亲和膜色谱法纯化人血浆纤溶酶原.PDF
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甘宏宇 商振华 秦国平 刘学良 王俊德
亲和膜色谱,人血浆,纤溶酶原,纯化
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参见附件(221KB，4页)。
亲和膜色谱法纯化人血浆纤溶酶原.PDF
亲和膜色谱法纯化人血浆纤溶酶原
甘宏宇 商振华 秦国平 刘学良3
王俊德
(中国科学院大连化学物理研究所 ,大连 116012)
摘 要 首次以尼龙膜为基质 ,分别采用三氯三嗪和 1 ,4 2丁二醇二缩水甘油醚活化法 ,制备了以 L2赖
氨酸为配基的亲和膜。首次使用亲和膜色谱法成功地从人血浆中快速纯化出了高纯度的纤溶酶原 ,电
泳分析显示一个主要的谱带。为规模化快速纯化临床用高纯度纤溶酶原提供了新方法。
关键词 亲和膜色谱 ,人血浆 ,纤溶酶原 ,纯化
2000209207收稿;2000212219接受
本文系国家自然科学基金资助项目(No. 20075031)
1 引 言
纤溶酶原(plasminogen)为糖蛋白 ,分子量是 81000～85000
〔 1～3〕,在正常人血浆中含量约 100～200
mgP L〔 4〕。纤溶酶原活化后可转变成具有活性的血纤维蛋白溶酶 ,能溶解血液的血纤维蛋白凝块(fibrin
clots)
〔 4〕,因此纤溶酶原是制备溶血栓药物的主要原料〔 5〕。纤溶酶原的纯化和测定对其临床研究及溶栓
疗法的监控具有重要意义〔 6 ,7〕。
Deutsch和Mertz1970年首先报道了利用 L2赖氨酸为配体 ,从人血浆中纯化纤溶酶原的结果 ,纯化倍
数为250 ,活性为10 CTAP 单位吸光度(尿激酶法测定)
〔 3〕。目前国内外纯化纤溶酶原一般采用 Sepharose2
4B介质。膜亲和法具有快速、收率高的特点 ,因此本实验选用价廉易得的平板尼龙膜为介质 ,分别采用
三氯三嗪(CyCl3 ) 、 1 ,4 2丁二醇二缩水甘油醚(BDE)活化法 ,偶联 L2赖氨酸配基制备亲和膜 ,首次用膜亲
和法从人血浆中纯化出纤溶酶原。
2 实验部分
2. 1 仪器与材料
Automated Econo System蛋白质制备仪(美国Bio2Rad公司) 。
尼龙6平板膜(江西庆江化工厂) ,人纤溶酶原标样(6～9 UP mg蛋白 ,Sigma 公司) ,L2赖氨酸(Lys , 层
析纯 ,上海康达氨基酸厂) ,62氨基己酸(99 % ,ACROS) ,人血浆(大连市中心血站) ,低分子量标准蛋白
(磷酸化酶B ,牛血清白蛋白(BSA) ,肌动蛋白 ,碳酸酐酶 ,烟草花叶病毒外壳蛋白)为中科院上海生化所
东风生化试剂厂产品;其余试剂均为国产分析纯。
亲和纯化缓冲液:上样缓冲液(平衡缓冲液) :0. 1 molP L pH 7. 4 磷酸盐23 mmolP L EDTA缓冲液;洗涤
液:0. 3 molP L pH 7. 4 磷酸盐23 mmolP L EDTA缓冲液;洗脱液: 0. 2 molP L 62氨基己酸溶于上样缓冲液中;
再生液:上样缓冲液中加入4 molP L 的脲。所有血浆样品均用上样缓冲液稀释 ,并用滤纸预过滤 ,所有盐
溶液均用二次蒸馏水配制并用0. 45μm水膜过滤。
2. 2 亲和介质的合成
2. 2. 1 CyCl3 法(编号为 NCHL1) 将 CyCl3 活化的并键合了己二胺的羟乙基纤维素(HEC)改性尼龙
膜〔 8 ,9〕浸入用碳酸盐调pH至9～10的Lys中 ,45℃下反应过夜 ,用茚三酮法测得配基数为35. 34 mgP g膜。
将膜水洗后浸入1 molP L 巯基乙醇中(pH 7. 0) ,45℃下反应4 h后室温放置过夜。大量水洗、干燥。
2. 2. 2 1 ,4 2丁二醇二缩水甘油醚法(编号为NBHL2) 参考 E. Klein 及Beeskow等的工作制备含 HEC
的尼龙膜〔 10～12〕。膜经BDE活化后浸入用0. 5 molP L Na2CO3 溶解的Lys中 ,于 75 ℃下反应 5 h ,室温放置
过夜 ,用大量水抽洗。以茚三酮法测得配基密度约为84. 2 mgP g膜 ,最后用0. 2 molP L 乙醇胺封闭24 h。
第29卷
2001年8月 分析化学 (FENXI HUAXUE) 研究报告
Chinese Journal of Analytical Chemistry
第8期
894～8972. 3 人血浆纤溶酶原的亲和纯化步骤
分别将直径47 mm的亲和膜片组装成膜堆 ,在蛋白质制备仪上进行亲和纯化。用上样缓冲液平衡
膜堆后将血浆样品上样 ,以洗涤缓冲液洗涤至基线平稳 ,然后用洗脱液洗脱 ,再生液再生 ,最后以平衡缓
冲液平衡膜堆。分别收集洗脱液和再生液 ,测定 280 nm的光密度( A280) ,以BSA 为标准计算脱附量。
将洗脱组分对0. 0625 molP L pH 6. 8缓冲液透析 ,做聚丙烯酰胺变性凝胶电泳(SDS 2PAGE)进行分析。
3 结果与讨论
3. 1 人血浆中纤溶酶原的纯化结果
图1为NCHL1和NBHL2亲和膜堆对人血浆纤溶酶原的纯化谱图 ,数据见表1。由图1可见 ,NBHL2
的洗脱峰面积大 ,再生洗脱峰面积小 ,二者峰面积之比是 0. 94∶ 1 ,而 NCHL1 的二者峰面积之比仅为
0. 19∶ 1。由表1可见 ,NBHL2的配基密度是NCHL1的2倍。这是因为Lys是亲水性的氨基酸 ,与含有亲
水性间隔臂的BDE之间作用力更强 ,因而键合配基数多 ,纯化效果好。由此可见活化方法与所键合的
配基类型密切相关。
图1 NCHL1(a)和NBHL2(b)亲和纯化人血浆纤溶酶原
Fig. 1 Affinity purification of plasminogen on NCHL1(a) and NBHL2(b) membrane stack
10×<47 mm膜堆(stack) ;样品( sample) :2. 5 mL 人血浆用平衡缓冲液稀释至 10 mL (2. 5 mL human plasma
diluted to 10 ml with equilibration buffer) ;A280 , ATT = 7 ;流速(flow rate) :1 mLP min ......
甘宏宇 商振华 秦国平 刘学良3
王俊德
(中国科学院大连化学物理研究所 ,大连 116012)
摘 要 首次以尼龙膜为基质 ,分别采用三氯三嗪和 1 ,4 2丁二醇二缩水甘油醚活化法 ,制备了以 L2赖
氨酸为配基的亲和膜。首次使用亲和膜色谱法成功地从人血浆中快速纯化出了高纯度的纤溶酶原 ,电
泳分析显示一个主要的谱带。为规模化快速纯化临床用高纯度纤溶酶原提供了新方法。
关键词 亲和膜色谱 ,人血浆 ,纤溶酶原 ,纯化
2000209207收稿;2000212219接受
本文系国家自然科学基金资助项目(No. 20075031)
1 引 言
纤溶酶原(plasminogen)为糖蛋白 ,分子量是 81000～85000
〔 1～3〕,在正常人血浆中含量约 100～200
mgP L〔 4〕。纤溶酶原活化后可转变成具有活性的血纤维蛋白溶酶 ,能溶解血液的血纤维蛋白凝块(fibrin
clots)
〔 4〕,因此纤溶酶原是制备溶血栓药物的主要原料〔 5〕。纤溶酶原的纯化和测定对其临床研究及溶栓
疗法的监控具有重要意义〔 6 ,7〕。
Deutsch和Mertz1970年首先报道了利用 L2赖氨酸为配体 ,从人血浆中纯化纤溶酶原的结果 ,纯化倍
数为250 ,活性为10 CTAP 单位吸光度(尿激酶法测定)
〔 3〕。目前国内外纯化纤溶酶原一般采用 Sepharose2
4B介质。膜亲和法具有快速、收率高的特点 ,因此本实验选用价廉易得的平板尼龙膜为介质 ,分别采用
三氯三嗪(CyCl3 ) 、 1 ,4 2丁二醇二缩水甘油醚(BDE)活化法 ,偶联 L2赖氨酸配基制备亲和膜 ,首次用膜亲
和法从人血浆中纯化出纤溶酶原。
2 实验部分
2. 1 仪器与材料
Automated Econo System蛋白质制备仪(美国Bio2Rad公司) 。
尼龙6平板膜(江西庆江化工厂) ,人纤溶酶原标样(6～9 UP mg蛋白 ,Sigma 公司) ,L2赖氨酸(Lys , 层
析纯 ,上海康达氨基酸厂) ,62氨基己酸(99 % ,ACROS) ,人血浆(大连市中心血站) ,低分子量标准蛋白
(磷酸化酶B ,牛血清白蛋白(BSA) ,肌动蛋白 ,碳酸酐酶 ,烟草花叶病毒外壳蛋白)为中科院上海生化所
东风生化试剂厂产品;其余试剂均为国产分析纯。
亲和纯化缓冲液:上样缓冲液(平衡缓冲液) :0. 1 molP L pH 7. 4 磷酸盐23 mmolP L EDTA缓冲液;洗涤
液:0. 3 molP L pH 7. 4 磷酸盐23 mmolP L EDTA缓冲液;洗脱液: 0. 2 molP L 62氨基己酸溶于上样缓冲液中;
再生液:上样缓冲液中加入4 molP L 的脲。所有血浆样品均用上样缓冲液稀释 ,并用滤纸预过滤 ,所有盐
溶液均用二次蒸馏水配制并用0. 45μm水膜过滤。
2. 2 亲和介质的合成
2. 2. 1 CyCl3 法(编号为 NCHL1) 将 CyCl3 活化的并键合了己二胺的羟乙基纤维素(HEC)改性尼龙
膜〔 8 ,9〕浸入用碳酸盐调pH至9～10的Lys中 ,45℃下反应过夜 ,用茚三酮法测得配基数为35. 34 mgP g膜。
将膜水洗后浸入1 molP L 巯基乙醇中(pH 7. 0) ,45℃下反应4 h后室温放置过夜。大量水洗、干燥。
2. 2. 2 1 ,4 2丁二醇二缩水甘油醚法(编号为NBHL2) 参考 E. Klein 及Beeskow等的工作制备含 HEC
的尼龙膜〔 10～12〕。膜经BDE活化后浸入用0. 5 molP L Na2CO3 溶解的Lys中 ,于 75 ℃下反应 5 h ,室温放置
过夜 ,用大量水抽洗。以茚三酮法测得配基密度约为84. 2 mgP g膜 ,最后用0. 2 molP L 乙醇胺封闭24 h。
第29卷
2001年8月 分析化学 (FENXI HUAXUE) 研究报告
Chinese Journal of Analytical Chemistry
第8期
894～8972. 3 人血浆纤溶酶原的亲和纯化步骤
分别将直径47 mm的亲和膜片组装成膜堆 ,在蛋白质制备仪上进行亲和纯化。用上样缓冲液平衡
膜堆后将血浆样品上样 ,以洗涤缓冲液洗涤至基线平稳 ,然后用洗脱液洗脱 ,再生液再生 ,最后以平衡缓
冲液平衡膜堆。分别收集洗脱液和再生液 ,测定 280 nm的光密度( A280) ,以BSA 为标准计算脱附量。
将洗脱组分对0. 0625 molP L pH 6. 8缓冲液透析 ,做聚丙烯酰胺变性凝胶电泳(SDS 2PAGE)进行分析。
3 结果与讨论
3. 1 人血浆中纤溶酶原的纯化结果
图1为NCHL1和NBHL2亲和膜堆对人血浆纤溶酶原的纯化谱图 ,数据见表1。由图1可见 ,NBHL2
的洗脱峰面积大 ,再生洗脱峰面积小 ,二者峰面积之比是 0. 94∶ 1 ,而 NCHL1 的二者峰面积之比仅为
0. 19∶ 1。由表1可见 ,NBHL2的配基密度是NCHL1的2倍。这是因为Lys是亲水性的氨基酸 ,与含有亲
水性间隔臂的BDE之间作用力更强 ,因而键合配基数多 ,纯化效果好。由此可见活化方法与所键合的
配基类型密切相关。
图1 NCHL1(a)和NBHL2(b)亲和纯化人血浆纤溶酶原
Fig. 1 Affinity purification of plasminogen on NCHL1(a) and NBHL2(b) membrane stack
10×<47 mm膜堆(stack) ;样品( sample) :2. 5 mL 人血浆用平衡缓冲液稀释至 10 mL (2. 5 mL human plasma
diluted to 10 ml with equilibration buffer) ;A280 , ATT = 7 ;流速(flow rate) :1 mLP min ......
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