褶合光谱法作抗脱氧核糖核酸突变药物筛选的初步研究

    陆 峰3

    张晓芳 刘荔荔 武向锋 吴玉田

    (第二军医大学药学院 ,上海 200433)

    摘 要 采用褶合光谱法考察紫外线致脱氧核糖核酸(DNA)突变 ,并以褶合光谱差谱值δ的形式量化

    地表达DNA细微突变的程度 ,其灵敏度远高于二阶导数光谱法。DNA中添加二甲亚砜后表现的褶合光

    谱差谱变化与高效毛细管电泳指纹图谱的结果一致。褶合光谱法分析过程简单快速 ,可以用于抗紫外

    线损伤、抗突变药物的初步筛选。

    关键词 褶合光谱法 ,脱氧核糖核酸突变 ,药物筛选

    2000212223收稿;2001204205接受

    1 引 言

    紫外线致脱氧核糖核酸(DNA)损伤的准确测定能为皮肤病临床诊断、抗紫外线药物筛选等提供有

    用的信息。近年来 ,彗星电泳法〔 1〕、毛细管电泳法〔 2〕、酶联免疫吸附分析法〔 3〕、 DNA芯片〔 4〕等技术在DNA

    检测中的研究有了新的进展 ,但作为筛选技术 ,则显得费时、操作繁琐、代价高昂。作者采用褶合光谱法

    检测DNA损伤。DNA受致癌物、辐射等作用后发生突变 ,产物的紫外光谱与未变化DNA的紫外光谱之

    间必然存在差异 ,但这种差异微乎其微 ,很难辨识。褶合光谱法〔 5 ,6〕的原理与小波变换相似 ,它通过对原

    始吸收光谱进行以正交多项式为基础的正交变换与分解 ,变换得到大量的褶合光谱信息 ,以此显示相似

    的原始吸收光谱在构成上的局部细节特征 ,并以差谱值δ的形式量化地表示DNA 的损伤或变异。DNA

    中添加的化合物若能缓解突变(即δ减小) ,该物质即可初步视为抗突变的目标化合物。

    2 实验部分

    2. 1 材料与仪器

    鱼精DNA(购自中国科学院上海生物化学所) ,Tris 盐为酶级(US Biochemical Co. ) ,EDTA、 HCl、二甲

    亚砜(DMSO) 、硼砂、 NaOH等其它试剂均为分析纯。

    实验所用仪器有 Cary 100 双光束紫外可见分光光度仪(Varian 公司) ,褶合光谱仪(第二军医大学 ,专利号 CN1044165A) ,UV - 1 型紫外分析仪(上海顾村电光仪器厂) ,CIA高效毛细管电泳仪(Waters 公

    司) 。

    2. 2 实验方法

    2. 2. 1 溶液的配制 取DNA适量 ,用 50 mmolP L Tris2HCl 缓冲溶液配制成适当浓度的母液 ,使其在 260

    nm处的吸光度约为1. 0。取母液稀释 3～4 倍即得DNA 溶液。取 0. 01 mL DMSO 与 1 mL DNA 母液混

    合 ,取适量稀释至260 nm处的吸光度约为0. 4 , 即得混合溶液。

    2. 2. 2 溶液的褶合光谱法考察 以 50 mmol L Tris2HCl 缓冲溶液为空白 ,采集 5 种不同浓度的未照射

    溶液的紫外光谱 ,各重复3次 ,通过褶合光谱法的自我训练系统得到三维差谱图、差谱值δ及同一性认

    证 ,确定自我训练完成。采集照射后溶液的紫外光谱 ,通过褶合光谱法与自我训练的自身标准比较 ,得

    到系列差谱图与差谱值 ,作为溶液变化的量度。

    2. 2. 3 毛细管电泳分析 将DNA溶液与照射后DNA样品进行毛细管电泳分析。电泳条件:40 cm × 75

    μm熔融石英毛细管;柱上UV检测器(214 nm) ,分离电压14 kV ;温度25 ℃;虹吸进样时间 1 s ;分离用缓

    冲溶液为25. 25 mmolP L NaB4O7· 10H2O(pH 9. 42) ;每次进样前均用硼砂缓冲溶液冲洗毛细管柱3 min。

    第29卷

    2001年11月 分析化学 (FENXI HUAXUE) 研究简报

    Chinese Journal of Analytical Chemistry

    第11期

    1325～13283 结果与讨论

    3. 1 褶合光谱法与二阶导数法的比较

    导数光谱法具有较强的区分异种紫外光谱的能力,但在两种物质极其相似时 ,其表现不佳。图 1 对

    DNA的二阶导数光谱与褶合光谱进行了简单比较。

    图1 DNA的二阶导数光谱与褶合光谱比较

    Fig. 1 Comparison of second derivative and convolution spectra of deoxyribonucleic acid (DNA)

    由于有大量的褶合光谱 ,图 1 的 a2、 b2 只是从中选择的具有差谱的 2 个褶合光谱图。虚线为自身

    标准的上下限 , “○”中标注了具有差谱的区域。当褶合光谱δ已达5. 80 %时(1. a2) ,相应的二阶导数光

    谱图(1. a1)上仍未有明显的差异;当δ达 11. 48 %时(1. b2) ,二阶导数光谱图(1. b1)上才可见差异。由

    于DNA发生突变的程度较小 ,微量甚至痕量产物的吸收光谱淹没在未变化DNA的信号中 ,使照射前后

    图2 365、 254nm照射下DNA、 DNA2DMSO溶液的δ

    变化

    Fig. 2 δof DNA ,DNA2dimethyl sulfoxide (DMSO)

    solution during 4h radiation at 365 ,254 nm

    1. DNA ( 365 nm) ; 2. DNA + DMSO ( 365 nm) ; 3. DNA

    (254nm) ; 4. DNA + DMSO(254 nm) ......