤厂) ,自制线性聚丙烯酰胺涂

    层。

    牛胰岛素(Sigma 公司) ,二硫苏糖醇(dithiothreitol , DTT) (超纯级 ,Calbiochem公司) , α 2氰基242羟基2肉

    桂酸(Sigma 公司) ,Milli2Q级去离子水(实验室自制) ,其它试剂均为国产分析纯。

    212 缓冲液的配制与毛细管壁的涂层

    0. 08 mol L 的磷酸二氢钠溶液用 0108 mol L 的磷酸调至 pH 2. 5 ,使用前用 0145μm的滤膜过滤。

    毛细管壁的线性聚丙烯酰胺涂层参照文献〔 5〕,稍加改动。

    213 样品处理

    胰岛素用pH 2. 5 ,10 mmol L 磷酸盐溶液配成浓度为 111 g L 的溶液 ,DTT用去离子水配成浓度为

    第29卷

    2001年5月 分析化学 (FENXI HUAXUE) 研究简报

    Chinese Journal of Analytical Chemistry

    第5期

    538～54135 g L 的溶液 ,二者等体积混合 ,置 30 ℃恒温水浴 ,在不同时间点取样分别进行毛细管电泳和 MALDI 2

    TOF2MS分析。

    214 毛细管电泳分析条件

    37 cm× 50μm ( I.D. )聚丙烯酰胺涂层柱(自制) 。缓冲液为80 mmol L pH215磷酸盐缓冲溶液 ,分离

    电压为15 kV ,压力进样6 s ,分离温度为25 ℃,检测波长(UV)为214 nm。

    215 MALDI 2TOF2MS分析条件

    N2 激光器 ,波长337 nm ,线性飞行距离65 cm ,加速电压23. 6 kV ,检测器电压 - 1850 V ,基质为α 2氰

    基242羟基2肉桂酸的饱和溶液(50 %ACN ,0. 1 %TFA) ,样品液与基质液各 1μ L 加到样品靶上 ,室温放置 ,干燥备用。

    3 结果与讨论

    311 样品处理与分离条件的选择

    DTT还原二硫键的速度与溶液pH有关〔 6〕。在中性或碱性条件下 ,胰岛素的还原速度很快 ,15 min

    内即反应完全 ,无法用 CZE监测 ,因此选用酸性条件下进行。用线性聚丙烯酰胺涂层进行修饰的毛细

    管柱和选择pH 2. 5的分离缓冲溶液均是为了降低蛋白质与毛细管管壁表面相互作用 ,减少蛋白质吸

    附 ......