衍生化毛细管气相色谱法分析血清中的游离脂肪酸

    谢孟峡3

    刘 媛 康 娟

    (北京师范大学分析测试中心 ,北京 100875)

    李 莹 郭 敏 吕 敏 (中国医学科学院 ,中国协和医科大学 ,心血管病研究所 ,阜外心血管病医院 ,北京100037)

    摘 要 用 H2 SO4P 甲醇对血清中游离脂肪酸进行甲酯化反应 ,考察了不同温度和时间以及不同的衍生条件

    对甲酯化完全程度的影响 ,确定了对血清中游离脂肪酸衍生化完全的条件为:在62℃下用10 % H2SO4P 甲醇溶

    液衍生化2 h。大部分脂肪酸的衍生反应和色谱分析的相对标准偏差都在3. 00 %以内。用各脂肪酸和内标色

    谱峰面积的比值对脂肪酸浓度作标准曲线 ,线性回归系数在 0. 999～1 之间 ,定量测定了 5 个不同地区的 250

    个血清样品中12种游离脂肪酸的含量。

    关键词 游离脂肪酸 ,衍生化 ,毛细管气相色谱 ,血清

    2001202201收稿;2001208220接受

    1 引 言

    血清中游离脂肪酸的定量测定对许多疾病的病理机制研究具有重要意义。血清中游离脂肪酸的常

    用测定方法是对脂肪酸进行甲酯化后用气相色谱分离和定量分析。近年来 ,国内外学者对不同的测定

    方法多有报道 ,如用BF3P 甲醇溶液〔 1 ,2〕,盐酸P 甲醇溶液〔 3 ,4〕等方法 ,但测定血清中的游离脂肪酸一般常用

    硫酸P 甲醇溶液〔 5～7〕。所用硫酸的量、甲酯化的温度及时间都将对测定结果产生影响。文献〔 4〕报道用硫

    酸P 甲醇溶液的酯化温度远高出甲醇的沸点 ,给操作带来很大不便。文献〔 5〕用硫酸P 甲醇在 56 ℃下对血

    清进行甲酯化30 min ,经我们的实验研究发现在此条件下不能够使游离脂肪酸完全甲酯化。作者通过

    实验考察 ,确定了使甲酯化反应完全的衍生化条件 ,并用标准曲线的定量方法对5个不同地区采集到的

    250个血清样品中的12种游离脂肪酸进行了气相色谱分析。

    2 实验部分

    2. 1 仪器与试剂

    HP5890A气相色谱仪(美国惠普公司) ,FID检测器 ,3392A数据处理仪;色谱柱:BP21 毛细管柱 25 m

    × 0. 22 mm I.D. (SGE) ;载气:高纯N2 ,柱头压:132 kPa ,进样量:1μ L ,分流比:1∶ 100 ,进样口温度:250 ℃,检测器温度:280 ℃,温度梯度:190 ℃(11 min)

    1℃ P min升温 210 ℃(30 min) 。

    浓 H2SO4 (优级纯 ,北京化工厂) ,甲醇(色谱纯 ,Fisher Scientific 公司 ,HONG KONG) ,BF3 乙醚溶液

    (分析纯 ,北京长阳化工厂) 。正己烷(分析纯 ,北京益利精细化学品有限公司) 。脂肪酸标准品(Sigma 公

    司) :豆蔻酸(myristic acid ,MYA) ; 软脂酸(palmitic acid , PTA) ;十六碳单烯酸(palmitoleic acid , PEA) ;硬脂

    酸(stearic acid ,STA) ; 油酸(oleic acid ,OLA) ; 亚油酸( linoleic acid ,LLA) ;十八碳三烯酸( linolenic acid ,LNA) ;γ 2十八碳三烯酸(γ 2linolenic acid , γ 2 LNA) ;二十碳二烯酸(cis211 ,142eicosadienoic acid ( EDA) ; 花生

    四烯酸(arachidonic acid ,ADA) ;二十碳五烯酸(cis25 ,8 ,11 ,14 ,172eicosapenaenoic acid , EPA) ;二十二碳六

    烯酸(cis24 ,7 ,10 ,13 ,16 ,192docosahexaenoic acid , DHA) ,标准品的纯度都在98 %以上。

    称取51. 9 mg正十七碳脂肪酸(纯度 98. 6 % ,Sigma 公司) ,用甲醇定容于 250 mL 容量瓶中 ,作为内

    标溶液。

    在甲醇中加入2. 5 mL 浓 H2 SO4 ,定容至25 mL ,得10 % H2 SO4P 甲醇溶液。在甲醇中加入 1. 5 mL 浓

    第29卷

    2001年12月 分析化学 (FENXI HUAXUE) 研究报告

    Chinese Journal of Analytical Chemistry

    第12期

    1389～1393H2SO4 ,定容至25 mL ,得6 % H2SO4P 甲醇溶液。

    2. 2 样品处理

    2. 2. 1 血清采样 质控血清(摸索甲酯化条件)用北京地区冰冻血清 ,待测血清来自 5 个不同地区的冰

    冻血清 ,在 - 20 ℃以下冷冻保存待用。

    2. 2. 2 衍生化步骤 取血清样品0. 6 mL 于10 mL 的试管中 ,加入 0. 5 mL 内标溶液 ,混合均匀 ,加入 2

    mL H2 SO4P 甲醇溶液 ,用玻璃棒搅匀 ,充N2 后密封。将上述样品在一定的温度下衍生一定时间 ,在衍生

    过程中不断震荡试管。衍生结束后冷却至室温 ,在试管中加入2. 5 mL 正己烷和2 mL 饱和食盐水溶液 ,充分震荡、静置30 min ,待分层后取上清液 ,用N2 吹至0. 1 mL 左右 ,待色谱分析。

    2. 2. 3 各种甲酯化方法 方法1 ,加入10 % H2SO4 甲醇( VP V)溶液;方法2 ,加入6 % H2 SO4 甲醇( VP V)

    溶液;方法3 ,加入2 mL 甲醇及50 % H2 SO4 溶液0. 5 mL ;方法4 ,加入2 mL 甲醇及2 mL BF3 乙醚溶液 ,在

    50 ℃下衍生10 min ,其它步骤同上。

    2. 3 血清中游离脂肪酸的定量分析

    由于血清样品从衍生化到气相色谱分析要经过多个处理步骤,每一步的体积都很难控制 ,所以在用

    标准曲线定量时采用加入内标的方法对整个处理步骤进行校正。

    2. 3. 1 标准溶液的配置 根据血清样品中 12 种游离脂肪酸的大致含量范围 ,各称量一定量的标准样

    品配置一系列的浓度。取不同浓度的标准溶液加入0. 5 mL 的内标溶液 ,在和血清样品衍生化同样的条

    件下对标准样品进行衍生化处理和气相色谱分析。

    2. 3. 2 血清中游离脂肪酸的定量测定 取0. 6 mL 血清样品加入0. 5 mL 内标溶液 ,在优化的条件下进

    行衍生化处理及色谱分析。根据各游离脂肪酸和内标色谱峰面积的比值 ,从标准曲线的线性回归方程

    求得其含量。

    3 结果与讨论

    3. 1 对脂肪酸甲酯的气相色谱分离

    采用程序升温的方法在极性柱上对甲酯化的脂肪酸进行色谱分离(见图1) 。

    图1 血清中游离脂肪酸甲酯的色谱图

    Fig. 1 The chromatograph for separation of methyl 2ester of free fatty acid in

    human serum

    1. MYA;2. PTA;3. PEA;4.内标(internal standard) ;5. STA;6. OLA;7. LLA;8.

    LNA;9.γ 2 LNA;10. EDA;11. ADA;12. EPA;13. DHA。

    从色谱图上看 ,在选定的色谱条件

    下 ,12 种脂肪酸甲酯得到了完全的分

    离。用标准样品对照 ,12 种脂肪酸的指

    认如图所示。经气相色谱2质谱对血清

    样品中游离脂肪酸的结构进行确认 ,和

    标准品对照的结果完全一致。

    3. 2 分析方法的重现性

    12种脂肪酸甲酯化后 6 次气相色

    谱分析 ,脂肪酸甲酯的色谱峰面积与内

    标峰面积(正十七碳酸) 的比值的相对

    标准偏差大部分都小于 3. 00 %(仅有含

    量很低的LNA为4108 %) ......