藻类肝毒素的富集提取与分离.PDF
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苑宝玲 曲久辉
悦目颤藻,藻类肝毒素,固相萃取,高效液相色谱
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参见附件(134KB，3页)。
藻类肝毒素的富集提取与分离.PDF
藻类肝毒素的富集提取与分离
苑宝玲3
曲久辉 (中国科学院生态环境研究中心环境水化学国家重点实验室 ,北京 100085)
摘 要 采用固相萃取(SPE)和高效液相色谱法(HPLC)对蓝绿藻肝毒素进行富集与分离。以悦目颤藻为研
究对象 ,选择最佳方式破坏其细胞 ,使其释放出细胞内肝毒素 ,对肝毒素进行 SPE富集提取。用反相 HPLC技
术 ,以 C18柱作分离柱 ,32 %乙腈2水(含0. 01 molP L 乙酸铵)为流动相 ,达到了对藻类肝毒素的良好分离。
关键词 悦目颤藻 ,藻类肝毒素 ,固相萃取 ,高效液相色谱
2001201206收稿;2001207210接受
本文系国家自然科学基金(No. 20077031) 、中国科学院研究生科学与社会实践资助课题
1 引 言
随着环境污染的加剧及大量氮磷及有机污染物等营养物质排入受纳水体 ,世界各地的湖泊、池塘、河水中藻类尤其蓝绿藻水华日趋严重。在发生水华的藻中 ,有许多能产生毒素 ,如微囊藻、颤藻、丝状鱼
腥藻和囊丝藻等〔 1〕。这些蓝绿藻能产生肝毒素 ,根据其化学结构又分为微囊藻肝毒素(microcystin MC)
和节球藻毒素(nodularin)
〔 2〕。微囊藻肝毒素大部分存在于藻细胞内 ,当细胞破裂或衰老时毒素释放入水
中。MC能抑制肝细胞浆中蛋白磷酸酯酶2A或1的作用 ,人类饮用含MC的水 ,将在肝、肾、肺等器官积
累 ,最终导致肝溢血、肝癌等疾病〔 3〕。由于其在环境水中的含量甚低 ,很难准确地对它进行监测。因此 ,研究肝毒素的富集提取和分离具有重要意义。目前对藻类肝毒素的提取和分离分析研究最多的是铜绿
微囊藻〔 4 ,5〕,对颤藻的研究还较少 ,作者采用悦目颤藻( oscillatoria amoena)为研究对象 ,优化藻类肝毒素
的提取条件 ,并对其进行高效液相色谱分离 ,获得了满意结果。
2 实验部分
2. 1 藻种培养
悦目颤藻藻种购买于中国科学院武汉水生生物研究所。
悦目颤藻 SE培养基:NaNO3 25 mg ;CaCl2 2. 5 mg ;MgSO4· 7H2O 7. 5 mg ; K 2 HPO4 7. 5 mg ; KH2 PO4 1715
mg ;NaCl 2. 5 mg ;土壤浸出液4 mL ;Fe2EDTA 0. 4 mL ;FeCl3· 6H2O 0. 5 mg ;A5 0. 1 mL ;H2O 95. 8 mL。
A5 微量元素培养液:H3BO3 286 mg ;MnCl2· 4H2O 181 mg ;MnSO4· 7H2O 250 mg ; ZnSO4· 7H2O 22 mg ;
CuSO4· 5H2O 7. 4 mg ;Na2MoO4 2. 1 mg ;H2O 100 mL。
Fe2EDTA培养液:Na22EDTA 1 g ;FeCl3· 6H2O 81 mg ;HCl (0. 1 molP L) 50 mL。
2. 2 实验仪器与试剂
DC 41冷冻干燥机(美国 Yamato 公司) ;J22HS冷冻离心机(美国Beckman 公司) ;超声波(美国 Retsch
公司) ;Visiprep
TM
DL 多歧管固相萃取装置(美国 Supelco 公司) ; Pyrex 过滤器(美国 Millipore 公司) ;高效
液相色谱仪LC210AD(日本岛津公司) ;Supelclean LC18 3 mL 固相萃取柱(美国 Supelco 公司) ;250 ×4. 6
mm i . d. 5 μm C18反相色谱柱(美国Microsorb公司) 。
乙腈、甲醇均为色谱纯;亚沸蒸馏水。
2. 3 实验方法
2. 3. 1 藻类样品的冷冻干燥 将培养数日后的藻类培养液在 4 ℃10 ,000 rP min 冷冻离心 30 min 后 ,收
集上清液 ,继续培养。离心后沉淀冷冻干燥至成干藻粉 ,置于干燥器中 ,保存在4 ℃条件下。
2. 3. 2 从干藻粉中释放藻类肝毒素 称取适量冷冻干燥后的干藻粉溶于10 mL 蒸馏水中 ,用超声波震
荡此悬浮液30 min ,然后在4 ℃10 ,000 rP min离心10 min ,取其上清液 ,将离心沉淀的细胞物质超声波震
第29卷
2001年12月 分析化学 (FENXI HUAXUE) 研究简报
Chinese Journal of Analytical Chemistry
第12期
1406～1408荡30 min ,在4 ℃10 ,000 rP min离心10 min ,如离心后沉淀仍未破碎完全 ,可重复上述步骤 ......
苑宝玲3
曲久辉 (中国科学院生态环境研究中心环境水化学国家重点实验室 ,北京 100085)
摘 要 采用固相萃取(SPE)和高效液相色谱法(HPLC)对蓝绿藻肝毒素进行富集与分离。以悦目颤藻为研
究对象 ,选择最佳方式破坏其细胞 ,使其释放出细胞内肝毒素 ,对肝毒素进行 SPE富集提取。用反相 HPLC技
术 ,以 C18柱作分离柱 ,32 %乙腈2水(含0. 01 molP L 乙酸铵)为流动相 ,达到了对藻类肝毒素的良好分离。
关键词 悦目颤藻 ,藻类肝毒素 ,固相萃取 ,高效液相色谱
2001201206收稿;2001207210接受
本文系国家自然科学基金(No. 20077031) 、中国科学院研究生科学与社会实践资助课题
1 引 言
随着环境污染的加剧及大量氮磷及有机污染物等营养物质排入受纳水体 ,世界各地的湖泊、池塘、河水中藻类尤其蓝绿藻水华日趋严重。在发生水华的藻中 ,有许多能产生毒素 ,如微囊藻、颤藻、丝状鱼
腥藻和囊丝藻等〔 1〕。这些蓝绿藻能产生肝毒素 ,根据其化学结构又分为微囊藻肝毒素(microcystin MC)
和节球藻毒素(nodularin)
〔 2〕。微囊藻肝毒素大部分存在于藻细胞内 ,当细胞破裂或衰老时毒素释放入水
中。MC能抑制肝细胞浆中蛋白磷酸酯酶2A或1的作用 ,人类饮用含MC的水 ,将在肝、肾、肺等器官积
累 ,最终导致肝溢血、肝癌等疾病〔 3〕。由于其在环境水中的含量甚低 ,很难准确地对它进行监测。因此 ,研究肝毒素的富集提取和分离具有重要意义。目前对藻类肝毒素的提取和分离分析研究最多的是铜绿
微囊藻〔 4 ,5〕,对颤藻的研究还较少 ,作者采用悦目颤藻( oscillatoria amoena)为研究对象 ,优化藻类肝毒素
的提取条件 ,并对其进行高效液相色谱分离 ,获得了满意结果。
2 实验部分
2. 1 藻种培养
悦目颤藻藻种购买于中国科学院武汉水生生物研究所。
悦目颤藻 SE培养基:NaNO3 25 mg ;CaCl2 2. 5 mg ;MgSO4· 7H2O 7. 5 mg ; K 2 HPO4 7. 5 mg ; KH2 PO4 1715
mg ;NaCl 2. 5 mg ;土壤浸出液4 mL ;Fe2EDTA 0. 4 mL ;FeCl3· 6H2O 0. 5 mg ;A5 0. 1 mL ;H2O 95. 8 mL。
A5 微量元素培养液:H3BO3 286 mg ;MnCl2· 4H2O 181 mg ;MnSO4· 7H2O 250 mg ; ZnSO4· 7H2O 22 mg ;
CuSO4· 5H2O 7. 4 mg ;Na2MoO4 2. 1 mg ;H2O 100 mL。
Fe2EDTA培养液:Na22EDTA 1 g ;FeCl3· 6H2O 81 mg ;HCl (0. 1 molP L) 50 mL。
2. 2 实验仪器与试剂
DC 41冷冻干燥机(美国 Yamato 公司) ;J22HS冷冻离心机(美国Beckman 公司) ;超声波(美国 Retsch
公司) ;Visiprep
TM
DL 多歧管固相萃取装置(美国 Supelco 公司) ; Pyrex 过滤器(美国 Millipore 公司) ;高效
液相色谱仪LC210AD(日本岛津公司) ;Supelclean LC18 3 mL 固相萃取柱(美国 Supelco 公司) ;250 ×4. 6
mm i . d. 5 μm C18反相色谱柱(美国Microsorb公司) 。
乙腈、甲醇均为色谱纯;亚沸蒸馏水。
2. 3 实验方法
2. 3. 1 藻类样品的冷冻干燥 将培养数日后的藻类培养液在 4 ℃10 ,000 rP min 冷冻离心 30 min 后 ,收
集上清液 ,继续培养。离心后沉淀冷冻干燥至成干藻粉 ,置于干燥器中 ,保存在4 ℃条件下。
2. 3. 2 从干藻粉中释放藻类肝毒素 称取适量冷冻干燥后的干藻粉溶于10 mL 蒸馏水中 ,用超声波震
荡此悬浮液30 min ,然后在4 ℃10 ,000 rP min离心10 min ,取其上清液 ,将离心沉淀的细胞物质超声波震
第29卷
2001年12月 分析化学 (FENXI HUAXUE) 研究简报
Chinese Journal of Analytical Chemistry
第12期
1406～1408荡30 min ,在4 ℃10 ,000 rP min离心10 min ,如离心后沉淀仍未破碎完全 ,可重复上述步骤 ......
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