第29卷

    2001年7月 分析化学 (FENXI HUAXUE) 研究报告

    Chinese Journal of Analytical Chemistry

    第7期

    790～792

    高效液相色谱质谱分析蘑菇柄中5′ 2核苷酸

    邹耀洪3

    曹学增 汪学英

    (常熟高等专科学校生物化学系 ,常熟 215500)

    摘 要 采用高效液相色谱质谱法 ,对蘑菇柄中 5′ 2核苷酸进行了分析。在 C18柱上 ,以含 0105 %磷酸

    的水2甲醇(95 5 ,V V)为流动相进行了分离 ,检测波长 260 nm。以 HPLC与LCMS复合定性蘑菇柄中

    5′ 2核苷酸为5′ 2鸟苷酸、 5′ 2尿苷酸、 5′ 2腺苷酸和 5′ 2胞苷酸。采用外标法定量 ,它们的回收率分别为

    9819 %、 9511 %、 9411 %和10114 % ,检测限分别为218、 2. 7、 3. 5和4. 3 mg L。

    关键词 高效液相色谱质谱 ,蘑菇柄 ,5′ 2核苷酸

    2000208217收稿;2001201219接受

    1 引 言

    5′ 2核苷酸具有明显的药理作用〔 1〕,尤其是5′ 2鸟苷酸(5′ 2GMP)是著名的强力助鲜剂〔 2〕。食用菌蘑菇

    盖中含有多种5′ 2核苷酸〔 1〕,而蘑菇柄作为加工过程中的下脚废料一直弃之不用。因此分析研究蘑菇柄

    中的5′ 2鸟苷酸和其它5′ 2核苷酸 ,对进一步利用蘑菇具有实际意义。分析鉴定核苷酸过去所用方法是

    紫外光谱法〔 3〕,此法繁琐且准确度不高。本文采用高效液相色谱2质谱(LC2MS)联用法 ,分析了蘑菇柄中

    5′ 2核苷酸。用该法分析5′ 2核苷酸尚未见报道。

    2 实验部分

    211 主要仪器与试剂

    HP21050高效液相色谱仪。Waters 26902Micromanss ZMD液相色谱2质谱联用仪。5′ 2鸟苷酸(日本味

    之素公司) ,5′ 2尿苷酸、 5′ 2腺苷酸、 5′ 2胞苷酸(美国 Sigma 公司) ,甲醇为色谱纯 ,水为超纯水(无锡华晶公

    司) ,其它试剂皆为分析纯。蘑菇柄下脚料 ,苯乙烯型强碱性阴离子交换树脂 201 ×7 (717) (上海化学试

    剂采购供应站) 。

    212 蘑菇柄中5′ 2核苷酸的提取和离子交换柱色谱分离

    将苯乙烯型强碱性阴离子交换树脂先后用0. 5 mol L NaOH溶液和1 mol L HCl 溶液浸泡除去碱溶

    性和酸溶性杂质 ,并均以去离子水洗至中性。再经 1 mol L HCOONa 溶液浸泡转变为甲酸型树脂 ,湿法

    装柱(40 cm× 2 cm) 。继续用1 mol L HCOONa溶液洗至无Cl

    -

    再以1 mol L HCOOH溶液洗 ,最后用蒸馏

    水洗至中性。取鲜蘑菇柄 100 g 用组织捣碎机捣碎成浆 ,在 350 mL0. 14 mol L NaCl 溶液〔 3〕中恒温

    63 ℃ 〔 1〕 浸泡3 h ,立即放入沸水浴中保温10 min ,离心分离取上清液 5 mL ,0. 5 mol L NaOH溶液调pH =

    8〔 4〕,上离子交换柱 ,蒸馏水洗去不吸附物 ,用pH = 3. 74的0. 1 mol L HCOOH20. 1 mol L HCOONa 缓冲溶

    液洗脱 ,收集洗脱液500 mL ,60℃水浴减压浓缩至50 mL。HPLC分析时 ,准确吸取1 mL 于10 mL 量瓶中

    用蒸馏水定容 ,经0. 45μm微孔膜过滤后进样。

    213 液相色谱2质谱联用条件

    21311 液相色谱条件 色谱柱:ZORBAXC18柱 4. 6 mm×25 cm(5μm) ;流动相:含 0. 05 %H3PO4 的水2甲

    醇(95 5 ,V V)体系 ,流速:1. 0 mL min ;柱温:25 ℃;检测波长:260 nm;光谱采集:220～400 nm;进样量:

    标准品5μ L ,试样20μ L。

    21312 质谱条件 电喷雾正离子检测。接口参数:毛细管电压3500 V ,一级锥孔电压46 V ,二级锥孔电

    压5V ,RF透镜电压 0. 49 V ,源温 120 ℃,脱溶 250 ℃。离子能量 110 V ,低质量分辨 1215 ,高质量分辨1215 ,倍增器电压650 V ,扫描范围 m z10～400。

    3 结果与讨论

    311 定性鉴定

    在上述液相色谱条件下得到蘑菇柄提取物的色谱图,见图1。提取物中核苷酸的鉴定采用 HPLC和

    LC2MS复合定性法 ,首先在 HPLC上采用保留时间对照法和标准追加法进行初步定性 ,进而用二级管阵

    列紫外检测技术即在峰顶和峰两侧腰分别采集紫外光谱 ,将所得图谱的形状、吸收带位置及相对强度与

    标准品图谱对照定性 ,再用LC2MS联用仪得到质谱图并与标准品质谱图对照以进一步定性 ......